本發(fā)明涉及用于包封和體內(nèi)藥物遞送的新型聚合物。本發(fā)明的另一方面是用于包括所述聚合物的活性成分(活性劑)的控釋系統(tǒng)。

已知兩親性聚合物在具有疏水性核的水性環(huán)境中以膠粒形式用于包封體系中，其中可捕獲疏水性藥物。

攜帶藥物的膠粒的期望特征是當(dāng)在例如靜脈內(nèi)給藥后在體內(nèi)給藥時(shí)，負(fù)載膠粒的高穩(wěn)定性和藥物的良好保留(血液中的循環(huán)延長)。

在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)開發(fā)了用于在聚合膠粒中藥物的共價(jià)包封的方法。在共價(jià)包封中，活性成分例如藥物分子與聚合物鏈化合鍵合。然而，其缺點(diǎn)是需要進(jìn)行有機(jī)合成以將藥物分子偶聯(lián)至高分子量聚合物鏈(具有隨之而來的挑戰(zhàn))，并且需要為每種藥物分子開發(fā)新的聚合物，這限制了新的聚合物平臺技術(shù)的適用性。共價(jià)包封也可通過交聯(lián)進(jìn)行，但這可具有一些缺點(diǎn)。例如，藥物的釋放必需通過連接藥物和載體的接頭的降解發(fā)生，有時(shí)這難以控制從而導(dǎo)致在目標(biāo)作用點(diǎn)處藥物濃度不足。

即使一些系統(tǒng)在體外顯示良好的穩(wěn)定性，但其可能出現(xiàn)體內(nèi)穩(wěn)定性不足。不希望受任何理論的束縛，假設(shè)一些血清蛋白可能能夠結(jié)合兩親性聚合物分子，其可以破壞膠粒和單聚體(unimers)的動態(tài)平衡。因此，難以預(yù)測特定的體系在體內(nèi)測試中是否會顯示足夠的穩(wěn)定性。

另一個(gè)重要的性質(zhì)是在給藥后藥物在膠粒中的充分保留，這對應(yīng)于包封的藥物在血液中的延長的循環(huán)。許多藥物通常在人體或動物體內(nèi)具有短的半衰期。因此，需要多次每日注射或連續(xù)輸注以具有所需的治療效果。這就是為什么用于控制或持續(xù)釋放的系統(tǒng)對于這種目的是非常理想的。

因此，希望提供一種適用于受控遞送系統(tǒng)以包封特定的疏水性活性成分的聚合物，所述系統(tǒng)在體內(nèi)具有高穩(wěn)定性，并且當(dāng)給藥于體內(nèi)時(shí)顯示良好的藥物保留，并且避免了藥物的共價(jià)包埋的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述需要中的至少一些，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種嵌段共聚物，其包含至少一個(gè)親水性嵌段和至少一個(gè)疏水性嵌段，其中所述疏水性嵌段選自下組：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯基醚和它們的芳族衍生物，其中至少一個(gè)疏水性嵌段含有芳族側(cè)基，其由或通過可降解的接頭與疏水性嵌段結(jié)合，其中所述芳族側(cè)基是芳基。

另一方面，本發(fā)明提供一種包括根據(jù)本發(fā)明的嵌段共聚物和物理包埋的活性成分的控釋系統(tǒng)。

附圖的簡要說明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的加載膠粒的包封效率(％)和加載容量(％)與進(jìn)料的ptx濃度(mg/ml)的關(guān)系圖。ptx是紫杉醇，其被用作模型藥物。

圖2顯示了通過動態(tài)光散射測定的根據(jù)本發(fā)明的加載膠粒的z平均流體動力學(xué)直徑(z平均，nm)和多分散性指數(shù)(pdi)與加載的ptx濃度(mg/ml)的關(guān)系圖。

圖3顯示及時(shí)測量的，在攜帶a431人腫瘤的雌性crl:nu-fox^nu1nu小鼠中靜脈內(nèi)注射四種不同的ptx制劑后ptx的血漿濃度。

圖4顯示了加載ptx的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒的靜脈內(nèi)注射后24小時(shí)，在小鼠不同器官中的注射劑量(id)，單位為％/克器官。

圖5a顯示注射劑量(血液中的％id)與時(shí)間p.i(注射后)(單位為小時(shí))的關(guān)系圖。圖5d顯示腫瘤體積的注射劑量(％id/cm³腫瘤)與注射后時(shí)間(小時(shí))的關(guān)系圖。圖5e顯示了對于小鼠的不同器官的器官體積的注射劑量(％id/cm³器官)。模型藥物是ptx。

圖6顯示在本發(fā)明的膠粒以及比較體系初始處理之后的天數(shù)內(nèi)腫瘤尺寸的發(fā)展，單位為mm³，所述比較體系為空白膠粒和磷酸鹽緩沖的鹽水pbs溶液。

圖7顯示了相對于使用根據(jù)本發(fā)明的用ptx加載的膠粒與比較體系在初始處理之后的天數(shù)作圖的百分比存活率，所述比較系統(tǒng)是空膠粒和磷酸鹽緩沖鹽水pbs溶液。

圖8顯示帶有ptx(15mg/kg和30mg/kg)本發(fā)明的膠粒和比較體系在初始處理后的天數(shù)內(nèi)腫瘤尺寸mda-mb-468異種移植的發(fā)展，單位為mm³，所述比較體系為空白膠粒和磷酸鹽緩沖鹽水pbs溶液。箭頭顯示靜脈內(nèi)注射。

