本申請(qǐng)要求于2014年7月8日在美國專利和商標(biāo)局提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枮?2/022,026的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。領(lǐng)域本發(fā)明的實(shí)施方案一般涉及人胰島素和/或人胰島素類似物的肺部遞送，以及用于微?；┓尾窟f送的人胰島素和/或人胰島素類似物的工藝。本公開文本的實(shí)施方案方面一般還涉及包含具有改進(jìn)的顆粒特性的微?；艘葝u素和/或微?；艘葝u素類似物的組合物。背景已經(jīng)越來越注意到用于非侵入性給藥和全身施用治療制劑(主要是肽和蛋白質(zhì))的肺吸收途徑的潛力，因?yàn)榉文軌蛱峁┐蟮奈毡砻娣e(高達(dá)100m2)以及具有非常或極其薄的吸收性粘膜(例如，具有約0.1μm-0.2μm的厚度)，并且具有良好的血液供給。肺表面上的非常薄的肺泡毛細(xì)管和支氣管毛細(xì)血管屏障允許人胰島素顆粒被快速吸收到受試者的血流中，速度類似于用速效人胰島素類似物實(shí)現(xiàn)的速度，速效人胰島素類似物是人胰島素的改變形式，不同于自然發(fā)生的人胰島素，但仍以類似于人胰島素的方式在人體中起作用，但在血糖控制方面具有更好的性能。胰島素制劑可以通過皮下或靜脈內(nèi)注射施用。吸入型胰島素似乎與注射短效胰島素一樣有效。發(fā)展了肺部遞送技術(shù)以便吸入型胰島素可有效地到達(dá)其被吸收的位置是肺毛細(xì)血管。人肺氣道含有支氣管，其對(duì)胰島素以及肺泡是不可滲透的。吸入型胰島素可通過肺泡吸收并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。吸入型哮喘藥物在到達(dá)肺泡之前沉積。裝置可以通過緩慢均勻地呼吸將人胰島素顆粒遞送到肺泡中，以及人胰島素可被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。吸入型人胰島素可以用于I型和/或II型糖尿病患者的餐前胰島素遞送。它的使用還可以促進(jìn)對(duì)由于反應(yīng)(例如炎癥、瘀傷、焦慮等)而厭惡胰島素注射的人的胰島素治療的早期引入。簡述根據(jù)本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施方案，制備適合于肺部遞送的可吸入人胰島素的方法包括：將胰島素原材料溶解在酸性溶液中以形成溶解的人胰島素溶液；用緩沖溶液滴定溶解的胰島素溶液以形成包含微?；葝u素顆粒的懸浮液；以及穩(wěn)定所述微?；葝u素顆粒。所述酸性溶液可以包括水、有機(jī)溶劑或其混合物?；谒嵝匀芤旱目傮w積計(jì)，所述酸性溶液可以包括含量為10體積％至90體積％的所述有機(jī)溶劑。所述酸性溶液可以包括含量大于酸性溶液總體積的0體積％至90體積％的所述有機(jī)溶劑。所述有機(jī)溶劑可以包括醇。所述醇可以包括甲醇、乙醇或其混合物。所述緩沖溶液可以具有3至10的pH。所述穩(wěn)定微?；葝u素顆粒可以包括向懸浮液中添加穩(wěn)定制劑。所述穩(wěn)定制劑可以具有中性pH，且可以與水是混溶的。所述穩(wěn)定制劑可以包括醇、酮或其混合物。所述穩(wěn)定可以增加微?；葝u素顆粒的產(chǎn)量。所述微?；葝u素顆粒可以在3至9的pH下制備。所述微?；葝u素顆?？梢栽?.5至7.5的pH下制備。所述微粒化胰島素顆?？梢园w積平均直徑為約1.2至2μm的大致上球形的顆粒?；谒鑫⒘；葝u素顆粒的總體積計(jì)，所述微粒化胰島素顆?？梢园ǜ哌_(dá)99體積％的粒徑小于5μm的顆粒。所述酸性溶液可以具有1.0至3.0的pH范圍。例如，所述酸性溶液可以具有1.8至2.2的pH范圍。所述酸性溶液可以具有約2的pH，且可以包括水和基于酸性溶液的總體積計(jì)的10體積％至90體積％的包括甲醇、乙醇或其混合物的有機(jī)溶劑。