本申請要求2014年10月1日提交的美國臨時申請?zhí)?2/058,304的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請以引用方式并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含抗原和IL-21的疫苗以及施用所述疫苗的方法。

背景技術(shù)：

疫苗用于刺激個體的免疫應(yīng)答，以提供針對特定疾病的保護和/或?qū)μ囟膊〉闹委?。一些疫苗包含誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原。一些抗原引起強免疫應(yīng)答，而其他抗原引起弱免疫應(yīng)答。通過在疫苗中包含佐劑可以加強對抗原的弱免疫應(yīng)答。佐劑以很多不同形式出現(xiàn)，例如鋁鹽、油乳劑、細菌或其他病原體的無菌成分、細胞因子等。

細胞因子是由影響其他細胞行為的細胞形成的蛋白質(zhì)，并且與很多佐劑不同的是它們可以調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答。一種所述細胞因子是白細胞介素-21(IL-21)，其對淋巴和骨髓群體以及上皮細胞施加作用，調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。已顯示IL-21有助于幾種CD4+T細胞亞群的功能性分化，以促進CD8+T細胞的增殖和功能應(yīng)答，并在B細胞免疫球蛋白應(yīng)答的發(fā)展中發(fā)揮作用。IL-21由CD8+T細胞群體以及CD4+T細胞群體(包括濾泡輔助T(TFH)細胞、17型輔助T(Th17)細胞和天然殺傷T(NKT)細胞)產(chǎn)生。

還以許多不同方式(例如，注射、口服等)將疫苗施用到許多不同的組織(例如，肌內(nèi)、皮內(nèi)等)中。然而，并非所有的遞送方法都是等效的。一些遞送方法允許在個體群體內(nèi)的更大順從性，而其他遞送方法可影響疫苗的免疫原性和/或安全性。因此，在本領(lǐng)域中仍然需要開發(fā)安全的和更有效的佐劑，所述佐劑增加抗原應(yīng)答而與抗原的身份(identity)和施用途徑無關(guān)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及包含抗原和IL-21的疫苗。IL-21可由選自由以下組成的組的核苷酸序列編碼：與如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列具有至少約95％同一性的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列。IL-21可由如SEQ ID NO:3所列出的核苷酸序列編碼。

抗原可由第一核酸編碼，并且IL-21可由第二核酸編碼。第二核酸還可包含表達載體。疫苗還可包含與以上抗原具有相同編碼核酸序列的抗原肽，以及與以上IL-21具有相同編碼核酸序列的IL-21肽。

抗原可選自由以下組成的組：人乳頭瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、流感抗原、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)抗原、艱難梭菌(C.difficle)抗原以及其片段。HPV抗原可選自由以下組成的組：HPV16E6抗原、HPV16E7抗原以及其組合。HIV抗原可選自由以下組成的組：Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何組合。流感抗原可選自由以下組成的組：H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原以及其任何組合。惡性瘧原蟲抗原可以包括環(huán)子孢子(CS)抗原。艱難梭菌抗原可選自由以下組成的組：毒素A、毒素B以及其組合。

疫苗可還包含藥學上可接受的賦形劑。

本發(fā)明還涉及用于增加有需要的受試者中的免疫應(yīng)答的方法。所述方法可包括施用包含抗原和IL-21的疫苗。IL-21可由選自由以下組成的組的核苷酸序列編碼：與如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列具有至少約95％同一性的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列。IL-21可由如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列編碼。

施用疫苗可包括電穿孔。增加受試者中的免疫應(yīng)答可包括增加受試者中的細胞免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答或細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答兩者。

本發(fā)明還涉及包含選自由以下組成的組的一種或多種核苷酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:3，以及與SEQ ID NO:3 95％或更大相同的核苷酸序列。核酸分子可以是質(zhì)粒。

附圖說明

圖1示出質(zhì)粒pVAX-mIL-21Opt的圖，所述質(zhì)粒包含編碼小鼠IL-21的優(yōu)化核酸。

圖2示出IL-21在來自轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞的上清液中的表達。

圖3示出使用B細胞ELISpot測定通過肌內(nèi)途徑用編碼來自艱難梭菌的毒素A和毒素B抗原的質(zhì)粒免疫的小鼠中的體液免疫應(yīng)答。

圖4示出使用ELISA測定通過肌內(nèi)途徑免疫的小鼠中的體液免疫應(yīng)答。

圖5示出使用干擾素γELISpot測定通過肌內(nèi)途徑用編碼來自HIV的EnvA和EnvC抗原的質(zhì)粒免疫的小鼠中的細胞免疫應(yīng)答。

圖6示出使用ELISA測定通過肌內(nèi)途徑用編碼來自HIV的EnvA和EnvC抗原的質(zhì)粒免疫的小鼠中的體液免疫應(yīng)答。

具體實施方式

本發(fā)明涉及疫苗，所述疫苗可以通過使用IL-21作為佐劑來用于增加受試者的對抗原的免疫應(yīng)答。IL-21為單鏈、T細胞來源的細胞因子。

在一些情況下，IL-21可以用作通用的佐劑，因為與包含單獨抗原的疫苗相比，在受試者中引發(fā)較高的免疫應(yīng)答。IL-21還可以增加病毒抗原和細菌抗原的免疫應(yīng)答，所述病毒抗原和細菌抗原分別例如HIV抗原和艱難梭菌抗原。IL-21還可與抗原呈DNA/肽組合形式，所述形式是相對于單獨用抗原的DNA或肽免疫應(yīng)答更大的核酸/肽組合。在一些情況下，如通過增加的干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生所證明，IL-21還可以增加肌肉組織和皮膚組織中的免疫應(yīng)答。

1.定義

除非另外定義，否則本文所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語都具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。當發(fā)生沖突時，以本文件(包括定義)為準。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可以使用與本文所描述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料，但以下描述了優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有公布、專利申請、專利以及其他參考文獻以其全文以引用的方式并入本文。本文公開的材料、方法和實施例僅是示例性的，并不意圖為限制性的。

如本文所用，術(shù)語“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其變化形式意圖是不排除另外行為或結(jié)構(gòu)的可能性的開放式連接詞、術(shù)語、或詞語。除非上下文另外清楚地說明，否則單數(shù)形式“一個/種(a)”、“一個/種(an)”以及“所述(the)”包括復(fù)數(shù)引用。本公開還涵蓋“包括本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素”、“由本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素組成”以及“主要由本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素組成”的其他實施方案，無論是否明確地提出。

如本文所用的“佐劑”意指添加至本文所描述的疫苗中以增強抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“編碼序列”或“編碼核酸”意指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述編碼序列可以進一步包括可操作地連接至調(diào)控元件的起始信號和終止信號，所述調(diào)控元件包括能夠在施用核酸的個體或哺乳動物的細胞中指導(dǎo)表達的啟動子和多聚腺苷酸化信號。

如本文所用的“互補序列”或“互補的”意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對。

如本文可互換使用的“電穿孔”、“電-透化作用”或“電動增強”(“EP”)意指使用跨膜電場脈沖來誘導(dǎo)在生物膜中的微觀途徑(孔隙)；它們的存在允許生物分子如質(zhì)粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子以及水從細胞膜的一側(cè)流動到另一側(cè)。

如本文所用的“片段”或“免疫原性片段”意指編碼能夠在哺乳動物中引發(fā)和/或增加免疫應(yīng)答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是選自編碼下文所述的蛋白質(zhì)片段的各種核苷酸序列的至少一種的DNA片段。片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的一種或多種以下所列出的核酸序列。在一些實施方案中，片段可以包含以下所列出的核酸序列中的至少一種的至少20個核苷酸或更多、至少30個核苷酸或更多、至少40個核苷酸或更多、至少50個核苷酸或更多、至少60個核苷酸或更多、至少70個核苷酸或更多、至少80個核苷酸或更多、至少90個核苷酸或更多、至少100個核苷酸或更多、至少150個核苷酸或更多、至少200個核苷酸或更多、至少250個核苷酸或更多、至少300個核苷酸或更多、至少350個核苷酸或更多、至少400個核苷酸或更多、至少450個核苷酸或更多、至少500個核苷酸或更多、至少550個核苷酸或更多、至少600個核苷酸或更多、至少650個核苷酸或更多、至少700個核苷酸或更多、至少750個核苷酸或更多、至少800個核苷酸或更多、至少850個核苷酸或更多、至少900個核苷酸或更多、至少950個核苷酸或更多或至少1000個核苷酸或更多。

如本文所用的片段或免疫原性片段還意指能夠在哺乳動物中引發(fā)和/或增加免疫應(yīng)答的多肽序列或其部分。片段可以是選自以下所列出的各種氨基酸序列中的至少一種的多肽片段。片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的一種或多種以下所列出的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，片段可以包含以下所列出的蛋白質(zhì)中的至少一種的至少20個氨基酸或更多、至少30個氨基酸或更多、至少40個氨基酸或更多、至少50個氨基酸或更多、至少60個氨基酸或更多、至少70個氨基酸或更多、至少80個氨基酸或更多、至少90個氨基酸或更多、至少100個氨基酸或更多、至少110個氨基酸或更多、至少120個氨基酸或更多、至少130個氨基酸或更多、至少140個氨基酸或更多、至少150個氨基酸或更多、至少160個氨基酸或更多、至少170個氨基酸或更多、至少180個氨基酸或更多、至少190個氨基酸或更多、至少200個氨基酸或更多、至少210個氨基酸或更多、至少220個氨基酸或更多、至少230個氨基酸或更多或至少240個氨基酸或更多。

如本文所用的“基因構(gòu)建體”或“構(gòu)建體”是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述編碼序列包含可操作地連接至調(diào)控元件的起始信號和終止信號，所述調(diào)控元件包括能夠在施用核酸分子的個體的細胞中指導(dǎo)表達的啟動子和多聚腺苷酸化信號。如本文所用，術(shù)語“可表達的形式”是指含有必要調(diào)控元件的基因構(gòu)建體或構(gòu)建體，所述必要調(diào)控元件可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的編碼序列，使得當所述基因構(gòu)建體存在于個體的細胞中時，編碼序列將被表達。

如本文在兩種或更多種核酸或多肽序列的背景下所使用的術(shù)語“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定區(qū)上相同的殘基?？梢酝ㄟ^以下來計算所述百分比：最佳地比對兩個序列、在指定區(qū)域比較兩個序列、確定在兩個序列中相同的殘基的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量、以匹配位置的數(shù)量除以在指定區(qū)域內(nèi)的位置的總數(shù)量，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。在兩個序列具有不同長度或比對產(chǎn)生一個或多個交錯末端并且比較的指定區(qū)僅包含單個序列的情況下，單個序列的殘基包括于計算的分母而不是分子中。當比較DNA和RNA時，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被認為是等同的。同一性可以手動地或者通過使用計算機序列算法如BLAST或者BLAST 2.0來執(zhí)行。

如本文所用的“免疫應(yīng)答”意指響應(yīng)于抗原的引入而產(chǎn)生的宿主的免疫系統(tǒng)(例如，哺乳動物的免疫系統(tǒng))的活化。免疫應(yīng)答可以呈細胞應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答或兩者兼有的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。單鏈的描述還定義了互補鏈的序列。因此，核酸還涵蓋了所描述的單鏈的互補鏈。核酸的很多變體可以被用于與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還涵蓋了基本上相同的核酸和其互補體。單鏈提供可以在嚴格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還涵蓋了在嚴格雜交條件下雜交的探針。