圖9顯示包封的活性劑的化學(xué)式。

圖10顯示mpeg-p(hpmam-bz)和mpeg-b-p(bhmpo)的化學(xué)式。

圖11顯示ph為7.4、6.5和5.0時(shí)對于mpeg-b-p(bhmpo)的空膠粒，通過dls測得的尺寸和光散射強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。

發(fā)明詳述

本發(fā)明基于判斷正確的認(rèn)識，即當(dāng)使用具有芳族側(cè)基的特定聚合物時(shí)，可以增加聚合物膠粒的穩(wěn)定性和物理包埋在所述膠粒中的疏水性藥物的保留。令人驚訝的是，得到了具有在血液中長期循環(huán)的高度穩(wěn)定的膠粒，用于僅物理包埋在所述膠粒中的藥物。不希望受任何理論束縛，發(fā)明人相信聚合物鏈上的芳族側(cè)基提供了增加的與藥物分子的物理結(jié)合，特別當(dāng)藥物分子自身包含芳族基團(tuán)時(shí)，由此產(chǎn)生了聚合物鏈和藥物分子之間的芳香相互作用。聚合物鏈之間的芳香相互作用也有助于其在循環(huán)中的穩(wěn)定性。

在本說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“共聚物”是指存在至少兩種類型單體的聚合物?！皟捎H性”是指同時(shí)具有疏水性和親水性。

術(shù)語“活性成分”包括治療劑和診斷劑。治療劑是能在人體或動物體內(nèi)起到預(yù)防、治療或藥理作用的化合物。預(yù)防或治療作用通常理解為與人體或動物體內(nèi)的細(xì)胞組織相互作用或?qū)ζ渥饔玫挠幸嫘Ч：线m的診斷相關(guān)的活性成分包括用于血管造影、mri、ct掃描成像，核磁共振成像、射線照相、x射線相襯成像、超聲等的那些。特定的診斷活性成分是例如光敏劑、成像劑(例如mri造影劑)、放射性同位素化合物、熒光化合物、染料。

“疏水性”是指在辛烷－水中分配系數(shù)logp高于1。對于logp的定義參見chemicalreviews1971，第71卷，第6期。

本文所用的活性成分分子的“物理”包埋是“非共價(jià)”結(jié)合的同義詞?！胺枪矁r(jià)相互作用”是指不是共價(jià)的任何相互作用，即原子或鍵之間的任何弱結(jié)合，其中所述結(jié)合不包括共享電子對。非共價(jià)相互作用的例子是疏水性相互作用、芳香(π-π)相互作用、氫鍵合相互作用、靜電相互作用、立構(gòu)復(fù)合相互作用和金屬離子相互作用。包埋也用作活性成分的結(jié)合、加載或包封的同義詞。

“接頭”是指具有與分子的不同部分(或構(gòu)成嵌段)(通常為兩部分)連接的功能的化學(xué)基團(tuán)。在本文的上下文中可降解的是指可生物降解的?！翱伤獾摹笔侵缚赏ㄟ^水解降解?！吧?xiàng)l件”是待用本發(fā)明的控釋系統(tǒng)處理的生物體中存在的條件；對于人類，這些條件包括約7.4的ph和約37℃的溫度。

根據(jù)本發(fā)明的共聚物是包括至少一種親水性嵌段和至少一種疏水性嵌段的嵌段共聚物。因此，所述共聚物是兩親性嵌段共聚物。在水性溶液中，這些聚合物形成含有疏水性核的膠粒，其可被加載，具體加載疏水性藥物。本發(fā)明的共聚物適用于在人體或動物體內(nèi)使用的控釋系統(tǒng)、靶向遞送系統(tǒng)和其它系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，這可表示本發(fā)明的共聚物是生物可吸收聚合物，或者所述共聚物在水解之后轉(zhuǎn)化為生物可吸收聚合物，這意味著所述聚合物材料被人體安全地吸收并且其隨時(shí)間從人體中消失。

本發(fā)明的聚合物可具有所有可能的聚合物結(jié)構(gòu)，例如(多)嵌段共聚物(例如ab、aba、abab等)或接枝共聚物、無規(guī)共聚物或三元聚合物，或聚合物網(wǎng)絡(luò)；所有這些可被接枝。

疏水性嵌段包含優(yōu)選自下組的單體：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯基醚和它們的衍生物。更優(yōu)選地，所述疏水性嵌段包含甲基丙烯酰胺或其衍生物，更優(yōu)選為羥烷基甲基丙烯酰胺。對于衍生物，特別優(yōu)選為芳族衍生物，這意味著所述衍生物包含芳族基團(tuán)，更優(yōu)選包含芳基或取代的芳基。優(yōu)選的單體的例子包括甲基丙烯酸-2-羥乙基酯(hema)、丙烯酸-2-羥乙基酯(hea)、甲基丙烯酸甘油酯或甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)、丙烯酸甘油酯或丙烯酸縮水甘油酯(ga)、羥丙基甲基丙烯酰胺(hpmaam)。