所述微?；葝u素顆?？梢詾榇笾律锨蛐蔚男螤?，且可以具有小于5μm的粒徑。所述微?；葝u素顆粒可以包括胰島素(包括人胰島素、動(dòng)物胰島素、胰島素類似物或其混合物)。所述胰島素類似物可以包括門冬胰島素、甘精胰島素或其混合物。所述溶解、所述滴定和/或所述穩(wěn)定步驟可以在室溫下進(jìn)行。所述胰島素原材料可以包括結(jié)晶胰島素(包括結(jié)晶人胰島素、結(jié)晶動(dòng)物胰島素、結(jié)晶胰島素類似物或其混合物)。結(jié)晶胰島素類似物可以包括結(jié)晶門冬胰島素、結(jié)晶甘精胰島素或其混合物。根據(jù)本公開文本的實(shí)施方案，所述微?；葝u素顆粒包括大致上球形的包含選自人胰島素、動(dòng)物胰島素、胰島素類似物及其混合物的胰島素的顆粒。所述大致上球形的顆?？梢跃哂屑s1.2μm至2μm的體積平均直徑。基于微?；葝u素顆粒的總體積計(jì)，高達(dá)99體積％的大致上球形的顆?？梢跃哂行∮?μm的顆粒尺寸。所述胰島素類似物可包括門冬胰島素、甘精胰島素或其混合物。本公開文本實(shí)施方案的前述描述不意指為詳盡的概述，因?yàn)閺囊韵略敿?xì)描述中，本發(fā)明公開的另外相關(guān)方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，獨(dú)立地或與附圖和表格結(jié)合，其中描述和示出了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。附圖說明所附附圖與說明書一起闡明本發(fā)明公開的實(shí)施方案，并且與描述一起用于解釋本發(fā)明公開的原理。圖1是說明用于微粒化胰島素和/或胰島素類似物的工藝的實(shí)施方案的流程圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的微?；艘葝u素顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖3是示出根據(jù)圖1的實(shí)施方案制備的微粒化人胰島素顆粒的粒度分布的圖。圖4是示出了根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方式微粒化前后的人胰島素雜質(zhì)分布的圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的溶解的微粒化胰島素顆粒的高效液相色譜(HPLC)色譜圖。圖6和圖7的圖表顯示了來自根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的填充罐所遞送的人胰島素顆粒的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器研究的數(shù)據(jù)。圖8是根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的微?；示葝u素顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖9是根據(jù)圖1的實(shí)施方案制備的溶解的微粒化甘精胰島素顆粒的HPLC色譜圖。圖10和11的圖表顯示了根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的填充罐所遞送的甘精胰島素的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器研究的結(jié)果。圖12是根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的微?；T冬胰島素顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖13是根據(jù)圖1的實(shí)施方案制備的溶解的微?