核酸可以是單鏈的或者雙鏈的或可以含有雙鏈或者單鏈序列兩者的部分。所述核酸可以是DNA、基因組和cDNA兩者、RNA或雜合體，其中所述核酸可以含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌啉、肌苷、黃嘌呤次黃嘌呤、異胞嘧啶以及異鳥嘌呤的堿基的組合。核酸可以通過化學合成方法或者通過重組方法來獲得。

如本文所用的“可操作地連接”意指基因的表達是在空間上與之連接的啟動子的控制下進行的。在其控制下，啟動子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。啟動子與基因之間的距離可以與所述啟動子與啟動子的來源基因之間的距離大約相同。如本領(lǐng)域所已知，這個距離的變化可以在沒有失去啟動子功能的情況下進行調(diào)整。

如本文所用的“肽”、“蛋白質(zhì)”或“多肽”可以意指氨基酸的連接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然與合成的修飾或組合。

如本文所用的“啟動子”意指合成的或自然來源的分子，所述分子能夠賦予、活化或增強細胞中的核酸的表達。啟動子可包含一個或多個特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以便進一步增強表達和/或改變其空間的表達和/或時間的表達。啟動子還可以包含遠端增強子或阻遏元件，它們可以位于從轉(zhuǎn)錄的起始點開始的差不多幾千對堿基對處。啟動子可以從包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲以及動物的來源中獲得。啟動子可以調(diào)控基因組分相對于其中發(fā)生表達的細胞、組織或器官或相對于發(fā)生表達所處的發(fā)育階段或響應(yīng)于外部刺激(如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)劑)而組成型地或差異性地表達。啟動子的代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、乳糖操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40后期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或者SV40后期啟動子以及CMV IE啟動子。

“信號肽”和“前導(dǎo)序列”在本文可互換使用，并且是指可以連接在本文所列出的蛋白或氨基酸序列的氨基末端的氨基酸序列。信號肽/前導(dǎo)序列通常指示蛋白質(zhì)的位置。本文所用的信號肽/前導(dǎo)序列優(yōu)選地促進蛋白質(zhì)從產(chǎn)生其的細胞中分泌。信號肽/前導(dǎo)序列常常從蛋白質(zhì)的剩余部分裂解，所述蛋白質(zhì)在從細胞分泌后經(jīng)常被稱為成熟蛋白質(zhì)。信號肽/前導(dǎo)序列連接在蛋白質(zhì)的氨基末端。

如本文所用的“受試者”可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗進行免疫的哺乳動物。哺乳動物可以是人、黑猩猩、狗、貓、馬、牛、小鼠或大鼠。

如本文所用的“嚴格雜交條件”可意指在其下第一核酸序列(例如，探針)將與第二核酸序列(例如，靶標)如在核酸的復(fù)雜混合物中雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的并且在不同情況下有所不同。嚴格條件可經(jīng)選擇比限定離子強度pH下特定序列的熱熔點(T_m)低約5-10℃。T_m可以是在所述溫度下處于平衡時50％互補于靶標的探針雜交于靶標序列(因為靶標序列過量存在，所以在T_m下，在平衡時50％的探針被占據(jù))的溫度(在限定的離子強度、pH以及核酸濃度下)。嚴格條件可以是這樣的條件，其中在pH 7.0至8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子，如約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)并且溫度為至少約30℃(對于短探針，例如約10-50個核苷酸)和至少約60℃(對于長探針，例如大于約50個核苷酸)。還可以通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實現(xiàn)嚴格條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可為背景雜交的至少2至10倍。示例性嚴格雜交條件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗滌。

如本文所用的“基本上互補”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核苷酸的區(qū)域上與第二序列的互補序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者意指兩個序列在嚴格雜交條件下進行雜交。

如本文所用的“大致上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個氨基酸的區(qū)域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。大致上相同的還可以意指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個核苷酸的區(qū)域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文所用的“治療(Treatment)”或“治療(Treating)”可以意指通過預(yù)防、抑制、阻遏的手段保護動物免于疾病或完全消除疾病。預(yù)防疾病涉及在疾病發(fā)作之前向動物施用本發(fā)明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病誘發(fā)之后但在其臨床出現(xiàn)之前向動物施用本發(fā)明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的臨床出現(xiàn)之后向動物施用本發(fā)明的疫苗。

如關(guān)于核酸在本文中使用的“變體”意指(i)參考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)參考核苷酸序列或其部分的互補序列；(iii)與參考核酸或其互補序列大致相同的核酸；或(iv)在嚴格條件下與參考核酸、其互補序列或與其大致相同的序列雜交的核酸。

變體可以進一步定義為通過氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一種生物活性的肽或多肽?！吧锘钚浴钡拇硇詫嵗ū惶禺愋钥贵w結(jié)合或促進免疫應(yīng)答的能力。變體還意指具有與參考蛋白質(zhì)基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述參考蛋白質(zhì)具有保留至少一種生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，親水性、帶電區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸來替換氨基酸，在本領(lǐng)域中被認為通常涉及微小變化。這些微小變化可部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù)來鑒定，如本領(lǐng)域中所理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。所述氨基酸的親疏水性指數(shù)是基于其疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知的是相似的親疏水性指數(shù)的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白質(zhì)功能。在一個方面，親疏水性指數(shù)為±2的氨基酸被取代。氨基酸的親水性還可以被用來揭示會產(chǎn)生保留生物功能的蛋白質(zhì)的取代。在肽的情形下考慮氨基酸的親水性允許計算所述肽最大的局部平均親水性，這是已經(jīng)被報道來與抗原性和免疫原性良好關(guān)聯(lián)的有用測量。如本領(lǐng)域中所理解，用親水性值相似的氨基酸進行取代可產(chǎn)生保留生物活性(例如免疫原性)的肽?？捎糜H水性值處在±2范圍內(nèi)的氨基酸進行取代。氨基酸的親疏水性指數(shù)和親水性值兩者都受所述氨基酸的特定側(cè)鏈影響。與所述觀察一致的是，與生物功能相容的氨基酸取代被理解為取決于這些氨基酸相對的相似性，并且特別是那些氨基酸的側(cè)鏈，如通過疏水性、親水性、電荷、大小以及其他特性所揭示的。

變體可以是在全基因序列或其片段的全長上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全長上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。變體可以是在氨基酸序列或其片段的全長上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全長上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同

如本文所用的“載體”意指含有復(fù)制起點的核酸序列。載體可以是病毒載體、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自我復(fù)制的染色體外載體，并優(yōu)選地是DNA質(zhì)粒。載體可以含有或包括一個或多個異源核酸序列。

對于本文數(shù)值范圍的敘述來說，明確地涵蓋具有相同精確度的介于其間的每個中間數(shù)字。例如，對于6-9的范圍來說，除6和9之外，還涵蓋數(shù)字7和8，并且對于范圍6.0-7.0來說，明確地涵蓋數(shù)字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.疫苗

本文提供包含抗原和佐劑的疫苗。疫苗可以在受試者中增加抗原呈遞和對抗原的總免疫應(yīng)答?？乖妥魟┑慕M合比僅包含抗原的疫苗更有效地誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)。當施用于不同組織(如肌肉和皮膚)時，疫苗可以進一步誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，如為安全的，以使得疫苗本身不會引起疾病或死亡；保護免受由暴露于活的病原體(如病毒或細菌)引起的疾?。徽T導(dǎo)中和抗體來預(yù)防細胞的感染；誘導(dǎo)針對細胞內(nèi)病原體的保護性T細胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物穩(wěn)定性以及每劑量的低成本。通過如以下所論述組合抗原和佐劑，疫苗可實現(xiàn)這些特征中的一些或全部。

a.佐劑

疫苗可以包含如下論述的佐劑和抗原。佐劑可以是核酸序列、氨基酸序列或其組合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其變體、其片段或其組合。核酸序列還可以包含編碼通過肽鍵連接至佐劑的接頭序列或標簽序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白質(zhì)、肽、其變體、其片段或其組合。

(1)IL-21

佐劑可以是白細胞介素-21(IL-21)。IL-21是對包括自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T細胞(CD8+T細胞)的B和T細胞亞群具有強效作用的單鏈、T細胞來源的細胞因子。慢性感染的動物模型表明IL-21在T細胞活性和病毒復(fù)制控制中以及在患有慢性病毒感染如HIV的患者中的關(guān)鍵作用。已經(jīng)報道IL-21關(guān)鍵性地改善細胞毒性CD8T細胞應(yīng)答。還已經(jīng)表明IL-21幫助B細胞增殖和分化。

類似于IL-12，IL-21可以刺激IFN-γ產(chǎn)生。IL-12可以活化初始T細胞以誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，而IL-21可以作用于記憶T細胞以誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生。與不包含IL-21的疫苗相比，在疫苗中包含IL-21可以至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約8倍以及至少約10倍地誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。與不包含IL-23的疫苗相比，在疫苗中包含IL-21可以至少約2倍地誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。與不包含IL-21的疫苗相比，在疫苗中包含IL-21可以至少約3倍地誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。

IL-21可以增加或增強受試者的對抗原的免疫應(yīng)答。在以下更詳細地描述抗原。在一些情況下，IL-21可以使對抗原的免疫應(yīng)答增加約75％至約200％?；蛘撸琁L-21可以使對抗原的免疫應(yīng)答增加約90％至約130％。在另一些可替代實施方案中，IL-21可以使對抗原的免疫應(yīng)答增加約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％，112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％或130％。

在其他實施方案中，當對有需要的受試者施用本文所述的疫苗時，IL-21可以使對抗原的免疫應(yīng)答增加或加強至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。

編碼IL-21的核酸可來自任何數(shù)量的生物體，例如，小鼠(小家鼠(Mus musculus))和人(智人(Homo sapiens))。可以關(guān)于密碼子使用和對應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物對編碼IL-21的核酸進行優(yōu)化?？梢葬槍Ρ磉_對編碼IL-21的核酸進行密碼子和RNA優(yōu)化。在一些實施方案中，編碼IL-21的核酸可包含Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻譯的效率。編碼IL-21的核酸可包含多個終止密碼子(例如，TGA TGA)以提高翻譯終止的效率。編碼IL-21的核酸還可包括編碼IgE前導(dǎo)序列的核苷酸序列。IgE前導(dǎo)序列在核酸中可以位于IL-21的5’。在一些實施方案中，編碼IL-21的核酸不含或不含有編碼IgE前導(dǎo)序列的核苷酸序列。在其他實施方案中，編碼IL-21的核酸可包括編碼HA標簽的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。在另一些實施方案中，編碼IL-21的核酸不含或不含有編碼HA標簽的核苷酸序列。

小鼠IL-21可以是優(yōu)化的核酸序列SEQ ID NO：1，其編碼SEQ ID NO:2。在一些實施方案中，小鼠IL-21可以是在SEQ ID NO:1中所列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他實施方案中，小鼠IL-21可以是編碼在SEQ ID NO:2中所列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠IL-21可以是在SEQ ID NO:2中所列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

人IL-21可以是優(yōu)化的核酸序列SEQ ID NO:3，其編碼SEQ ID NO:4。在一些實施方案中，人IL-21可以是在SEQ ID NO:3中所列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他實施方案中，人IL-21可以是編碼在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。人IL-21可以是在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

一些實施方案涉及SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3。在一些實施方案中，片段可以包括編碼前導(dǎo)序列的序列，所述前導(dǎo)序列例如免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如IgE前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，片段不含編碼前導(dǎo)序列的編碼序列。