本發(fā)明的共聚物的至少一種疏水性嵌段包含芳族側(cè)基，其通過可降解的接頭連接。芳族是指所述側(cè)基含有至少一個(gè)芳環(huán)。芳族包括雜芳基和芳基。雜芳基在至少一個(gè)環(huán)中包含雜原子，例如n或s，并且被任選地取代。芳基在本說明書和權(quán)利要求書中是指通過從環(huán)碳原子中去除一個(gè)氫原子而從對應(yīng)的芳烴衍生得到的單環(huán)或多環(huán)芳族烴基團(tuán)，其被任選地取代。合適的芳族基團(tuán)的例子是苯基、萘基、吲哚基和它們的衍生物。特別合適的芳基的例子是苯基和萘基。芳烷基也適合，例如芳甲基(特別是苯基)和其它在烷基部分中具有c1-c4碳原子的芳烷基。在一些實(shí)施方式中，所述芳族側(cè)基優(yōu)選為芳基或芳烷基。優(yōu)選地，所述芳族基團(tuán)是芐基、苯基或萘基或它們的衍生物，更優(yōu)選為苯基或萘基。

優(yōu)選地，存在的芳族基團(tuán)為形成疏水性嵌段的單體的側(cè)基的大于25mol％，更優(yōu)選至少50mol％。更優(yōu)選地，疏水性嵌段的單體的至少75mol％包含芳族基團(tuán)，最優(yōu)選地疏水性嵌段的單體的100mol％包含芳族基團(tuán)。

在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的共聚物的疏水性嵌段不含有乳酸酯基。乳酸酯基是指單乳酸酯基、二乳酸酯基或低聚乳酸酯(oligolactate)基。乳酸酯可用于為所述共聚物提供熱敏性質(zhì)。含有n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺單乳酸酯作為疏水性嵌段的一部分的熱敏性共聚物在y.shi等，biomacromolecules，2013,14,1826-1837中報(bào)道。然而，當(dāng)本發(fā)明人在體內(nèi)測試這些紫杉醇加載的膠粒時(shí)，他們觀察到藥物的半衰期小于2分鐘，表明這些熱敏膠粒的快速不穩(wěn)定和/或藥物從膠粒的快速釋放。相反，用相同藥物紫杉醇加載的根據(jù)本發(fā)明的膠粒的半衰期為約8小時(shí)。參見本申請的實(shí)施例3和圖3。

在本發(fā)明中，可降解的接頭用于將芳族側(cè)基連接到疏水性嵌段的聚合物主鏈。這確保該基團(tuán)與物理包埋的活性成分一起持續(xù)釋放。所述接頭優(yōu)選是在生理?xiàng)l件下可降解的，更優(yōu)選是所述接頭在生理?xiàng)l件下是可水解的。但所述接頭也可通過酶的作用水解。總體來說，可使用已知接頭，選自酯、原酸酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、酸酐、縮酮、縮醛、腙和它們的衍生物。在一些實(shí)施方式中，使用酯接頭，優(yōu)選為通式–c(o)-o-的接頭。在這種情況中，苯基與酯接頭一起形成苯甲酰基，萘基與酯接頭一起形成萘甲酰基。在其它實(shí)施方式中，使用腙接頭。腙接頭包含基團(tuán)-c＝n-n-。

在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，使用ph敏感的接頭。優(yōu)選地，所述接頭在ph小于7，更優(yōu)選ph為6.5或更低時(shí)水解。

ph敏感性接頭的優(yōu)點(diǎn)是，它可以選擇性地在酸度增加的區(qū)域，例如一些腫瘤或炎癥部位釋放包埋的藥物。在細(xì)胞結(jié)合和載藥的膠粒的內(nèi)化之后，膠粒的降解和包埋藥物的釋放也可在具有較低ph值的核內(nèi)體或溶酶體中發(fā)生。

特別優(yōu)選的是具有以下通式的腙接頭：

其中r1、r2可各自獨(dú)立的為h或烷基，其中r3是烷基或酮基–c(o)-。優(yōu)選地，所述烷基為c1-c3烷基。更優(yōu)選地，r1或r2是甲基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，r3是酮基–c(o)-。

對于本發(fā)明的共聚物的親水性嵌段，可使用任何合適的聚合物。優(yōu)選地，所述親水性嵌段包含聚亞烷基二醇，更優(yōu)選地包含聚乙二醇(peg)。

疏水性嵌段與親水性嵌段的重量比優(yōu)選為10:90-90:10，更優(yōu)選為40:60-60:40。

可通過由單體的混合物開始并進(jìn)行聚合反應(yīng)來制備所述共聚物。優(yōu)選地，通過自由基聚合獲得所述共聚物。也可首先產(chǎn)生共聚物并最終通過偶聯(lián)合適的基團(tuán)來將其官能化。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解共聚物的合成方法。合成單體的合適的方法的例子在y.shi等，biomacromolecules2013,14,1826-1837中闡述?？捎糜诰酆戏磻?yīng)的大分子引發(fā)劑的合成的例子在d.neradovic等，macromolecules，2001,34(22),第7589–7591頁中闡述。

本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式是本發(fā)明的共聚物在控釋系統(tǒng)中或作為控釋系統(tǒng)的使用，所述控釋系統(tǒng)還包括至少一種物理包埋的活性成分。

因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的嵌段共聚物和至少一種物理包埋的活性成分的控釋系統(tǒng)。