；T冬胰島素顆粒的HPLC色譜圖。圖14和圖15的圖表顯示了來自根據(jù)本發(fā)明公開的實(shí)施方案制備的填充罐所遞送的門冬胰島素顆粒的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器研究的結(jié)果。圖16是根據(jù)噴射研磨法制備的人胰島素顆粒的原子力顯微鏡(AFM)圖像。圖17是如根據(jù)實(shí)施例2所述制備的微?；葝u素顆粒的原子力顯微鏡(AFM)圖像。詳細(xì)說明以下所提供的詳細(xì)描述僅是為了說明本發(fā)明公開的某些特定實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。替代實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并意在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語“胰島素”在廣義上使用并包括可用于治療人或動(dòng)物的任何形式的胰島素或胰島素類似物。例如，本文所用的術(shù)語“胰島素”包括天然或合成的人胰島素、天然或合成的動(dòng)物胰島素和胰島素類似物(例如門冬胰島素、甘精胰島諸如此類)。制備用于肺部遞送的可吸入胰島素顆粒的微?；^程的實(shí)施方案包括：在酸性環(huán)境(例如在酸性溶液中溶解以促進(jìn)胰島素原材料的溶解)中溶解胰島素原材料(例如結(jié)晶胰島素和/或結(jié)晶胰島素類似物)以形成溶解的胰島素溶液；用緩沖溶液滴定溶解的胰島素溶液以形成包括微?；葝u素顆粒的懸浮液；以及添加穩(wěn)定制劑(例如有機(jī)溶劑和/或共溶劑)以穩(wěn)定微粒化胰島素顆粒(例如在純化和干燥之前增加微?；葝u素顆粒的產(chǎn)量)。該過程的實(shí)施方案在室溫下進(jìn)行，并避免或減少引入熱量和/或機(jī)械力，諸如通過凍干、微球和噴射研磨法引入的那些。進(jìn)行該過程的一些實(shí)施方案中不向酸性環(huán)境添加聚合物(例如輔料聚合物)，包括溶解的胰島素溶液和/或懸浮液。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了適合于肺部遞送的可吸入胰島素的生產(chǎn)工藝。該工藝實(shí)施方案利用可以具有毫米范圍的粒徑的原始結(jié)晶胰島素，以提供作為用于肺部遞送的活性藥物成分(API)的具有微米范圍的顆粒尺寸的可吸入胰島素顆粒，具有改進(jìn)的特性，包括更加的球形的形狀以及改進(jìn)的平滑度。如本文所述，除非另有說明，粒徑或顆粒直徑(例如體積平均直徑)可以通過激光衍射法測量。藥物顆粒的肺部遞送受藥物顆粒的特性影響，藥物顆粒的特性包括顆粒大小、顆粒形狀、表面粗糙度、溶解度、流動(dòng)性和/或諸如此類。由于可吸入胰島素和/或胰島素類似物是活性藥物成分，而不僅僅是被動(dòng)載體，本發(fā)明公開的實(shí)施方案在微?；葝u素和胰島素類似物同時(shí)維持或大致上維持了生物活性。具有＜5μm的粒徑(或空氣動(dòng)力學(xué)直徑)的顆粒允許所吸入的藥物被肺吸收。具有合適的空氣動(dòng)力學(xué)直徑或顆粒尺寸的顆粒具有良好的流動(dòng)性能，以及更容易分散到下呼吸道(支氣管區(qū)和肺泡區(qū))中，在該處通過肺的肺泡毛細(xì)管表面吸收進(jìn)入血流得到改善或優(yōu)化。另一方面，過大尺寸的藥物顆粒(例如，具有空氣動(dòng)力學(xué)直徑或粒徑＞5μm的顆粒)將主要在上呼吸道諸如咽喉和氣管中通過慣性碰撞而被捕獲。過大尺寸的顆粒大致上不被吸收，因?yàn)樗鼈冊谏虾粑乐欣鄯e，該上呼吸道不具有薄的可穿透的肺泡毛細(xì)血管。累積的藥物顆?？赡苡|發(fā)肺部防御系統(tǒng)，這可能促使巨噬細(xì)胞增加。