可提供具有與SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的與SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3具有95％或更大同一性的核酸。一些實施方案涉及與本文的IL-21核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些實施方案涉及與本文的IL-21核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些實施方案涉及與本文的IL-21核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些實施方案涉及與本文的IL-21核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些實施方案中，片段包括編碼前導(dǎo)序列的序列，所述前導(dǎo)序列例如免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如IgE前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，片段不含編碼前導(dǎo)序列的編碼序列。

可提供SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4。在一些實施方案中，片段包含前導(dǎo)序列，例如，免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如IgE前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，片段不含前導(dǎo)序列。

可提供具有與SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的與SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4具有95％或更大同一性的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及與本文的IL-21蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些實施方案涉及與本文的IL-21蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些實施方案涉及與本文的IL-21蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些實施方案涉及與本文的IL-21蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些實施方案中，片段包含前導(dǎo)序列，例如，免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如IgE前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，片段不含前導(dǎo)序列。

b.抗原

疫苗可以包含如以上所論述的抗原或其片段或變體和佐劑?？乖梢允窃谑茉囌咧姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。純化的抗原通常其自身不是強免疫原性的，并且因此如上所述與佐劑組合。當與佐劑組合時可以加強或增加由抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，佐劑和抗原的組合可以加強或增加受試者的細胞免疫應(yīng)答。在其他實施方案中，佐劑和抗原的組合可以增強或增加受試者的體液免疫應(yīng)答。

抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其組合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其變體、其片段或其組合。核酸序列還可以包含編碼通過肽鍵連接至抗原的接頭序列或標簽序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白質(zhì)、肽、其變體、其片段或其組合。

抗原可以含于來自任何數(shù)量的有機體(例如，病毒、寄生蟲、細菌、真菌或哺乳動物)的蛋白質(zhì)、核酸，或其片段、其變體或其組合中?？乖梢耘c自身免疫疾病、過敏或哮喘相關(guān)。在其他實施方案中，抗原可以與癌癥、皰疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳頭瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)。如下所述，疫苗的抗原可以選自由以下組成的組：HIV抗原、艱難梭菌抗原及其片段。HIV抗原可以選自由以下組成的組：Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何組合。

一些抗原可以誘導(dǎo)強免疫應(yīng)答。其他抗原可以誘導(dǎo)弱免疫應(yīng)答。當如上所述與佐劑組合時，抗原可以引起更大的免疫應(yīng)答。

(1)病毒抗原

抗原可以是病毒抗原，或其片段或其變體。病毒抗原可來自一種病毒，所述病毒來自以下家族之一：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、噬肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、細小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼腸病毒科(Reoviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。病毒抗原可以來自乳頭瘤病毒，例如人乳頭瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、天花病毒(重型天花和輕型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革熱病毒、馬腦炎病毒、風疹病毒、黃熱病病毒、諾沃克病毒(Norwalk virus)、甲型肝炎病毒、人T-細胞白血病病毒(HTLV-I)、多毛細胞白血病病毒(HTLV-II)、加州腦炎病毒、漢坦病毒(Hanta virus)(出血熱)、狂犬病病毒、埃博拉熱病毒(Ebola fever virus)、馬爾堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞體病毒(RSV)、單純性皰疹1(口腔皰疹)、單純性皰疹2(生殖器皰疹)、帶狀皰疹(水痘-帶狀皰疹，也稱為水痘)、巨細胞病毒(CMV)(例如，人CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)、黃病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亞病毒(chikungunya virus)、拉沙病毒(lassa virus)、沙粒病毒或致癌病毒。

(a)肝炎抗原

IL-21可以與肝炎病毒抗原(即，肝炎抗原)或其片段或其變體聯(lián)合或組合。肝炎抗原可以是來自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在一些實施方案中，肝炎抗原可以是編碼來自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一種或多種抗原的異源核酸分子(如質(zhì)粒)。肝炎抗原可以是全長蛋白質(zhì)的全長或免疫原性片段。

肝炎抗原可以包含共有序列和/或用于改善表達的一種或多種修飾。包括密碼子優(yōu)化、RNA優(yōu)化和添加高效免疫球蛋白前導(dǎo)序列以增加構(gòu)建體的免疫原性的基因修飾可以包括在經(jīng)過修飾的共有序列中。共有肝炎抗原可包含信號肽，如免疫球蛋白信號肽(如IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。可以設(shè)計免疫原，以引起比相應(yīng)密碼子優(yōu)化的免疫原更強并且更廣泛的細胞免疫應(yīng)答。

肝炎抗原可以是來自HAV的抗原。肝炎抗原可以是HAV衣殼蛋白、HAV非結(jié)構(gòu)蛋白、其片段、其變體或其組合。

肝炎抗原可以是來自HCV的抗原。肝炎抗原可以是HCV核衣殼蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非結(jié)構(gòu)蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其變體或其組合。

肝炎抗原可以是來自HDV的抗原。肝炎抗原可以是HDVδ抗原、其片段或其變體。

肝炎抗原可以是來自HEV的抗原。肝炎抗原可以是HEV衣殼蛋白、其片段或其變體。

肝炎抗原可以是來自HBV的抗原。肝炎抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV DNA聚合酶、由基因X編碼的HBV蛋白、其片段、其變體或其組合。肝炎抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其變體或其組合。肝炎抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白。

在一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型A共有核心蛋白序列。

在其他實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型B共有核心蛋白序列。

在另一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型C共有核心蛋白序列。

在一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型D共有核心蛋白序列。

在其他實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型E共有核心蛋白序列。

在一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型F共有核心蛋白序列。

在其他實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型G共有核心蛋白序列。

在一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型H共有核心蛋白序列。

在另一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型A共有表面蛋白序列。

在一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型B共有表面蛋白序列。

在其他實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型C共有表面蛋白序列。

在另一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型D共有表面蛋白序列。

在一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型E共有表面蛋白序列。

在其他實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型F共有表面蛋白序列。

在另一些實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型G共有表面蛋白序列。

在其他實施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列構(gòu)建體、連接至HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或HBV基因型H共有表面蛋白序列。

(b)人乳頭瘤病毒(HPV)抗原

IL-21可以與人乳頭瘤病毒(HPV)抗原或其片段或其變體聯(lián)合或組合。HPV抗原可以來自引起宮頸癌、直腸癌和/或其他癌癥的16型、18型、31型、33型、35型、45型、52型和58型HPV。HPV抗原可以來自引起生殖器疣并且已知為頭頸癌原因的6型和11型HPV。

HPV抗原可以是來自每種HPV類型的HPV E6或E7域。例如，對于16型HPV(HPV16)，HPV16抗原可以包括HPV16E6抗原、HPV16E7抗原、其片段、其變體或其組合。類似地，HPV抗原可以是HPV 6E6和/或E7、HPV 11E6和/或E7、HPV 18E6和/或E7、HPV 31E6和/或E7、HPV 33E6和/或E7、HPV 52E6和/或E7或者HPV 58E6和/或E7、其片段、變體或組合。

(c)RSV抗原

IL-21還可以與RSV抗原或其片段或其變體聯(lián)合或組合。RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(本文中還稱為“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)或其片段或變體。人RSV融合蛋白在A亞型RSV與B亞型RSV之間可以是保守的。RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23994.1)的RSV F蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是來自RSV A2鏈(GenBank AAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是RSV F蛋白或其片段或變體的單體、二聚體或三聚體。RSV抗原可以是共有RSV F氨基酸序列或其片段或變體。RSV抗原可以是編碼RSV F氨基酸序列或其片段或變體的優(yōu)化核酸。

RSV F的融合后形式在經(jīng)過免疫的動物中引起高滴度中和抗體，并且保護動物免于RSV激發(fā)。本發(fā)明在所要求的疫苗中利用這種免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，RSV F蛋白可以呈融合前形式或融合后形式。

RSV抗原還可以是人RSV附著糖蛋白(本文中還稱為“RSV G”、“RSV G蛋白”和“G蛋白”)或其片段或變體。人RSV G蛋白在A亞型RSV與B亞型RSV之間有所不同?？乖梢允莵碜訰SV長鏈(GenBank AAX23993)的RSV G蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是來自以下的RSV G蛋白：B亞型RSV分離物H5601、B亞型RSV分離物H1068、B亞型RSV分離物H5598、B亞型RSV分離物H1123或其片段或變體。RSV抗原可以是共有RSV G氨基酸序列或其片段或變體。RSV抗原可以是編碼RSV G氨基酸序列或其片段或變體的優(yōu)化核酸。

在其他實施方案中，RSV抗原可以是人RSV非結(jié)構(gòu)蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23987.1)的RSV NS1蛋白或其片段或變體。RSV抗原還可以是人RSV非結(jié)構(gòu)蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23988.1)的RSV NS2蛋白或其片段或變體。RSV抗原還可以是人RSV核衣殼(“N”)蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23989.1)的RSV N蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23990.1)的RSV P蛋白或其片段或變體。RSV抗原還可以是人RSV基質(zhì)蛋白(“M”)蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23991.1)的RSV M蛋白或其片段或變體。

在另一些實施方案中，RSV抗原可以是人RSV小疏水(“SH”)蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23992.1)的RSV SH蛋白或其片段或變體。RSV抗原還可以是人RSV基質(zhì)蛋白2-1(“M2-1”)蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23995.1)的RSV M2-1蛋白或其片段或變體。RSV抗原還可以是人RSV基質(zhì)蛋白2-2(“M2-2”)蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23997.1)的RSV M2-2蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是來自RSV長鏈(GenBank AAX23996.1)的RSV L蛋白或其片段或變體。

在另外的實施方案中，RSV抗原可以具有NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的共有氨基酸序列。RSV抗原可以是人RSV蛋白或重組抗原，如由人RSV基因組編碼的蛋白質(zhì)中的任一種。

在其他實施方案中，RSV抗原可以是但不限于：來自RSV長鏈的RSV F蛋白、來自RSV長鏈的RSV G蛋白、共有RSV G氨基酸序列、編碼RSV G氨基酸序列的優(yōu)化氨基酸、RSV長鏈的人RSV基因組、共有RSV F氨基酸序列、編碼RSV F氨基酸序列的優(yōu)化氨基酸、來自RSV長鏈的RSV NS1蛋白、來自RSV長鏈的RSV NS2蛋白、來自RSV長鏈的RSV N蛋白、來自RSV長鏈的RSV P蛋白、來自RSV長鏈的RSV M蛋白、來自RSV長鏈的RSV SH蛋白、來自RSV長鏈的RSV M2-1蛋白、來自RSV長鏈的RSV M2-2蛋白、來自RSV長鏈的RSV L蛋白、來自B亞型RSV分離物H5601的RSV G蛋白、來自B亞型RSV分離物H1068的RSV G蛋白、來自B亞型RSV分離物H5598的RSV G蛋白、來自B亞型RSV分離物H1123的RSV G蛋白，或其片段或其變體。

(d)流感抗原

IL-21可以與流感抗原或其片段或其變體聯(lián)合或組合。流感抗原是能夠在哺乳動物中引起針對一種或多種流感血清型的免疫應(yīng)答的那些流感抗原?？乖梢园L翻譯產(chǎn)物HA0、亞單位HA1、亞單位HA2、其變體、其片段或其組合。流感血凝素抗原可以是源自多種甲型流感血清型H1株的共有序列、源自多種甲型流感血清型H2株的共有序列、含有源自不同組的多種甲型流感血清型H1株的兩個不同的共有序列的部分的雜交序列或源自多種乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以來自乙型流感。