優(yōu)選地，所述聚合物為具有疏水性核的聚合物膠粒的形式，并且所述活性成分物理包埋在所述膠粒的疏水性核中。本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物特別適用于形成聚合物膠粒形式的控釋系統(tǒng)。反過來，聚合物膠粒特別適用于疏水性活性成分的包封和控制和靶向釋放，因?yàn)樗鼈兛杀话裨谀z粒的疏水性核中。

本發(fā)明的膠粒還特別適用于靶向藥物遞送；也就是說，它們可以由于epr效應(yīng)(增強(qiáng)的滲透性和保留效應(yīng)；參考maeda,h.；nakamura,h.；fang,j.，advanceddrugdeliveryreviews，2013，65，(1)，71-79)在作用點(diǎn)(例如發(fā)炎的組織)選擇性地累積。

如在實(shí)施例中所證明的那樣，加載有紫杉醇的根據(jù)本發(fā)明的膠粒顯示從膠粒緩慢釋放(約10天內(nèi)釋放加載的50％)，表明藥物在膠粒中的良好保留。膠粒還顯示出長的血液循環(huán)時(shí)間(半衰期約8小時(shí))。加載ptx的膠粒顯示了在小鼠中完全抑制腫瘤生長，而在相等劑量下，商業(yè)使用的ptx的制劑的效果低得多。

本發(fā)明的聚合物膠粒是相當(dāng)單分散的。在一些實(shí)施方式中，膠粒的尺寸為20-100nm。這是指通過動態(tài)光散射測量的z-平均流體動力學(xué)直徑。通過動態(tài)光散射測定，多分散指數(shù)pdi優(yōu)選小于0.3，更優(yōu)選小于0.15。

活性成分優(yōu)選是治療劑或診斷劑。如上所述，可在相同的體系中加載(包埋)更多的活性成分。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，控釋系統(tǒng)包括兩種活性成分。這些可以是例如兩種治療劑，其在組合治療中特別有用，其中幾種藥物同時(shí)給藥。另一個(gè)實(shí)施方式是包含治療劑和診斷劑如成像劑(例如mri造影劑)的系統(tǒng)。

在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選地，所述活性成分分子包含至少一個(gè)芳族基團(tuán)。在這種情況中，觀察到被加載的膠粒特別穩(wěn)定并具有體內(nèi)藥物的高保留。不希望受任何理論束縛，據(jù)信這可以通過聚合物鏈的芳族側(cè)基和藥物分子之間的增強(qiáng)的芳香相互作用來解釋。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，待包埋的活性成分的類型包括但不限于藥物分子，例如(葡萄糖)皮質(zhì)類固醇型或化學(xué)恒定型的藥物分子、肽/蛋白質(zhì)、成像劑、遺傳物質(zhì)或它們的組合。特別地，所述藥物優(yōu)選包括抗癌或細(xì)胞抑制藥物、皮質(zhì)類固醇、抗生素、抗病毒藥物。不同化學(xué)來源的活性成分可以包埋在本發(fā)明的聚合膠粒中。特別地，本發(fā)明有利于包埋具有或不具有芳族基團(tuán)的疏水性活性成分，其通常由于水溶性差而具有顯著困難的遞送問題。不具有芳族基團(tuán)的疏水性活性成分的例子是地塞米松。具有芳族基團(tuán)的疏水性活性成分的例子是貝達(dá)喹啉(bedaquiline)和紫杉醇。要被包封的疏水性活性成分優(yōu)選具有至少1，更優(yōu)選至少1.5的logp?；钚猿煞值乃苄詢?yōu)選小于5mg/ml。

非疏水性活性成分也可被成功地包封，例如帶有電荷的兩親性混合物，如鹽。其例子是鹽酸多柔比星。發(fā)現(xiàn)被成功包埋在本發(fā)明的膠粒中的活性成分的其它例子包括dapt(缺口抑制劑)和環(huán)孢菌素a(免疫抑制劑)。

在該用途特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，控釋系統(tǒng)釋放紫杉醇作為活性成分。

本發(fā)明的控釋系統(tǒng)適用于治療以炎癥和血管通透性增加為特征的疾病。這些疾病包括但不限于選自下組的疾病：癌癥、感染、眼科疾病、病毒感染、細(xì)菌感染、真菌感染、粘膜血漿感染、寄生蟲感染、炎癥、皮膚病、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，自身免疫性疾病、增殖性疾病、關(guān)節(jié)炎、精神病、牛皮癬、糖尿病、代謝紊亂、肺病、呼吸系統(tǒng)疾病、肺部疾病、copd、肌肉骨骼系統(tǒng)疾病、肺氣腫、水腫、激素疾病。本發(fā)明的控釋系統(tǒng)也適用于遞送麻醉劑，用于疫苗接種，是治療或預(yù)防性的。

出于清楚和簡潔的目的，各特征在本發(fā)明中被描述為相同或單獨(dú)的實(shí)施方式的一部分，然而，應(yīng)理解本發(fā)明的范圍可包括具有所有或一些所述特征的組合的實(shí)施方式。

下面通過非限制性實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。除非另有說明，實(shí)施例和說明書中提及的份數(shù)和百分比均由重量表示。在實(shí)施例中，使用malvernalv/cgs-3測角儀，用動態(tài)光散射(dls)測定膠粒的平均粒度(z平均)和多分散指數(shù)(pdi)。用gemini300mhz光譜儀(維安聯(lián)合有限公司(varianassociatesinc.)，nmr儀器，美國加利福尼亞州的帕洛阿爾托市(paloalto，ca，usa))記錄¹h-nmr光譜。