刺激或過度刺激巨噬細(xì)胞可能導(dǎo)致其它炎性細(xì)胞的募集并可能最終引起次生組織損傷、再生和纖維化。藥物粒徑可在肺部遞送中起決定性作用。為了制造粒徑＜5μm的顆粒，可以使用多種的一步微粒化方法諸如噴霧干燥和機(jī)械研磨技術(shù)，這樣使得起始的原胰島素粉末顆粒在加工后(其一般具有毫米范圍的直徑)具有用于肺部遞送的微米范圍的直徑。然而，用于微?；葝u素顆粒的那些工藝涉及在胰島素微?；庸て陂g引入熱量和/或輔料聚合物，這可能引起胰島素的聚集和喪失活性，并且可能阻礙藥物制造。此外，盡管輔料聚合物有助于穩(wěn)定制劑并增加加工期間的溶解度，但是輔料聚合物可能引入難以去除的雜質(zhì)。凍干處理可用于將胰島素顆粒從毫米尺寸范圍(例如原始胰島素)轉(zhuǎn)化為微米尺寸范圍。使用冷凍的一個(gè)原因在于1-5μm范圍內(nèi)的顆粒的生產(chǎn)是該方法的尺寸減縮能力的極限。聚合物也可以作為惰性物質(zhì)或輔料引入制劑中以改進(jìn)穩(wěn)定性和溶解度。然而，凍干微?；に嚳赡軐?duì)大分子諸如胰島素具有潛在危害。例如，在凍干加工期間，向分子供應(yīng)熱量以升華水，這可能導(dǎo)致胰島素的構(gòu)象改變，甚至可能使胰島素變性。此外，限定凍干工藝(多溫過程)的冷卻速率以控制微粒的尺寸和形狀，但是所述凍干法可能導(dǎo)致由胰島素和聚合物形成的胰島素微粒過度干燥，并且可導(dǎo)致化學(xué)或物理穩(wěn)定性降低。胰島素還更易于在干燥粉末狀態(tài)下聚集。另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聚合物用在形成胰島素微粒的工藝中時(shí)，胰島素微粒通過在接近胰島素等電點(diǎn)的pH下溶解結(jié)晶胰島素而形成。各種合適類型的聚合物諸如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA.)以及生物粘附機(jī)制可用于該工藝。當(dāng)將聚合物添加到緩沖溶液中時(shí)，它可幫助進(jìn)一步增加結(jié)晶胰島素的溶解度。然而，在加工后所添加的聚合物可能不能被有效、完全地去除。未去除的殘留聚合物可降低藥物效力，增加毒性，并增加雜質(zhì)水平。其它涉及含有胰島素的微球的生產(chǎn)工藝引入輔料聚合物諸如PVP或PEG以幫助在酸性環(huán)境中溶解胰島素。由這種工藝生產(chǎn)的微球暴露于可能危險(xiǎn)或損害胰島素的相對(duì)高的溫度下。這樣的加工結(jié)束時(shí)，用于洗滌聚合物的有機(jī)溶劑(其對(duì)胰島素具有低溶解度)可能引起小胰島素顆粒的聚集。此外，前述有機(jī)溶劑可使微球中包含的胰島素分子變性，并且當(dāng)施用于人或動(dòng)物時(shí)也可能有毒。除了本發(fā)明公開的實(shí)施方案的那些之外，胰島素微粒的制造過程利用有機(jī)溶劑，并且需要苛刻的滅菌條件。所述有機(jī)溶劑(除了本發(fā)明公開的那些之外)可能影響藥物純度，如果殘留的有機(jī)溶劑保留在微球中，則可能在體內(nèi)是有害的。此外，由有機(jī)溶劑引起的多孔結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致釋放劑量不一致。通過熱、化學(xué)或輻射處理的滅菌可能引起聚合物和/或包封在微球中的藥物降解。滅菌溶液也可增加存在的雜質(zhì)的量。胰島素控釋制劑可含有微球，該微球是使用可生物降解聚合物材料通過微囊化胰島素的均勻微晶(例如經(jīng)由表面活性劑)獲得的。然而，這樣的組合物可具有低的胰島素含量，例如，基于胰島素顆粒的總重量，平均的胰島素顆粒可含有小于10％w/w。本發(fā)明公開的實(shí)施方案致力于克服上述困難。