流感抗原還可以含有至少一種抗原表位，所述抗原表位可以有效對抗特定流感免疫原，針對所述流感免疫原的免疫應(yīng)答可以被誘導(dǎo)?？乖梢蕴峁┐嬖谟谕暾鞲胁《局械拿庖咴晕稽c和表位的全部譜系。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列來自一種血清型的多種甲型流感病毒株，如血清型H1或血清型H2的多種甲型流感病毒株?？乖梢允强梢酝ㄟ^組合兩個不同的共有血凝素抗原序列或其部分獲得的雜交共有血凝素抗原序列。兩個不同的共有血凝素抗原序列各自可以源自不同組的一種血清型的多種甲型流感病毒株，如血清型H1的多種甲型流感病毒株?？乖梢允强梢栽醋匝乜乖蛄械墓灿醒乜乖蛄?，所述血凝素抗原序列來自多種乙型流感病毒株。

在一些實施方案中，流感抗原可以是H1HA、H2HA、H3HA、H5HA或BHA抗原。或者，流感抗原可以是包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是包含兩個不同的共有H1序列的部分的合成雜交共有H1序列，所述兩個不同的共有H1序列各自源自來自另一者的不同組的序列。為合成雜交共有H1蛋白的共有HA抗原的實例是包含U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。共有血凝素抗原可以是源自來自乙型流感株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

共有血凝素抗原可還包含一種或多種另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原可進一步在其N末端上包含IgE或IgG前導(dǎo)氨基酸序列。共有血凝素抗原可還包含免疫原性標簽，所述免疫原性標簽是可以通過可容易獲得的抗體進行檢測的獨特免疫原性表位。所述免疫原性標簽的實例是可以連接在共有血凝素C末端上的9個氨基酸的流感HA標簽。在一些實施方案中，共有血凝素抗原可進一步在其N末端上包含IgE或IgG前導(dǎo)氨基酸序列并且在其C末端上包含HA標簽。

共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和變體組成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白質(zhì)序列和流感蛋白質(zhì)序列或其片段和變體的共有血凝素蛋白。

共有H1蛋白的實例包括可由共有H1氨基酸序列組成的那些共有H1蛋白或還包含另外元件(如IgE前導(dǎo)序列或HA標簽、或IgE前導(dǎo)序列和HA標簽二者)的那些共有H1蛋白。

共有H2蛋白的實例包括可由共有H2氨基酸序列組成的那些共有H2蛋白或還包含IgE前導(dǎo)序列或HA標簽、或IgE前導(dǎo)序列和HA標簽二者的那些共有H2蛋白。

雜交共有H1蛋白的實例包括可由共有U2氨基酸序列組成的那些雜交共有H1蛋白或還包含IgE前導(dǎo)序列或HA標簽、或IgE前導(dǎo)序列和HA標簽二者的那些雜交共有H1蛋白。

雜交共有乙型流感血凝素蛋白的實例包括可以由共有BHA氨基酸序列組成的那些雜交共有乙型流感血凝素蛋白或它可以包含IgE前導(dǎo)序列或HA標簽，或IgE前導(dǎo)序列和HA標簽二者。

共有血凝素蛋白可以由共有血凝素核酸、其變體或其片段編碼。與可以是源自來自不同株和變體的多種不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指編碼共有蛋白質(zhì)序列的核酸序列，并且所使用的編碼序列可以不同于用于編碼共有血凝素蛋白序列所源自的多個不同的血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些編碼序列。共有核酸序列可以是密碼子優(yōu)化的和/或RNA優(yōu)化的。共有血凝素核酸序列可包含位于5’非翻譯區(qū)域中的Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含編碼前導(dǎo)序列的核酸序列。N末端前導(dǎo)序列的編碼序列是血凝素編碼序列的5’。N末端前導(dǎo)子可以促進分泌。N末端前導(dǎo)子可以是IgE前導(dǎo)子或IgG前導(dǎo)子。共有血凝素核酸序列可以包含編碼免疫原性標簽的核酸序列。免疫原性標簽可以位于蛋白質(zhì)的C末端上并且編碼它的序列是共有HA編碼序列的3’。免疫原性標簽提供獨特表位，存在針對所述表位的可容易獲得的抗體，以使得可以在測定中使用所述抗體來檢測和證實蛋白質(zhì)的表達。免疫原性標簽可以是位于蛋白質(zhì)的C末端處的HA標簽。

(e)人免疫缺陷病毒(HIV)抗原

IL-21可以與HIV抗原或其片段或其變體聯(lián)合或組合。HIV抗原可以包括經(jīng)過修飾的免疫原共有序列。包括密碼子優(yōu)化、RNA優(yōu)化和添加高效免疫球蛋白前導(dǎo)序列以增加構(gòu)建體的免疫原性的基因修飾可以包括在經(jīng)過修飾的共有序列中?？梢栽O(shè)計新型免疫原，以引發(fā)比相應(yīng)密碼子優(yōu)化的免疫原更強并且更廣泛的細胞免疫應(yīng)答。

在一些實施方案中，HIV抗原可以是A亞型共有包膜DNA序列構(gòu)建體、連接至A亞型包膜蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或A亞型共有包膜蛋白序列。

在其他實施方案中，HIV抗原可以是B亞型共有包膜DNA序列構(gòu)建體、連接至B亞型包膜蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或B亞型共有包膜蛋白序列

在另一些實施方案中，HIV抗原可以是C亞型共有包膜DNA序列構(gòu)建體、連接至C亞型包膜蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或C亞型共有包膜蛋白序列。

在另外的實施方案中，HIV抗原可以是D亞型共有包膜DNA序列構(gòu)建體、連接至D亞型包膜蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或D亞型共有包膜蛋白序列。

在一些實施方案中，HIV抗原可以是B亞型Nef-Rev共有包膜DNA序列構(gòu)建體、連接至B亞型Nef-Rev蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或B亞型Nef-Rev共有蛋白序列

在其他實施方案中，HIV抗原可以是A、B、C和D亞型DNA序列構(gòu)建體的Gag共有DNA序列、連接至Gag共有A、B、C和D亞型蛋白的共有序列的IgE前導(dǎo)序列，或共有Gag A、B、C和D亞型蛋白序列。

在另一些實施方案中，HIV抗原可以是MPol DNA序列或MPol蛋白序列。HIV抗原可以是Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何組合的核酸或氨基酸序列。

(2)寄生蟲抗原

抗原可以是寄生蟲抗原或其片段或變體。寄生蟲可以是原生動物、蠕蟲或外寄生物。蠕蟲(即，腸蟲(worm))可以是扁形蟲(例如，吸蟲和絳蟲)、棘頭蟲或蛔蟲(例如，蟯蟲)。外寄生物可以是虱子、跳蚤、壁虱和螨蟲。

寄生蟲可以是引起以下疾病的任何寄生蟲：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病(Amoebiasis)、蛔蟲病、巴貝西蟲病(Babesiosis)、小袋蟲病、浣熊蛔蟲病、恰加斯病、華支睪吸蟲病、錐蠅屬病(Cochliomyia)、隱孢子蟲病、裂頭絳蟲病、龍線蟲病(Dracunculiasis)、包蟲病、象皮病、蟯蟲病、片吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、賈第鞭毛蟲病、顎口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢子球蟲病、片山熱(Katayama fever)、利什曼病(Leishmaniasis)、萊姆病(Lyme disease)、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、疥瘡、血吸蟲病、昏睡癥、類圓線蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形蟲病、旋毛蟲病以及鞭蟲病。

寄生蟲可以是棘阿米巴(Acanthamoeba)、異尖線蟲、人蛔蟲、膚蠅、結(jié)腸小袋蟲、臭蟲、多節(jié)絳蟲亞綱(絳蟲)、恙螨、螺旋蠅蛆、溶組織內(nèi)阿米巴、肝片吸蟲、蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、鉤蟲、利什曼蟲(Leishmania)、鋸齒舌形蟲、肝吸蟲、羅阿絲蟲(Loa loa)、并殖吸蟲屬-肺吸蟲、蟯蟲、惡性瘧原蟲、血吸蟲、糞類圓線蟲、螨蟲、絳蟲、剛地弓形蟲、錐體蟲、鞭蟲或吳策線蟲(Wuchereria bancrofti)。

(a)瘧疾抗原

IL-21可以與瘧疾抗原(即，PF抗原或PF免疫原)或其片段或其變體聯(lián)合或組合?？乖梢詠碜砸鸠懠驳募纳x。引起瘧疾的寄生蟲可以是惡性瘧原蟲。惡性瘧原蟲抗原可以包括環(huán)子孢子(CS)抗原。

在一些實施方案中，瘧疾抗原可以是編碼惡性瘧原蟲免疫原CS、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1中的一個或多個的核酸分子(如質(zhì)粒)。免疫原可以是全長蛋白質(zhì)的全長或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表達的修飾。

在其他實施方案中，瘧疾抗原可以是從GenBank數(shù)據(jù)庫中的所有全長惡性瘧原蟲TRAP/SSP2序列(總共28個序列)設(shè)計的TRAP(也稱為SSP2)的共有序列。共有TRAP免疫原(即，ConTRAP免疫原)可包含信號肽(如免疫球蛋白信號肽，如IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。

在另一些實施方案中，瘧疾抗原可以是CelTOS，其也稱為Ag2并且是高度保守的瘧原蟲抗原。共有CelTOS抗原(即，ConCelTOS免疫原)可包含信號肽(如免疫球蛋白信號肽，如IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。

在另外的實施方案中，瘧疾抗原可以是Ama1，其為高度保守的瘧原蟲抗原。瘧疾抗原還可以是Ama1(即，ConAmaI免疫原)的共有序列，其在一些情況下包含信號肽(如免疫球蛋白信號肽，如IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。

在一些實施方案中，瘧疾抗原可以是共有CS抗原(即，共有CS免疫原)，其在一些情況下包含信號肽(如免疫球蛋白信號肽，如IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。

在其他實施方案中，瘧疾抗原可以是包含本文所述的兩種或更多種PF蛋白的組合的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含直接彼此相鄰地連接或者間隔子以之間具有間隔子或一個或多個氨基酸連接的共有CS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原和ConAma1免疫原中的兩種或更多種。在一些實施方案中，融合蛋白包含兩個PF免疫原。在一些實施方案中，融合蛋白包含三個PF免疫原。在一些實施方案中，融合蛋白包含四個PF免疫原。在一些實施方案中，融合蛋白包含五個PF免疫原。

具有兩個共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS和LSA1、CS和TRAP、CS和CelTOS、CS和Ama1、LSA1和TRAP、LSA1和CelTOS、LSA1和Ama1、TRAP和CelTOS、TRAP和Ama1；或者CelTOS和Ama1。具有三個共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1和TRAP；CS、LSA1和CelTOS；CS、LSA1和Ama1；LSA1、TRAP和CelTOS；LSA1、TRAP和Ama1；或者TRAP、CelTOS和Ama1。具有四個共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1、TRAP以及CelTOS；CS、LSA1、TRAP以及Ama1；CS、LSA1、CelTOS以及Ama1；CS、TRAP、CelTOS以及Ama1；或者LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。具有五個共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。

在一些實施方案中，融合蛋白包含連接至N末端的信號肽。在一些實施方案中，融合蛋白包含連接至每個共有PF免疫原的N末端的多個信號肽。在一些實施方案中，間隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之間。在一些實施方案中，融合蛋白的PF免疫原之間的間隔子可以是蛋白水解裂解位點。在一些實施方案中，間隔子可以是由在意圖向其施用疫苗和/或攝取疫苗的細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛋白酶識別的蛋白水解裂解位點。在一些實施方案中，間隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之間，其中間隔子是由在意圖向其施用疫苗和/或攝取疫苗的細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛋白酶識別的蛋白水解裂解位點，并且融合蛋白包含連接至每個共有PF免疫原的N末端的多個信號肽，以使得在裂解時，每個共有PF免疫原的信號肽使相應(yīng)共有PF免疫原轉(zhuǎn)移至細胞外。