實(shí)施例

實(shí)施例1共聚物合成

使用mpeg2-abcpa作為大分子引發(fā)劑，hpmam-bz作為單體來合成共聚物聚(乙二醇)-b-(n-(2-苯甲酰氧基丙基)甲基丙烯酰胺))(mpeg-b-p(hpmam-bz))。所述單體根據(jù)在y.shi等，biomacromolecules，2013,14,1826-1837中所述的方法合成。苯基通過酯接頭連接至hpma單體。大分子引發(fā)劑合成在d.neradovic等，macromolecules，2001,34(22),第7589–7591頁中闡述。

將單體以0.3g/ml的濃度溶于乙腈(在a4分子篩上干燥)，單體與大分子引發(fā)劑的摩爾比為200/1。通過用氮?dú)鉀_洗將溶液脫氣30分鐘。所述反應(yīng)在氮?dú)鈿夥障略?0℃下進(jìn)行24小時(shí)。聚合物通過在二乙醚中沉淀來純化，并將該溶解/沉淀過程重復(fù)兩次。將聚合物在室溫下真空干燥24小時(shí)，收集為白色粉末。

通過凝膠滲透色譜法(gpc)分析，合成的聚合物的數(shù)均分子量(mn)為20,000da(pdi為mw/mn為1.7)，而通過¹hnmr分析，合成的聚合物的數(shù)均分子量(mn)為22,000da。共聚物中peg的含量為約23重量％(基于nmr分析，peg為5,000da，疏水性嵌段為17,000da)。根據(jù)langmuir，2004,20(21)，第9388-9395頁中報(bào)道的方法，使用芘作為探針測量，聚合物的臨界膠粒濃度(cmc)為1.3μg/ml。

使用mpeg2-abcpa作為大分子引發(fā)劑，使用hpmam-nt作為單體，按照類似的方法制備萘甲酰基衍生物mpeg-b-p(hpmam-nt)。單體與大分子引發(fā)劑的摩爾比為250/1。

實(shí)施例2膠粒的制備

按照以下方法制備空mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒。將mpeg-b-p(hpmam-bz)以27mg/ml的濃度溶解在thf中，隨后在攪拌下將1ml聚合物溶液滴加到1ml反滲透(ro)水中。將混合物在室溫下孵育48小時(shí)以使thf蒸發(fā)。通過0.45μm尼龍膜過濾得到的膠粒分散體。

通過以下方法制備加載紫杉醇(ptx)的膠粒。將ptx和mpeg-b-p(hpmam-bz)(結(jié)構(gòu)如圖10所示)溶解在thf中，ptx濃度為3-12mg/ml，聚合物濃度為27mg/ml。在攪拌下將1ml聚合物溶液滴加入1ml反滲透(ro)水中。將混合物在室溫下孵育48小時(shí)以使thf蒸發(fā)。通過0.45μm尼龍膜過濾得到的膠粒分散體。

根據(jù)y.shi等，biomacromolecules，2013,14,1826-1837中描述的方法進(jìn)行加載ptx的膠粒的加載容量、包埋效率、尺寸和尺寸分布(dpi)的測量。結(jié)果見圖1和2。

圖1顯示了加載膠粒的包封效率(％)和加載容量(％)與進(jìn)料的ptx濃度(mg/ml)的關(guān)系圖。

圖2顯示了通過動態(tài)光散射測定的加載膠粒的z平均流體動力學(xué)直徑(z平均，nm)和多分散性指數(shù)(pdi)與加載的ptx濃度(mg/ml)的關(guān)系圖。從圖中可以看出，本發(fā)明的聚合物膠粒是相當(dāng)單分散的，優(yōu)選具有約70-100nm的尺寸，多分散指數(shù)pdi小于0.15。

結(jié)果表明，ptx的進(jìn)料濃度最高達(dá)10mg/ml，藥物包封效率非常好(>80％)，使得在進(jìn)料濃度為10mg/ml下得到具有高藥物加載(約25％(w/w))的制劑。

實(shí)施例3體內(nèi)研究

人a431腫瘤異種移植通過皮下接種建立在小鼠右側(cè)腋下，1×106的a431細(xì)胞懸浮于100μlpbs，ph7.4中。使用數(shù)字卡尺測量腫瘤。使用公式v＝計(jì)算腫瘤體積v，單位為mm³，其中l(wèi)是最大表面直徑，s是最小表面直徑。當(dāng)腫瘤達(dá)到80-100mm³的體積時(shí)，將小鼠納入研究中。通過尾靜脈向小鼠注射100μl加載有ptx的膠粒(3.2mg/mlptx和27mg/ml聚合物)。

在攜帶a431人腫瘤的雌性crl:nu-fox^nu1nu小鼠(22.5±2.5g)，小鼠(n＝7-8)中靜脈內(nèi)注射不同的ptx制劑后ptx的血漿濃度。

四種制劑包括根據(jù)實(shí)施例2得到的加載ptx的本發(fā)明的膠粒mpeg-b-p(hpmam-bz)和三種比較制劑，分別是在熱敏性膠粒的mpeg-b-p(hpmam-bz30-共聚-hpmam-lac70)和mpeg-b-p(hpmam-nt25-共聚-hpmam-lac75)中加載的ptx，以及市售的結(jié)果示于圖3。