制備可吸入胰島素或胰島素類似物的方法的實(shí)施方案可包括以下三(3)步措施：(1)在酸性環(huán)境中溶解胰島素原料(例如結(jié)晶胰島素或胰島素類似物)以促進(jìn)胰島素原料的溶解，從而形成溶解的胰島素溶液。酸性環(huán)境可以包括酸性溶液。例如，酸性環(huán)境可以包括含有水、有機(jī)溶劑(例如醇，諸如甲醇)或其的混合物的酸性溶液?？梢岳迷谒嵝原h(huán)境中的胰島素的行為來溶解胰島素。在一些實(shí)施方案中，所述酸性環(huán)境具有約1.0至3.0的pH，例如1.8至2.2，以提供良好的溶解條件。(2)用緩沖溶液滴定溶解的胰島素溶液直至達(dá)到懸浮液狀態(tài)(例如直至獲得懸浮液)。利用溶解的胰島素溶液的滴定以改變?nèi)芙獾囊葝u素的溶解度，并且引起溶解的胰島素作為微?；葝u素顆粒沉淀，形成懸浮液。例如，可以改變所述溶液的pH值以影響胰島素的溶解度。胰島素包括酸性和堿性官能團(tuán)。構(gòu)成胰島素的氨基酸(例如氨基和羰基)可具有正電荷、負(fù)電荷或者可以是中性的，并且一起為胰島素提供其的總電荷。在低于其等電點(diǎn)(IEP)的pH下，胰島素?cái)y帶凈正電荷，而高于其IEP時(shí)，胰島素?cái)y帶凈負(fù)電荷。因此，可以滴定溶解的胰島素溶液至接近胰島素的IEP值，以降低胰島素的溶解度，并使胰島素從溶解的胰島素溶液中作為具有微米范圍的粒徑的小的或微小的顆粒固化并沉淀出來。隨著胰島素沉淀，溶解的胰島素溶液從透明的或大致澄清的溶液變?yōu)槿榘咨暮桶l(fā)白的懸浮液(例如懸浮液包括微?；葝u素顆粒)。(3)通過添加穩(wěn)定制劑(例如有機(jī)溶劑和任選的共溶劑)穩(wěn)定微?；葝u素顆粒，以在純化和干燥之前增加微?；葝u素顆粒的產(chǎn)量?？梢蕴砑臃€(wěn)定制劑(例如有機(jī)溶劑和/或共溶劑)以增加微粒化胰島素顆粒的產(chǎn)量。所使用的穩(wěn)定制劑(例如有機(jī)溶劑和任選的共溶劑)可以根據(jù)胰島素的類型而變化，并將在下面的部分中進(jìn)一步描述。本發(fā)明公開的實(shí)施方案提供以下特征：與凍干法、聚合物和微球方法相比，更簡單、更安全的制造和/或獲得產(chǎn)物；不需要輔料聚合物(其可能引入另外的雜質(zhì))；微粒化加工可在約室溫下進(jìn)行；沒有或大致沒有損失胰島素的分子活性；并且由于不需要額外的熱量，所述胰島素的聚集和/或降解較少。用于根據(jù)本發(fā)明公開的用于肺部遞送的在室溫下微?；葝u素和胰島素類似物的新工藝的實(shí)施方案包括以下三步主要措施。首先，溶解具有毫米范圍的粒徑的胰島素原料；其次，微?；?例如胰島素顆粒的沉淀，這使得包括胰島素顆粒的溶液成為包括微粒化胰島素顆粒的懸浮液)；第三，穩(wěn)定微?；葝u素顆粒；以及第四，從所述液體溶液中分離胰島素顆粒。胰島素顆粒從液體溶液分離之后可以經(jīng)洗滌、干燥和純化，以完成制造可吸入胰島素或胰島素類似物API的工藝的實(shí)施方案。在第一步措施中，胰島素原料可以溶解在包括水和極性有機(jī)溶劑的酸性環(huán)境(例如酸性溶液)中，其具有小的分子量并且與是水可混溶的?；谒鋈芤旱目傮w積，甲醇和/或乙醇可以以高達(dá)90體積％(體積％)的量包括在溶液中，以控制胰島素的起始溶解度。例如，甲醇和/或乙醇可以以優(yōu)選大約90體積％(基于酸性溶液的總體積)的量包含于酸性溶液中，但是大于0至高達(dá)90體積％的任何量可以預(yù)期并可以使用。所述酸性溶液可被置于攪拌板的頂部。整個(gè)過程可以采用約40至200轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的穩(wěn)定的、連續(xù)的或大致連續(xù)的攪拌直到溶液變得完全或大致上完全澄清。使用過高的攪動(dòng)速率和/或攪拌速度可能引起湍流和不均勻的混合，而使用過低的攪動(dòng)速率或攪拌速度可能導(dǎo)致具有不期望的粒徑(例如超過或大于5μm的粒徑)的胰島素顆粒。