(3)細菌抗原

抗原可以是細菌抗原或其片段或變體。細菌可以來自以下門中的任一種：酸桿菌門、放線菌門、產(chǎn)水菌門、擬桿菌門、Caldiserica門、衣原體門、綠菌門、綠彎菌門、產(chǎn)金菌門、藍藻菌門、脫鐵桿菌門、異常球菌-棲熱菌門、網(wǎng)團菌門、Elusimicrobia門、纖維桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、芽單胞菌門、黏膠球形菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、變形菌門、螺旋菌門、互養(yǎng)菌門、無壁菌門、熱脫硫桿菌門、熱袍菌門以及疣微菌門。

細菌可以是革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。細菌可以是好氧細菌或厭氧細菌。細菌可以是自氧細菌或異氧細菌。細菌可以是嗜溫菌、嗜中性菌、嗜極菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜熱菌、嗜冷菌、嗜鹽菌或嗜高滲菌。

細菌可以是炭疽細菌、耐抗生素細菌、致病細菌、食物中毒細菌、傳染性細菌、沙門氏菌屬(Salmonella)細菌、葡萄球菌屬細菌、鏈球菌屬細菌或破傷風細菌。細菌可以是分枝桿菌(mycobacteria)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫桿菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)或者艱難梭菌(Clostridium difficile)。

(a)結(jié)核分支桿菌抗原

IL-21可以與結(jié)核分支桿菌抗原(即，TB抗原或TB免疫原)或其片段或其變體聯(lián)合或組合。TB抗原可以來自TB抗原的Ag85家族，例如Ag85A和Ag85B。TB抗原可以來自TB抗原的Esx家族，例如EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV以及EsxW。

在一些實施方案中，TB抗原可以是編碼來自Ag85家族和Esx家族的一種或多種結(jié)核分支桿菌免疫原的異源核酸分子(如質(zhì)粒)。免疫原可以是全長蛋白質(zhì)的全長或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表達的修飾。共有免疫原可包含信號肽(如免疫球蛋白信號肽，如IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。

(b)艱難梭菌抗原

IL-21可以與艱難梭菌抗原(即，CD抗原或CD免疫原)或其片段或其變體聯(lián)合或組合。CD抗原可以是毒素A或毒素B。在一些實施方案中，CD抗原可以是編碼毒素A、毒素B或毒素A和毒素B兩者的異源核酸分子，如質(zhì)粒。CD抗原可以是全長蛋白質(zhì)或全長蛋白質(zhì)的免疫原性片段。CD抗原可包含共有序列和/或用于改善表達的修飾。CD抗原可包含信號肽，如免疫球蛋白信號肽(例如，IgE或IgG信號肽)，并且在一些實施方案中，可包含HA標簽。

(4)真菌抗原

抗原可以是真菌抗原或其片段或變體。真菌可以是曲霉菌屬(Aspergillus species)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假絲酵母(Candida yeasts)(例如，白色念珠菌(Candida albicans))、球孢子菌屬(Coccidioides)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隱球菌(Cryptococcus gattii)、皮膚真菌(dermatophyte)、鐮刀菌屬(Fusarium species)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、毛霉菌亞門(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、明臍菌屬(Exserohilum)或者枝孢菌屬(Cladosporium)。

c.載體

疫苗可以包含一種或多種載體，所述載體包含一個或多個編碼抗原的異源核酸和佐劑。一種或多種載體可以能夠表達抗原和佐劑。一種或多種載體可以是表達構(gòu)建體，所述表達構(gòu)建體通常是用于將特定基因引入靶細胞中的質(zhì)粒。一旦表達載體位于細胞內(nèi)部，那么通過細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機器核糖體復(fù)合物產(chǎn)生由基因編碼的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒經(jīng)常經(jīng)過工程改造以含有調(diào)控序列，所述調(diào)控序列充當增強子和啟動子區(qū)域，并且導(dǎo)致表達載體上攜帶的基因的有效轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的載體表達大量穩(wěn)定的信使RNA，和因此形成的蛋白質(zhì)。

載體可具有表達信號(如強啟動子、強終止密碼子)、啟動子與克隆基因之間的距離的調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄終止序列和PTIS(可移動翻譯起始序列)的插入。

(1)表達載體

載體可以是環(huán)狀質(zhì)?；蚓€性核酸。環(huán)狀質(zhì)粒和線性核酸能夠指導(dǎo)適當?shù)氖茉囌呒毎械奶囟ó愒春塑账嵝蛄械谋磉_。載體可以具有可操作地連接至編碼抗原的核苷酸序列或編碼佐劑的核苷酸序列的啟動子，這些核苷酸序列可以可操作地連接至終止信號。載體還可以含有核苷酸序列的正確翻譯所需的序列。包含目標核苷酸序列的載體可以是嵌合的，這意味著至少一種其組分相對于至少一種它的其他組分是異源的。表達盒中的核苷酸序列的表達可在組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的控制下，所述啟動子僅在宿主細胞暴露于一些特定外部刺激時起始轉(zhuǎn)錄。在多細胞有機體的情況下，啟動子還可以是對特定組織或器官或發(fā)育階段特異性的。

(2)環(huán)狀載體和線性載體

載體可以是環(huán)狀質(zhì)粒，所述環(huán)狀質(zhì)?？赏ㄟ^整合至細胞基因組中來轉(zhuǎn)化靶細胞或存在于染色體外(例如，具有復(fù)制起點的自主復(fù)制質(zhì)粒)。

載體可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能夠表達編碼抗原或佐劑的異源DNA并且使細胞能將序列翻譯成由免疫系統(tǒng)識別的抗原或者佐劑的任何其他表達載體。

本文還提供能夠經(jīng)由電穿孔有效地遞送至受試者并且表達一種或多種所需的抗原或者一種或多種所需的佐劑的線性核酸疫苗和/或線性表達盒(“LEC”)。LEC可以是沒有任何磷酸主鏈的任何線性DNA。DNA可編碼一種或多種抗原和/或一種或多種佐劑。LEC可包含啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和/或多腺苷酸化信號?？乖蜃魟┑谋磉_可由啟動子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主鏈。LEC可不包含與所需的抗原基因表達或所需的佐劑表達不相關(guān)的其他核酸序列。

LEC可源自能夠線性化的任何質(zhì)粒。質(zhì)?？赡軌虮磉_抗原和/或佐劑。質(zhì)?？梢允莗NP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。質(zhì)?？梢允荳LV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或者能夠表達編碼抗原或編碼佐劑的DNA并且使細胞能將序列翻譯成由免疫系統(tǒng)識別的抗原或者佐劑的任何其他表達載體。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分別源自pNP(Puerto Rico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(3)啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和多腺苷酸化信號

載體可具有啟動子。啟動子可以是能夠驅(qū)動基因表達并且調(diào)控所分離核酸的表達的任何啟動子。所述啟動子是經(jīng)由DNA依賴性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列元件，所述順式作用序列元件轉(zhuǎn)錄本文所描述的抗原序列或佐劑序列。用于指導(dǎo)異源核酸表達的啟動子的選擇取決于具體應(yīng)用。在載體中，啟動子可定位在距離轉(zhuǎn)錄起始點與其天然環(huán)境中距離轉(zhuǎn)錄起始位點大約相同的位置上。然而，可容許所述距離的變化而不損失啟動子功能。

啟動子可以可操作地連接至編碼抗原以及轉(zhuǎn)錄物的有效多腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止所需的信號的核酸序列。啟動子可以可操作地連接至編碼佐劑和轉(zhuǎn)錄物的高效多腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止所需的信號的核酸序列。

啟動子可以是CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子，或?qū)τ谡婧思毎械谋磉_顯示有效的另一種啟動子。

載體可包含增強子和具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。載體可含有位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來提供有效終止。可從與啟動子序列相同的基因獲得或可從不同的基因獲得終止區(qū)。

d.賦形劑和疫苗的其他組分

疫苗可還包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可以是功能性分子，如媒介物、除IL-21之外的佐劑、載體或稀釋劑。所述藥學上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進劑，其可包括表面活性劑如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、費氏(Freunds)不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌類似物、囊泡如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米粒子或其他已知的轉(zhuǎn)染促進劑。

轉(zhuǎn)染促進劑可以是聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸鹽(LGS))或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促進劑可以是聚-L-谷氨酸鹽，并且聚-L-谷氨酸鹽可以小于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染促進劑還可包括表面活性劑，如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物以及囊泡(如角鯊烯和角鯊烯)。透明質(zhì)酸還可結(jié)合基因構(gòu)建體施用而使用。DNA質(zhì)粒疫苗還可包含轉(zhuǎn)染促進劑，如脂質(zhì)、脂質(zhì)體(包括卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其他脂質(zhì)體，如DNA-脂質(zhì)體混合物(參見例如W09324640))、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒，或其他已知的轉(zhuǎn)染促進劑。疫苗中的轉(zhuǎn)染劑的濃度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

藥學上可接受的賦形劑可以是除IL-21之外的佐劑。另外的佐劑可以是在替代性質(zhì)粒中表達的或在疫苗中作為蛋白質(zhì)與以上質(zhì)粒組合遞送的其他基因。佐劑可選自由以下各項組成的組：α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子(TECK)、粘膜相關(guān)上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括信號序列缺失的IL-15并且任選地包括來自IgE的信號肽)。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其組合。

可用作除了IL-21之外的佐劑的其他基因包括編碼以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇素(L-selectin)、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶(Caspase)ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Re1、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活化NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素應(yīng)答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

疫苗可還包含如1994年4月1日提交的美國序列號021,579中所描述的基因疫苗促進劑，所述專利文獻以引用的方式全部并入。

可以根據(jù)待使用的施用方式來配制疫苗。可注射的疫苗藥物組合物可以是無菌、不含熱原并且不含微粒的?？梢允褂玫葷B制劑或溶液。用于等滲性的添加劑可以包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可以包含血管收縮劑。等滲溶液可以包括磷酸鹽緩沖鹽水。疫苗可以還包含穩(wěn)定劑(包括明膠和白蛋白)。穩(wěn)定劑可以允許制劑在室溫或環(huán)境溫度下穩(wěn)定持續(xù)延長的時間段，所述穩(wěn)定劑包括LGS或聚陽離子或聚陰離子。

3.接種疫苗的方法

本發(fā)明還涉及通過不同的疫苗施用途徑來增加受試者中的免疫應(yīng)答的方法。增加免疫應(yīng)答可用于治療和/或預(yù)防受試者的疾病。

所述方法可以包括向受試者施用本文所公開的疫苗。與僅施用抗原的受試者相比，施用疫苗的受試者具有增加或加強的免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，施用疫苗的受試者中的免疫應(yīng)答可以增加約18％至約650％?；蛘撸┯靡呙绲氖茉囌咧械拿庖邞?yīng)答可以增加約45％至約260％。在另一些替代實施方案中，施用疫苗的受試者中的免疫應(yīng)答可以增加約93％至約130％。

在其他實施方案中，所施用的疫苗可以使受試者中的免疫應(yīng)答增加或增強至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、或至少約10倍。