如圖3中所看到的，在注射后24小時(shí)，來自接受或熱敏mpeg-b-p(hpmam-bz/nt-共聚-hpmam-lac)膠粒的小鼠的血樣中的ptx濃度低于檢測極限(<0.6μg/ml血漿)。據(jù)估計(jì)，作為熱敏膠粒制劑給藥的藥物的半衰期小于2分鐘。

可以得出結(jié)論，根據(jù)本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物形成穩(wěn)定的膠粒，其具有優(yōu)異的加載的ptx的保留性。

圖4顯示了加載ptx的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒的靜脈內(nèi)注射后24小時(shí)，在小鼠不同器官中的注射劑量(id)，單位為％/克器官。接受和加載ptx的熱敏mpeg-b-p(hpmam-bz/nt-共聚-hpmam-lac)膠粒的小鼠的器官(腫瘤、肺、心臟、肝臟、腎臟和脾臟)中的ptx濃度低于檢測極限(<0.4id％/克器官)(n＝8)。

實(shí)施例4體內(nèi)動力學(xué)研究

在該實(shí)施例中，使用熒光團(tuán)標(biāo)記cy7和cy5.5在體內(nèi)研究具有ptx的加載膠粒的動力學(xué)性質(zhì)。cy7與聚合物鏈共價(jià)連接并報(bào)告注射的膠粒的命運(yùn)；cy5.5物理加載在膠粒的核中并用作模式藥物。

根據(jù)實(shí)施例1，相對于在聚合物的疏水嵌段中共聚的hpmam-bz，用2mol％的aemam(n-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽)合成mpeg-b-p(hpmam-bz-共聚-aemam)。隨后將mpeg-b-p(hpmam-bz-共聚-aemam)的伯胺側(cè)基與cy7nhs酯反應(yīng)。為此，將cy7nhs酯溶解于dmso(在4埃分子篩上干燥)，濃度為10mg/ml。將聚合物(31mg)轉(zhuǎn)移到干燥的燒瓶中，加入0.18mlcy7nhs酯溶液(10mg/ml)和1μl的tea(在4埃分子篩上干燥)，反應(yīng)在50℃下進(jìn)行48小時(shí)。通過用thf/水(1/1，v/v)透析除去未偶聯(lián)的cy7，24小時(shí)后刷新透析液總共5次。冷凍干燥后收集最終產(chǎn)物，凍干后作為深綠色粉末收集。

與實(shí)施例2中描述的加載ptx的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒類似地制備用cy7化學(xué)標(biāo)記并用cy5.5物理加載的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒。簡言之，在攪拌下，將26.6mg未標(biāo)記的mpeg-b-p(hpmam-bz)，0.4mgcy7標(biāo)記的mpeg-b-p(hpmam-bz)和0.02mgcy5.5(作為物理加載的模式藥物)的1mlthf溶液滴加到1ml水中。將膠粒分散體在室溫下孵育48小時(shí)以使thf蒸發(fā)。隨后，通過0.45μm尼龍膜過濾得到的膠粒分散體。

cd-1裸雌性小鼠(n＝5)自由喂食無葉綠素食物顆粒和水，籠養(yǎng)在通風(fēng)籠和臨床控制的房間和大氣中。動物研究按照國家規(guī)定制定的指導(dǎo)方針進(jìn)行，經(jīng)當(dāng)?shù)貏游飳?shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)開始前15天，將cd-1裸小鼠皮下接種a431腫瘤細(xì)胞(4×10⁶細(xì)胞/100μlpbs，ph7.4)至右側(cè)腋下，致使a431腫瘤異種移植物發(fā)展，其大致尺寸為寬6-7mm。

圖5顯示了用cy5.5(n＝5)作為模式藥物加載的cy7標(biāo)記的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒的循環(huán)動力學(xué)、腫瘤積聚和體內(nèi)生物分布。在圖5a中，顯示了注射劑量(血液中的％id)與時(shí)間p.i(注射后)(單位為小時(shí))的關(guān)系圖。在圖5d中，顯示了對于腫瘤體積的注射劑量(％id/cm³腫瘤)與注射后時(shí)間(小時(shí))的關(guān)系圖。圖5e顯示了對于小鼠的不同器官的器官體積的注射劑量(％id/cm³器官)。模型藥物是cy5.5。

由于cy7標(biāo)簽與聚合物共價(jià)連接，因此報(bào)告了注射膠粒的命運(yùn)。很明顯，根據(jù)ptx的血漿動力學(xué)數(shù)據(jù)(圖3)，膠粒的半衰期約為8小時(shí)。cy5.5標(biāo)簽顯示較短的半衰期，最有可能是因?yàn)樵摶衔锔哂H水性，因此在膠粒中的保留比ptx少。

圖6顯示了在初始治療后的幾天中腫瘤尺寸的發(fā)展以mm³表示。較低的兩條曲線表示用ptx加載的本發(fā)明膠粒的數(shù)據(jù)。另外三條曲線提供了作為比較數(shù)據(jù)的用市售空膠粒和pbs獲得的數(shù)據(jù)。

在雌性crl:nu-fox^nu1nu小鼠(22.5±2.5g)中生長的人a431腫瘤用pbs、空mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒、(15mg/kgptx)和加載ptx的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒(15和30mg/kgptx)(上)(n＝12)的靜脈內(nèi)注射處理。之后，繪制了用ptx制劑或陰性對照(n＝12)處理的攜帶a431腫瘤的小鼠的卡普蘭-邁耶生存曲線(圖7)。