疫苗劑量可以是在1μg至10mg之間的活性組分/kg體重/時間，并且可以是20μg至10mg組分/kg體重/時間?？梢悦?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治療的疫苗劑量的數(shù)目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

a.施用

所述疫苗可根據(jù)藥物領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的標準技術(shù)來配制。這類組合物可通過醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)以考慮到如具體受試者的年齡、性別、體重和條件及施用途徑的劑量來施用。受試者可以是哺乳動物，如人、馬、牛、豬、綿羊、貓、狗、大鼠或小鼠。

可以預(yù)防性地或治療性地施用疫苗。在預(yù)防性施用中，可以足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量施用疫苗。在治療性應(yīng)用中，以足以引起治療效果的量向有需要的受試者施用疫苗。將足夠?qū)崿F(xiàn)此目標的量定義為“治療有效劑量”。對于這種用途有效的量取決于(例如)所施用的疫苗方案的具體組成、施用方式、疾病的階段和嚴重程度、患者的總體健康狀況以及處方醫(yī)師的判斷。

可以通過如文獻中所描述的本領(lǐng)域熟知的方法來施用疫苗，所述文獻如下：Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等(美國專利號5,580,859，1996年12月3日發(fā)布)；Felgner(美國專利號5,703,055，1997年12月30日發(fā)布)；以及Carson等(美國專利號5,679,647，1997年10月21日發(fā)布)，所有所述文獻的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文?？梢?例如)使用疫苗槍將疫苗的DNA與可以施用至個體的顆?；蛑榱＿M行復(fù)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道藥學上可接受的載體(包括生理學上可接受的化合物)的選擇取決于(例如)表達載體的施用途徑。

可以經(jīng)由多種途徑來遞送疫苗。典型的遞送途徑包括腸胃外施用，例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)或皮下遞送。其他途徑包括口服施用、鼻內(nèi)和陰道內(nèi)途徑。特別是對于疫苗的DNA，疫苗可以遞送到個體組織的間質(zhì)空間(Felgner等，美國專利號5,580,859和5,703,055，所有所述專利的內(nèi)容以引用方式整體并入本文)。還可以將疫苗施用至肌肉，或可以經(jīng)由皮內(nèi)或皮下注射或經(jīng)皮(如通過離子電滲療法)施用。還可以采用疫苗的表皮施用。表皮施用可以涉及機械地或化學地刺激表皮的最外層，以刺激對刺激物的免疫應(yīng)答(Carson等，美國專利號5,679,647，所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文)。

還可以配制疫苗，用于經(jīng)由鼻通道施用。適合用于經(jīng)鼻施用的制劑(其中載體是固體)可以包括具有(例如)在約10微米至約500微米范圍中的顆粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式來施用，即，通過鼻道從靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制劑可以是鼻用噴霧劑、滴鼻劑或通過噴霧器進行氣霧劑施用。制劑可以包含疫苗的水性溶液或油性溶液。

疫苗可以是液體制劑，如混懸劑、糖漿或酏劑。疫苗還可以是用于腸胃外、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用(例如，可注射施用)的制劑，如無菌混懸劑或乳劑。

疫苗可以摻入脂質(zhì)體、微球或其他聚合物基體中(Felgner等，美國專利號5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology,第I卷至第III卷(第2版，1993)，所述文獻的內(nèi)容以引用方式整體并入本文)。脂質(zhì)體可以由磷脂或其他脂質(zhì)組成，并且可以是制造和施用相對簡單的無毒的、生理學上可接受的和可代謝的載體。

可以經(jīng)由電穿孔，(如)通過美國專利號7,664,545中所描述的方法來施用疫苗，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。電穿孔可以通過美國專利號6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或裝置來進行，所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文?？山?jīng)由微創(chuàng)設(shè)備來進行電穿孔。

微創(chuàng)電穿孔設(shè)備(“MID”)可以是用于將以上所描述的疫苗和相關(guān)流體注射至身體組織中的裝置。所述設(shè)備可包括中空針、DNA盒和流體遞送部件，其中所述設(shè)備適于在使用中致動流體遞送部件，以便在將針插入身體組織中的過程中同時(例如，自動地)將DNA注射至所述身體組織中。這具有以下優(yōu)點：在插入針的同時逐漸注射DNA和相關(guān)流體的能力導(dǎo)致通過身體組織的流體的更均勻分布。由于注射的DNA分布在較大面積上，可減少注射過程中經(jīng)受的疼痛。

MID可在不使用針的情況下將疫苗注射至組織中。MID可將疫苗作為小的流或射流以使得疫苗穿透組織的表面并且進入下層組織和/或肌肉的力進行注射。小的流或射流之后的力可由壓縮氣體(如在幾分之一秒內(nèi)通過微小孔的二氧化碳)的膨脹提供。微創(chuàng)性電穿孔裝置及其使用方法的實例描述于公布的美國專利申請?zhí)?0080234655；美國專利號6,520,950；美國專利號7,171,264；美國專利號6,208,893；美國專利號6,009,347；美國專利號6,120,493；美國專利號7,245,963；美國專利號7,328,064；和美國專利號6,763,264中，所述專利各自的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

MID可包括產(chǎn)生無痛地穿透組織的液體的高速射流的注射器。這類無針注射器可商購獲得。本文可以使用的無針注射器的實例包括美國專利號3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310中所描述的那些，每個所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

可以使用無針注射器將呈適用于直接或間接電轉(zhuǎn)運形式的所需的疫苗引入(例如注射)至待治療的組織中，通常通過將組織表面與注射器接觸，以便以足以導(dǎo)致疫苗滲透至組織中的力致動藥劑射流的遞送。例如，如果待治療的組織是粘膜、皮膚或肌肉，那么將藥劑朝向粘膜或皮膚表面以足以導(dǎo)致藥劑滲透穿過角質(zhì)層并且進入真皮層中或分別進入下層組織和肌肉中的力進行噴射。

無針注射器非常適合于將疫苗遞送至所有類型的組織，特別是遞送至皮膚和粘膜。在一些實施方案中，無針注射器可以用于將含有疫苗的液體推送至表面并且進入受試者的皮膚或粘膜中?？梢允褂帽景l(fā)明的方法治療的各種類型的組織的代表性實例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心臟、腎、肌肉、乳房、結(jié)腸、前列腺、胸腺、睪丸、皮膚、粘膜組織、卵巢、血管或其任何組合。

MID可具有將組織電穿孔的針電極。通過在多電極陣列(例如設(shè)置成矩形或正方形圖案)中的多對電極之間脈沖來提供優(yōu)于在一對電極之間脈沖的結(jié)果的改良的結(jié)果。例如于題為“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美國專利號5,702,359中公開針陣列，其中可在治療性處理過程中對多對針產(chǎn)生脈沖。在所述應(yīng)用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陳述一樣)，針安置在環(huán)形陣列中，但具有連接器和轉(zhuǎn)換裝置，從而實現(xiàn)相對對的針電極之間的脈沖?？墒褂糜糜趯⒅亟M表達載體遞送至細胞的一對針電極。這種設(shè)備和系統(tǒng)在美國專利號6,763,264中進行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文?；蛘?，可使用單針設(shè)備，所述設(shè)備允許DNA注射和使用類似于正常注射針的單針電穿孔并且施加比通過目前所使用設(shè)備遞送的電壓低的電壓的脈沖，從而減少患者經(jīng)受的電感覺。

MID可包括一個或多個電極陣列。陣列可包括具有相同直徑或不同直徑的兩個或多個針。針可均勻或不均勻地間隔開。針可介于0.005英寸與0.03英寸之間、0.01英寸與0.025英寸之間，或0.015英寸與0.020英寸之間。針的直徑可以是0.0175英寸。針可間隔開0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脈沖發(fā)生器和在單個步驟中遞送疫苗和電穿孔脈沖的兩個或更多個針疫苗注射器組成。脈沖發(fā)生器可允許經(jīng)由閃存卡操作的個人計算機靈活地編程脈沖和注射參數(shù)，以及電穿孔和患者數(shù)據(jù)的全面記錄和儲存。脈沖發(fā)生器可在短的時間段期間遞送多種伏特脈沖。例如，脈沖發(fā)生器可遞送100ms持續(xù)時間的三個15伏特脈沖。所述MID的實例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系統(tǒng)，所述系統(tǒng)在美國專利號7,328,064中進行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)設(shè)備和系統(tǒng)，其是便于將大分子(如DNA)引入身體或植物中選定組織的細胞中的模塊化電極系統(tǒng)。模塊化電極系統(tǒng)可包括多個針電極、皮下針、提供從可編程恒流脈沖控制器至多個針電極的導(dǎo)電鏈路的電連接器，以及電源。操作者可以抓住固定在支撐結(jié)構(gòu)上的多個針電極并將它們堅固地插入到身體或植物中所選定的組織中。然后經(jīng)由皮下針將大分子遞送到選定組織中。啟動可編程的恒定電流脈沖控制器，并將恒定電流電脈沖施加到多個針電極中。所施加的恒流電脈沖促進將大分子引入多個電極之間的細胞中。由于細胞的過度加熱造成的細胞死亡通過借助于恒流脈沖限制組織中的功率消耗而得以最小化。Cellectra設(shè)備和系統(tǒng)在美國專利號7,245,963中進行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

MID可以是Elgen 1000系統(tǒng)(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系統(tǒng)可包括提供中空針的設(shè)備；和流體遞送部件，其中裝置適于在使用中致動流體遞送部件，以便在將針插入身體組織中的過程中同時(例如，自動地)將流體(本文所描述的疫苗)注射至所述身體組織中。優(yōu)點是：在插入針的同時逐漸注射流體的能力導(dǎo)致通過身體組織的流體的更均勻分布。還據(jù)信，由于注射的流體的體積分布在較大面積上，減少了在注射過程中經(jīng)受的疼痛。

此外，流體的自動注射有助于所注射流體的實際劑量的自動監(jiān)測和配準。可以根據(jù)需要出于文件編制目的通過控制單元來儲存這一數(shù)據(jù)。

應(yīng)理解，注射速率可以是線性或非線性的，并且可在已經(jīng)將針插入穿過待治療的受試者的皮膚之后并且在將所述針進一步插入身體組織中時進行注射。

可通過本發(fā)明的裝置將流體注射至其中的適合組織包括腫瘤組織、皮膚或肝組織，但也可以是肌肉組織。

裝置還包括用于引導(dǎo)針插入身體組織中的針插入部件。通過針插入的速率來控制流體注射的速率。這具有以下優(yōu)點：既可以控制針插入，又可以控制流體的注射，以使得可以根據(jù)需要使插入速率與注射速率相匹配。它還使裝置更易于用戶操作。如果需要，可以提供用于將針自動地插入身體組織中的部件。

用戶可以選擇何時開始流體的注射。然而，理想地，在針的尖端到達肌肉組織時開始注射，并且裝置可包括用于感測針何時插入至足以開始注射流體的深度的部件。這意味著當針達到所需深度(其將通常是肌肉組織開始處的深度)時，可以提示以自動地開始流體的注射。肌肉組織開始處的深度可以(例如)采用為預(yù)設(shè)針插入深度(如4mm的值)，所述深度將被認為是對于針穿過皮膚層來說是足夠的。

感測部件可包括超聲探針。感測部件可包括用于感測阻抗或電阻的變化的部件。在這種情況下，部件可不如此記錄針在身體組織中的深度，而將相反適于隨著針從不同類型的身體組織移動至肌肉中來感測阻抗或電阻的變化。這些替代方案中的任一個提供相對準確和簡單地操作的感測可開始注射的部件。可以根據(jù)需要進一步記錄針的插入深度，并且所述深度可以用于控制流體的注射，以使得根據(jù)正被記錄的針的插入深度來確定待注射的流體的體積。

裝置可還包括：用于支撐針的底座和用于在其中接納底座的殼體，其中底座可相對于殼體移動，以使得當?shù)鬃鄬τ跉んw處于第一后方位置時，針縮回殼體內(nèi)，并且當?shù)鬃跉んw內(nèi)處于第二前方位置時，針延伸出殼體外。由于殼體可以在患者的皮膚上對準，并且然后可以通過相對于底座移動殼體來將針插入患者的皮膚中，所以這對于用戶來說是有利的。

如上所述，希望實現(xiàn)流體注射的受控速率，以使得在將針插入皮膚中時，流體在針的長度上均勻分布。流體遞送部件可包括適于以受控速率注射流體的活塞驅(qū)動部件?？梢?例如)通過伺服馬達來激活活塞驅(qū)動部件。然而，可通過在軸向方向上相對于殼體移動的底座來致動活塞驅(qū)動部件。應(yīng)理解，可以提供用于流體遞送的替代裝置。因此，(例如)可以提供可以被擠壓用于以受控或非受控速率流體遞送的的封閉容器來代替注射管和活塞系統(tǒng)。

以上所描述的裝置可以用于任何類型的注射。然而，設(shè)想到它在電穿孔的領(lǐng)域中尤其有用，并且因此它可還包括用于向針施加電壓的部件。這允許針不僅用于注射，而且還用作電穿孔過程中的電極。這一點是尤其有利的，因為它意味著電場被施加至與所注射的流體相同的面積上。傳統(tǒng)上電穿孔存在很難準確地將電極與之前注射的流體對準的問題，并且因此用戶傾向于在較大的面積上注射大于所要求的體積的流體，并且在較高的面積上施加電場，以試圖確保所注射的物質(zhì)與電場之間的重疊。使用本發(fā)明，可減少所注射流體的體積和所施加電場的大小，同時實現(xiàn)電場與流體之間的良好配合。

本發(fā)明具有多個方面，所述方面通過以下非限制性實施例說明。

3.實施例

實施例1

IL-21的表達

構(gòu)建編碼IL-21基因的質(zhì)粒(即pVAX-mIL-21Opt)以表達IL-21(圖1)。在插入質(zhì)粒中之前，對IL-21的DNA序列進行密碼子和RNA優(yōu)化。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293T細胞中以確認IL-21的表達。通過ELISA分析細胞上清液。結(jié)果顯示，IL-21在HEK 293T細胞中表達(圖2)。

實施例2

IL-21增加IGG和IGA血清滴度

當通過肌內(nèi)途徑施用疫苗時，將小鼠用作模型系統(tǒng)來確定IL-21是否可以起到作為佐劑的作用。疫苗包含由各自的質(zhì)粒編碼的來自艱難梭菌的毒素A和毒素B抗原以及IL-21。

具體地說，用質(zhì)粒pVAX-mIL-21Opt(圖1和上文實施例1中所述)和如上所述編碼來自艱難梭菌的毒素A和毒素B抗原的質(zhì)粒免疫一組小鼠。僅用編碼毒素A和毒素B抗原的質(zhì)粒免疫第二組小鼠。僅用空對照質(zhì)粒pVAX免疫第三組小鼠。通過使用電穿孔的肌內(nèi)途徑免疫小鼠。接著在免疫動物的血液中分析循環(huán)的抗原特異性IgG和IgA抗體分泌細胞，以確定IL-21佐劑的影響。

如圖4的上圖所示，與用單獨抗原進行的免疫相比，IL-21佐劑增加血清抗毒素A IgG的總量，在IL-21組中看到在1:2000稀釋度下的強勁滴度，而在僅接受抗原的組沒有看到。當分析血清IgA時，注意到包含IL-21佐劑產(chǎn)生在1:2000稀釋度下滴定出的可檢測水平的抗原特異性IgA，而用單獨抗原進行的免疫在初試動物中未顯示任何強勁信號(圖4下圖)。

以上數(shù)據(jù)顯示：當通過肌內(nèi)途徑施用時，IL-21具有用作佐劑能力，因為IL-21增強了對來自艱難梭菌的毒素A和毒素B抗原的體液免疫應(yīng)答。以上數(shù)據(jù)還表明，IL-21能夠用作細菌抗原的佐劑。

實施例3

IL-21增加對HIV抗原的細胞和體液免疫應(yīng)答

IL-21佐劑還與編碼來自HIV的EnvA和EnvC抗原的質(zhì)粒組合施用。在疫苗中包含IL-21增強了對EnvC的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。疫苗包含來自HIV的EnvA和EnvC抗原以及IL-21。EnvA抗原、EnvC抗原和IL-21由單獨質(zhì)粒編碼。

具體地，EnvA抗原是由SEQ ID NO:5中所列出的核苷酸序列編碼的共有蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:6)。將SEQ ID NO:5中所列出的這種核苷酸序列摻入質(zhì)粒中。

EnvC抗原是由SEQ ID NO:7中所列出的核苷酸序列編碼的共有蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:8)。將SEQ ID NO:7中所列出的這種核苷酸序列摻入質(zhì)粒中。

具體地說，用質(zhì)粒pVAX-mIL-21Opt(圖1和上文實施例1中所述)和如上所述編碼EnvA和EnvC抗原的質(zhì)粒免疫一組小鼠。僅用編碼EnvA和EnvC抗原的質(zhì)粒免疫第二組小鼠。僅用空對照質(zhì)粒pVAX免疫第三組小鼠。通過使用電穿孔的肌內(nèi)途徑免疫小鼠。使用干擾素γELISpot測定來檢驗免疫組小鼠中的細胞免疫應(yīng)答。

如圖5所示，與單獨的抗原相比，用IL-21進行的免疫使對EnvC抗原的細胞免疫應(yīng)答增加大于2倍。因此，這些數(shù)據(jù)表明，IL-21能夠在肌肉組織中用作佐劑，因為IL-21增強了對EnvA和EnvC抗原的細胞免疫應(yīng)答。

在通過針對EnvA蛋白的ELISA進行第三免疫之后，在免疫動物的血清中測量抗體應(yīng)答(圖6)。在1:400稀釋度下，HIV EnvA/C的平均O.D.為大約0.6，而IL-21佐劑組的平均O.D.讀數(shù)為1.0。

綜合來看，這些數(shù)據(jù)表明當包含在DNA疫苗中時，IL-21發(fā)揮出呈以下形式的新型佐劑活性：抗體分泌細胞的頻率增加、所產(chǎn)生IgG的量和類別轉(zhuǎn)換、IgA產(chǎn)生量的增加和IFN-γ分泌增加。

應(yīng)理解先前詳細描述和隨附實施例僅是說明性的，并且不應(yīng)視為對本發(fā)明的范圍的限制，所述范圍僅由隨附權(quán)利要求和它們的等效物限定。

所公開的實施方案的各種改變和改進對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在不偏離其本質(zhì)和范圍的前提下，可進行與包括但不限于本發(fā)明的化學結(jié)構(gòu)、取代基、衍生物、中間體、合成、組合物、制劑和/或使用方法有關(guān)的此類改變和改進。

序列表

<110> 賓夕法尼亞大學理事會

艾諾奧醫(yī)藥品有限公司

大衛(wèi)·B·韋納

馬修·P·莫羅

<120> 具有白細胞介素-21作為佐劑的疫苗

<130> 206108-0032-00-WO.604750/UPVG0052

<150> US 62/058,304

<151> 2014-10-01

<160> 9

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 1

atggactgga cctggatcct gttcctggtc gccgcagcca caagggtgca cagcgagagg 60

accctggtct gcctggtggt gatcttcctg ggcaccgtgg cccacaagag cagcccccag 120

ggccccgaca ggctgctgat caggctgagg cacctgatcg acatcgtgga gcagctgaag 180

atctacgaga acgacctgga ccccgagctg ctctccgccc ctcaagacgt gaagggccac 240

tgcgagcacg ccgccttcgc ctgcttccag aaggccaagc tgaagcccag caaccccggc 300

aacaacaaga ccttcatcat cgacctggtg gcccagctga gaagaaggct gcccgccaga 360

aggggcggca agaagcagaa acacatcgcc aagtgcccca gctgcgacag ctacgagaag 420

aggaccccca aggaatttct ggagaggctg aagtggctgc tgcagaagat gattcaccag 480

cacctgagct gatga 495

<210> 2

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr

20 25 30

Val Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg

35 40 45

Leu Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn

50 55 60

Asp Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His

65 70 75 80

Cys Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro

85 90 95

Ser Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln

100 105 110

Leu Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His

115 120 125

Ile Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys

130 135 140

Glu Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln

145 150 155 160

His Leu Ser

<210> 3

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 3

atggactgga cttggattct gtttctggtc gcagcagcaa ctagagtgca ttcacgcagc 60

agccctggga acatggagag gattgtcatc tgcctgatgg tgattttcct gggcacactg 120

gtccacaaga gctcctctca gggacaggac aggcatatga tcaggatgcg acagctgatc 180

gacatcgtgg atcagctgaa gaactacgtg aacgacctgg tcccagagtt tctgcctgca 240

ccagaggatg tcgaaactaa ctgcgaatgg agtgccttct catgtttcca gaaggcacag 300

ctgaagtccg ctaacaccgg aaacaatgag cgaatcatca acgtgagcat taagaaactg 360

aagcgaaagc cccctagtac caatgctggc cggagacaga agcacagact gacatgccct 420

agctgtgatt cctacgaaaa gaaaccaccc aaggagttcc tggaacgctt taaaagcctg 480

ctgcagaaaa tgattcacca gcacctgtct tccagaaccc acggctcaga ggattca 537

<210> 4

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu

20 25 30

Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly

35 40 45

Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp

50 55 60

Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe

85 90 95

Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile

100 105 110

Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn

115 120 125

Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser

130 135 140

Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu

145 150 155 160

Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser

165 170 175

Glu Asp Ser

<210> 5

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 5

ggatccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg ccgccaccag agtgcacagc 60