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明和比較系統(tǒng)，對具有ptx的加載膠粒初始處理后的天數(shù)繪制的百分比存活率圖。

結(jié)果表明，聚合物膠粒制劑的治療效果令人印象深刻。對于接受高劑量膠粒制劑(30mgptx/kg)的動物，在36天觀察到完全腫瘤消退。此外，低劑量膠粒制劑(15mgptx/kg)顯示比相等劑量的市售制劑顯著且更好的抗腫瘤效果。

實(shí)施例5體內(nèi)研究，緩慢生長的腫瘤

與實(shí)施例4類似，在攜帶mda-mb-468乳腺癌異種移植物的小鼠中研究了加載ptx的mpeg-b-p(hpmam-bz)膠粒的治療功效。在本研究中，小鼠接受與a431研究(實(shí)施例4)類似的處理，但是靜脈內(nèi)注射每周一次，而不是每隔一天注射一次。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100mm³時(shí)，在腫瘤細(xì)胞接種后4周開始治療。

圖8顯示了在初始治療后的幾天中腫瘤尺寸的發(fā)展以mm³表示。較低的兩條曲線表示用ptx加載的本發(fā)明膠粒的數(shù)據(jù)。另外三條曲線提供了作為比較數(shù)據(jù)的用市售空膠粒和pbs獲得的數(shù)據(jù)。箭頭表示靜脈內(nèi)注射。

圖8顯示，(15mg/kgptx)僅略微抑制腫瘤生長，而接受加載ptx的膠粒(15和30mg/kgptx)的小鼠的腫瘤體積減少并在60天后完全消退。這些結(jié)果證實(shí)了在用a431作為腫瘤模型的研究中觀察到的加載ptx的聚合物膠粒的強(qiáng)治療功效。

加載ptx的聚合物膠粒的重復(fù)注射通常耐受性良好，并且小鼠在治療功效研究的整個(gè)過程中沒有顯著的體重減輕。此外，通過組織病理學(xué)分析代表性地評估肝臟、脾臟和腎臟，沒有觀察到空的或加載ptx的聚合物膠粒的器官毒性。這些觀察結(jié)果表明所述膠粒制劑具有有利的毒性特征。

如這些實(shí)施例所示，本發(fā)明的控釋系統(tǒng)是用于開發(fā)ptx-納米藥物的有吸引力的載體系統(tǒng)。聚合物膠粒以直接和成本有效的方式生產(chǎn)，而不需要化學(xué)交聯(lián)或共價(jià)藥物偶聯(lián)，并且其特征在于優(yōu)異的加載容量、增強(qiáng)的穩(wěn)定性和強(qiáng)的ptx保留性。對于a431和mda-mb-468細(xì)胞，膠粒ptx的ic50值與游離藥物(即)的ic50值相當(dāng)，表明ptx的效力不受包封影響。膠粒特征確保了在兩種已知和常規(guī)使用的異種移植模型(即a431和mda-mb-468)中延長的循環(huán)動力學(xué)、大量腫瘤積聚和有效的腫瘤消退，而不會引起顯著的毒性，從而證實(shí)了所述制劑的治療(和轉(zhuǎn)化)的可能性。

實(shí)施例6不同活性劑的包封

根據(jù)包封方法來包封下列不同的藥物：地塞米松、鹽酸多柔比星(dox.hcl)、貝達(dá)喹啉、dapt和環(huán)孢霉素a。使用的聚合物是mpeg-b-p(hpmam-bz)，批號為j01(mn48.000，[單體]/[引發(fā)劑]＝600/1)和j02(mn59.000，[單體]/[引發(fā)劑]＝1000/1)，和j03為mpeg-b-p(hpmam-nt)250(mn32.000，[單體]/[引發(fā)劑]＝250/1)。通過nmr測得分子量mn?；钚詣┑幕瘜W(xué)式在圖9中顯示。

加載藥物的膠粒制劑的制備：在攪拌下將溶解有5mg聚合物和1mg藥物/候選藥物的1ml四氫呋喃滴加入1ml反滲透(ro)水中，并將所述混合物再保持?jǐn)嚢?分鐘。將所述混合物放置在通風(fēng)櫥中過夜以蒸發(fā)四氫呋喃。通過0.45μm膜過濾載藥的膠粒分散體(除了dox制劑)，并通過dls(形成的膠粒的尺寸)分析過濾物并將過濾物溶解在乙腈中(將1體積的膠粒分散體加入到19體積的乙腈中)以用于通過紫外-可見光譜測量封裝效率(ee)和加載容量(lc)(除了通過hpcl分析的紫杉醇以外的所有藥物)。對于加載dox.hcl的膠粒，使用vivaspin管在10000g下將所述制劑離心5分鐘，并通過紫外-可見光譜法定量過濾物中的未加載的藥物以計(jì)算ee和lc。結(jié)果示于表1。