agagtgatgg gcatccagcg gaattgccag cacctgtgga gatggggcac catgatcctg 120

ggcatgatca tcatctgctc tgccgccgag aacctgtggg tgaccgtgta ctacggcgtg 180

cctgtgtgga aggacgccga gaccaccctg ttctgcgcca gcgacgccaa ggcctacgat 240

accgaagtgc acaatgtgtg ggccacccac gcctgcgtgc ctaccgatcc caacccccag 300

gagatcaacc tggagaacgt gaccgaggag ttcaacatgt ggaagaacaa catggtggag 360

cagatgcaca ccgacatcat cagcctgtgg gaccagagcc tgaagccttg cgtgaagctg 420

acccctctgt gcgtgaccct gaactgcagc aacgtgaacg tgaccaccaa catcatgaag 480

ggcgagatca agaactgcag cttcaacatg accaccgagc tgcgggacaa gaagcagaaa 540

gtgtacagcc tgttctacaa gctggacgtg gtgcagatca acaagagcaa cagcagcagc 600

cagtaccggc tgatcaactg caacaccagc gccatcaccc aggcctgccc caaagtgagc 660

ttcgagccca tccccatcca ctactgcgcc cctgccggct tcgccatcct gaagtgcaag 720

gacaaggagt ttaacggcac cggcccctgc aagaatgtga gcaccgtgca gtgcacccac 780

ggcatcaagc ccgtggtgtc cacccagctg ctgctgaacg gcagcctggc cgaggaggaa 840

gtgatgatcc ggagcgagaa catcaccaac aacgccaaga acatcatcgt gcagctgacc 900

aagcccgtga agatcaattg cacccggccc aacaacaaca cccggaagag catcagaatc 960

ggccctggcc aggccttcta cgccaccggc gacatcatcg gcgatatcag gcaggcccac 1020

tgcaatgtga gccggaccga gtggaacgag accctgcaga aagtggccaa gcagctgcgg 1080

aagtacttca acaacaagac catcatcttc accaacagca gcggcggcag actgagaatc 1140

accacccaca gcttcaattg tggcggcgag ttcttctact gcaatacctc cggcctgttc 1200

aacagcacct ggaacggcaa cggcaccaag aagaagaaca gcaccgagag caacgacacc 1260

atcaccctgc cctgccggat caagcagatc atcaatatgt ggcagagggt gggccaggcc 1320

atgtacgccc ctcccatcca gggcgtgatc agatgcgaga gcaacatcac cggcctgctg 1380

ctgaccagag atggcggcga caacaacagc aagaacgaga ccttcagacc tggcggcgga 1440

gacatgaggg acaactggcg gagcgagctg tacaagtaca aagtggtgaa gatcgagccc 1500

ctgggcgtgg cccccaccaa ggccaagaga agagtggtgg agcgggagaa gagagctgtg 1560

ggcatcggcg ccgtgttcct gggcttcctg ggagccgccg gaagcaccat gggagccgcc 1620

agcatcaccc tgaccgtgca ggccagacag ctgctgagcg gcattgtgca gcagcagagc 1680

aacctgctga gagccatcga ggcccagcag cacctgctga agctgacagt gtggggcatc 1740

aaacagctgc aggcccgcgt gctggccgtg gagagatacc tgaaggacca gcagctgctg 1800

ggcatctggg gctgcagcgg caagctgatc tgcaccacca acgtgccctg gaatagcagc 1860

tggagcaaca agagccagag cgagatctgg gacaacatga cctggctgca gtgggacaag 1920

gagatcagca actacaccga tatcatctac aacctgatcg aggagagcca gaaccagcag 1980

gagaagaacg agcaggatct gctggccctg gacaagtggg ccaacctgtg gaactggttc 2040

gacatcagca actggctgtg gtacatcaag atcttcatca tgattgtggg cggcctgatc 2100

ggcctgagaa tcgtgttcgc cgtgctgtct gtgtgactcg ag 2142

<210> 6

<211> 709

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Arg Val Met Gly Ile Gln Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg

20 25 30

Trp Gly Thr Met Ile Leu Gly Met Ile Ile Ile Cys Ser Ala Ala Glu

35 40 45

Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala

50 55 60

Glu Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu

65 70 75 80

Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn

85 90 95

Pro Gln Glu Ile Asn Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp

100 105 110

Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp

115 120 125

Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr

130 135 140

Leu Asn Cys Ser Asn Val Asn Val Thr Thr Asn Ile Met Lys Gly Glu

145 150 155 160

Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys

165 170 175

Gln Lys Val Tyr Ser Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Gln Ile Asn

180 185 190

Lys Ser Asn Ser Ser Ser Gln Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser

195 200 205

Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile

210 215 220

His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Lys Asp Lys

225 230 235 240

Glu Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Lys Asn Val Ser Thr Val Gln Cys

245 250 255

Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly

260 265 270

Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Met Ile Arg Ser Glu Asn Ile Thr Asn

275 280 285

Asn Ala Lys Asn Ile Ile Val Gln Leu Thr Lys Pro Val Lys Ile Asn

290 295 300

Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro

305 310 315 320

Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln

325 330 335

Ala His Cys Asn Val Ser Arg Thr Glu Trp Asn Glu Thr Leu Gln Lys

340 345 350

Val Ala Lys Gln Leu Arg Lys Tyr Phe Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe

355 360 365

Thr Asn Ser Ser Gly Gly Arg Leu Arg Ile Thr Thr His Ser Phe Asn

370 375 380

Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly Leu Phe Asn Ser

385 390 395 400

Thr Trp Asn Gly Asn Gly Thr Lys Lys Lys Asn Ser Thr Glu Ser Asn

405 410 415

Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

420 425 430

Gln Arg Val Gly Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Gln Gly Val Ile

435 440 445

Arg Cys Glu Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly

450 455 460

Asp Asn Asn Ser Lys Asn Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met

465 470 475 480

Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile

485 490 495

Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Glu

500 505 510

Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu

515 520 525

Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu Thr Val

530 535 540

Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu

545 550 555 560

Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Lys Leu Thr Val Trp

565 570 575

Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu

580 585 590

Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile

595 600 605

Cys Thr Thr Asn Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Lys Ser Gln

610 615 620

Ser Glu Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Leu Gln Trp Asp Lys Glu Ile

625 630 635 640

Ser Asn Tyr Thr Asp Ile Ile Tyr Asn Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn

645 650 655

Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Asp Leu Leu Ala Leu Asp Lys Trp Ala

660 665 670

Asn Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys

675 680 685

Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu Arg Ile Val Phe

690 695 700

Ala Val Leu Ser Val

705

<210> 7

<211> 2140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 7

ggatccgcca ccatggattg gacctggatt ctgttcctgg tggccgccgc cacaagagtg 60

cacagcagag tgcggggcat cctgagaaat tgccagcagt ggtggatctg gggcattctg 120

gggttctgga tgctgatgat ctgcaacgtg atgggcaacc tgtgggtgac cgtgtactac 180

ggcgtgcctg tgtggaagga ggccaagacc accctgttct gtgccagcga tgccaaggcc 240

tacgagaccg aggtgcacaa tgtgtgggcc acccacgcct gtgtgcccac cgatcccaac 300

cctcaggaga tggtgctgga gaacgtgacc gagaacttca acatgtggaa gaacgacatg 360

gtggaccaga tgcacgagga catcatcagc ctgtgggacc agagcctgaa gccttgcgtg 420

aagctgaccc ctctgtgcgt gaccctgaac tgccggaaca acgtgaacaa caacaacacc 480

atgaaggagg agatcaagaa ctgcagcttc aacatcacca ccgagctgcg ggacaagaag 540

cagaaggtgt acgccctgtt ctaccggctg gacatcgtgc ccctgaacga gaagaacaac 600

agcaacgact accggctgat caactgcaac accagcgcca tcacccaggc ctgtcccaag 660

gtgtccttcg accccatccc catccactat tgtgcccctg ccggctacgc catcctgaag 720

tgcaacaaca agaccttcaa cggcaccggc ccctgcaata atgtgagcac cgtgcagtgt 780

acccacggca tcaagcctgt ggtgtccacc cagctgctgc tgaatggcag cctggccgag 840

gaggagatta tcatccggag cgagaacctg accaacaacg ccaagaccat cattgtgcac 900

ctgaatgaga gcgtggagat cgtgtgtacc cggcccaaca acaatacccg gaagagcatc 960

agaatcggcc ctggccagac cttttacgcc accggcgaca tcatcggcga tatcaggcag 1020

gcccactgca atatcagcga ggagaagtgg aacaagaccc tgcagcgggt gtccgagaag 1080

ctgaaggagc acttccccaa taagaccatc aagttcgccc ctagcagcgg cggcagactg 1140

gagatcacca cccacagctt caactgcagg ggcgagttct tctactgcaa taccagcaag 1200

ctgttcaaca gcacctacat gcccaacagc accaacaata ccaacaccac catcaccctg 1260

ccctgccgga tcaagcagat catcaatatg tggcaggaag tgggcagagc catgtacgcc 1320

cctcccatcg agggcaacat cacctgcaag tccaacatca ccggcctgct gctgacaaga 1380

gatggcggca agaacgacac caatgacacc gagaccttca gacctggcgg cggagacatg 1440

agggacaact ggcggagcga gctgtacaag tacaaggtgg tggagatcaa gcctctgggc 1500

gtggccccta ccaaggccaa gaggagagtg gtggagaggg agaagagagc cgtgggcatc 1560

ggcgccgtgt ttctgggctt tctgggagcc gccggatcta caatgggagc cgccagcatc 1620

acactgaccg tgcaggccag acagctgctg agcggcatcg tgcagcagca gagcaatctg 1680

ctgagagcca tcgaggccca gcagcacatg ctgcagctga cagtgtgggg catcaagcag 1740

ctgcagacca gagtgctggc catcgagcgc tacctgaagg atcagcagct gctgggcatc 1800

tggggctgta gcggcaagct gatctgtacc accgccgtgc cttggaatag cagctggagc 1860

aacaagagcc aggaggacat ctgggacaac atgacctgga tgcagtggga ccgggagatc 1920

agcaactaca ccgacaccat ctacaggctg ctggaggaca gccagaacca gcaggagaag 1980

aacgagaagg acctgctggc cctggacagc tggaagaacc tgtggaactg gttcgacatc 2040

accaactggc tgtggtacat caagatcttc atcatgattg tgggcggcct gatcggcctg 2100

agaatcatct tcgccgtgct gagcatctga tagcggccgc 2140

<210> 8

<211> 705

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Arg Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Cys Gln Gln Trp Trp Ile

20 25 30

Trp Gly Ile Leu Gly Phe Trp Met Leu Met Ile Cys Asn Val Met Gly

35 40 45

Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala

50 55 60

Lys Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu

65 70 75 80

Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn

85 90 95

Pro Gln Glu Met Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp

100 105 110

Lys Asn Asp Met Val Asp Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp

115 120 125

Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr

130 135 140

Leu Asn Cys Arg Asn Asn Val Asn Asn Asn Asn Thr Met Lys Glu Glu

145 150 155 160

Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys

165 170 175

Gln Lys Val Tyr Ala Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Val Pro Leu Asn

180 185 190

Glu Lys Asn Asn Ser Asn Asp Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser

195 200 205

Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Asp Pro Ile Pro Ile

210 215 220

His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys

225 230 235 240

Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Asn Asn Val Ser Thr Val Gln Cys

245 250 255

Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly

260 265 270

Ser Leu Ala Glu Glu Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asn

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val His Leu Asn Glu Ser Val Glu Ile Val

290 295 300

Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro

305 310 315 320

Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln

325 330 335

Ala His Cys Asn Ile Ser Glu Glu Lys Trp Asn Lys Thr Leu Gln Arg

340 345 350

Val Ser Glu Lys Leu Lys Glu His Phe Pro Asn Lys Thr Ile Lys Phe

355 360 365

Ala Pro Ser Ser Gly Gly Arg Leu Glu Ile Thr Thr His Ser Phe Asn

370 375 380

Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Lys Leu Phe Asn Ser

385 390 395 400

Thr Tyr Met Pro Asn Ser Thr Asn Asn Thr Asn Thr Thr Ile Thr Leu

405 410 415

Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Arg

420 425 430

Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn

435 440 445

Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Lys Asn Asp Thr Asn

450 455 460

Asp Thr Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp

465 470 475 480

Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Glu Ile Lys Pro Leu Gly

485 490 495

Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys Arg

500 505 510

Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly

515 520 525

Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln

530 535 540

Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile

545 550 555 560

Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln

565 570 575

Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln

580 585 590

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala

595 600 605

Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Lys Ser Gln Glu Asp Ile Trp

610 615 620

Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Arg Glu Ile Ser Asn Tyr Thr

625 630 635 640

Asp Thr Ile Tyr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys

645 650 655

Asn Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp Ser Trp Lys Asn Leu Trp Asn

660 665 670

Trp Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met

675 680 685

Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu Arg Ile Ile Phe Ala Val Leu Ser

690 695 700

Ile

705

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成的

<400> 9

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5