表1

該表顯示，具有l(wèi)ogp>1的藥物和候選藥物可以被成功地加載到具有高ee和lc的聚合物膠粒中。這些包括具有芳香族基團(tuán)的藥物(ptx、貝達(dá)喹啉、dox.hcl、dapt和伊馬替尼游離堿)，無芳香族基團(tuán)的疏水性藥物(地塞米松和環(huán)孢菌素a)，具有芳族基團(tuán)的藥物(候選物)以及具有帶電荷的基團(tuán)的藥物(dox.hcl，伊馬替尼游離堿和苯乙胺)。除了具有不同分子量的苯甲?；木酆衔镏?，該表顯示用萘基改性的聚合物(peg-p(hpmam-nt)250)對紫杉醇的良好ee和lc。

實(shí)施例7ph敏感的膠粒

1-[2-(2-苯甲酰肼叉)丙基氨基]-2-甲基-2-丙-1-酮(bhmpo)的合成

在180℃下干燥過夜的燒瓶中，在氮?dú)夥罩性谑覝叵?，?-(丙酮基氨基)-2-甲基-2-丙-1-酮(ampo，677mg，4.8mmol)和4-甲氧基苯酚(聚合抑制劑，6mg；0.05mmol)溶解在146ml甲醇(在a4分子篩上干燥)中。根據(jù)acsbiomater.sci.eng.,2015,1(6)，第393–404頁中所述的方法合成ampo。在該溶液中加入bh(626mg，4.6mmol)。攪拌5分鐘后，將7.5ml冰醋酸加入到所述溶液中，并在室溫下在氮?dú)鈿夥罩斜３謹(jǐn)嚢柙摲磻?yīng)24小時(shí)。在減壓下除去溶劑，并用己烷/乙酸乙酯(1/9，v/v)的洗脫液通過硅膠柱色譜(40g)純化粗產(chǎn)物。收集含有rf為0.4的化合物(己烷/乙酸乙酯(1/1，v/v))的組分，并減壓除去溶劑。收集最終產(chǎn)物為黃色粉末，產(chǎn)率為834mg(71％)，熔點(diǎn)為164℃，用差示掃描量熱法(discovery，ta儀器公司)測定。使用gemini300mhz光譜儀(維安聯(lián)合有限公司，nmr儀器，美國加利福尼亞州的帕洛阿爾托市)通過¹hnmr分析證實(shí)該結(jié)構(gòu)，使用dmso-d6作為溶劑；使用2.52ppm處的dmso峰作為參考線。化學(xué)位移(dmso-d6)：11.3(s,c＝n-nh-co)，8.7(t,co-nh-ch2)，7.9(d,2h，芳族ch),7.5(m,3h,芳族ch)，5.7和5.4(s,ch2＝c)，4.0(d,nh-ch2-c)，2.0(s,ch3-c＝c)，1.9(s,ch2-c(ch3)＝n)。

mpeg-b-p(bhmpo)的合成

通過大分子引發(fā)劑途徑，使用mpeg2-abcpa作為大分子引發(fā)劑，bhmpo作為單體合成mpeg-b-p(bhmpo)的嵌段共聚物。將單體以0.3g/ml的濃度溶于dmso(在a4分子篩上干燥)，單體與大分子引發(fā)劑的摩爾比為200/1。通過用氮?dú)鉀_洗將溶液脫氣30分鐘。所述反應(yīng)在氮?dú)鈿夥障略?0℃下進(jìn)行24小時(shí)。聚合物通過在二乙醚中沉淀來純化，并將該溶解/沉淀過程重復(fù)兩次。將聚合物在室溫下真空干燥24小時(shí)，收集為淡黃色粉末。

制劑制備

通過以下方法制備紫杉醇(ptx)加載的mpeg-b-p(bhmpo)(通過nmr測得23kda；結(jié)構(gòu)在圖10中顯示)膠粒：在攪拌下，將1ml在thf/meoh(＝四氫呋喃/甲醇)(1/1，v/v)中的ptx(4mg)和聚合物(27mg)的溶液滴加到1mlro水中，將10μl磷酸鹽緩沖液ph7.4(1m)加入到混合物中以將ph調(diào)節(jié)至7.4。將膠粒分散體在室溫下孵育24小時(shí)以蒸發(fā)有機(jī)溶劑。隨后，通過0.45μm膜過濾所述膠粒分散體。用動態(tài)光散射分析測定形成的膠粒的尺寸并通過hplc測定ptx加載。測得的ptx濃度為3.3mg/ml，包封效率(ee)為83％，粒度為83nm，pdi為0.08。

空mpeg-b-p(bhmpo)膠粒的ph依賴穩(wěn)定性

使用上述方法制備空mpeg-b-p(bhmpo)膠粒而不加入ptx。通過分別在ph5.0的150mm乙酸銨緩沖液或ph6.5的nah2po4緩沖液中將膠粒稀釋5倍，將膠粒分散體的ph調(diào)節(jié)至5.0或6.5。通過由dls監(jiān)測膠粒的尺寸和光散射強(qiáng)度，研究了在37℃和不同ph值下空mpeg-b-p(bhmpo)膠粒的ph依賴穩(wěn)定性。結(jié)果示于圖11。

如圖11所示，苯甲?；途酆衔镏麈溨g的腙鍵對酸性ph值(6.5和5.0)敏感，而在中性ph(7.4)下穩(wěn)定。因此，預(yù)期膠粒在血液循環(huán)中是穩(wěn)定的，并且在腫瘤組織和細(xì)胞中特異性降解，由此可釋放加載在膠粒中的ptx以殺死腫瘤細(xì)胞。