當(dāng)胰島素從固相解離為液相時(shí)(例如當(dāng)所述胰島素溶解以形成溶解的胰島素溶液時(shí))，所述溶液變得澄清或大致上澄清。所述胰島素的溶解可以在酸性環(huán)境中進(jìn)行。在第二步措施中，所述攪拌速度可以減慢至約30至100rpm，例如50至75rpm或50至60rpm。所述溶解的胰島素溶液被滴定或用緩沖溶液緩慢滴定，并隨著溶解的胰島素溶液從澄清或大致上澄清的溶液變?yōu)榘ㄎ⒘；葝u素顆粒的乳狀白色懸浮液時(shí)逐漸出現(xiàn)胰島素沉淀。所述胰島素和/或胰島素類似物可以在3至9的pH例如4.5至7.5的pH下微?；?。所述緩沖溶液可制備為具有3至10的pH。因此，通過滴定溶解的胰島素溶液形成可具有3至9的pH的懸浮液。在第三步措施中，使用具有中性pH并與水可混溶的穩(wěn)定制劑。穩(wěn)定制劑的實(shí)例包括醇和/或酮。例如，所述醇可包括甲醇、乙醇、異丙醇或其混合物，但所述醇不限于此。所述酮可以包括丙酮，但是所述酮不限于此。所述穩(wěn)定制劑穩(wěn)定所述微粒化胰島素顆粒?？梢栽诜蛛x微?；葝u素顆粒之后進(jìn)行純化和/或干燥工藝。可以使用本領(lǐng)域可用的任何合適的純化和/或干燥工藝，并對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)是顯而易見的。圖1是說明在室溫下微粒化胰島素和/或胰島素類似物的方法的實(shí)施方案的工藝流程圖。在圖1中，如圖1所示，用于微?；葝u素的工藝100的實(shí)施方案包括溶解胰島素原料102，沉淀胰島素以形成和穩(wěn)定懸浮液104，以及分離胰島素106?，F(xiàn)在將參考實(shí)例描述本發(fā)明公開的實(shí)施方案來進(jìn)行說明。然而，本發(fā)明的公開不限于本文所描述的實(shí)例。實(shí)施例1：在90體積％甲醇溶液中制備可吸入胰島素顆粒在40ml小瓶中，將70mg生物合成人胰島素(來自Sigma-Aldrich的重組胰島素)原料粉末溶解于具有約1.9pH、并含有90體積％(基于所述酸性溶液的總體積)的甲醇(另外10體積％包含水和HCl)的7.7ml酸性溶液中。將所述小瓶置于攪拌板的頂部，穩(wěn)定地?cái)嚢杷@得的溶液直至所述溶液完全或大致完全澄清以形成溶解的胰島素溶液。然后，將攪拌減慢至更慢模式(例如約75rpm的旋轉(zhuǎn)速度)，并逐滴添加1.75ml的pH為5.64的0.1M乙酸鈉(NaAc)緩沖溶液以緩慢滴定所述溶解的胰島素溶液。所述澄清的溶解的胰島素溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨偷S色的包括微粒化胰島素顆粒的懸浮液。所述滴定完成或大致完成后，向懸浮液中加入約10ml乙醇。繼續(xù)再攪拌30分鐘。微?；葝u素顆粒作為固體從懸浮液的上清液中被分離出來，該固體經(jīng)乙醇洗滌兩次以除去甲醇和鹽。該固體在室溫下真空干燥。圖2是示出根據(jù)實(shí)施例1所述方法生產(chǎn)的可吸入人胰島素API的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。在本申請(qǐng)中，使用JEOLCarryScopeJCM-5700SEM儀器獲得所有的SEM圖像。圖3是說明根據(jù)實(shí)施例1所述所制備的可吸入胰島素API(微?；葝u素)的粒度分布的圖。從圖2和圖3可以得出結(jié)論，根據(jù)實(shí)施例1所述所制備的可吸入胰島素API(微?；葝u素)，例如具有粒徑＜5μm的可吸入胰島素API(微?；葝u素)的粒徑適合于肺部給藥。例如，從圖3可看出，實(shí)施例1的微?；葝u素的平均粒徑D50小于2μm。D50為基于所述樣品的總體積計(jì)在最大顆粒直徑以下有50體積％的樣品具有較小顆粒的直徑，且在最大顆粒直徑以上有50體積％的樣品具有較大顆粒的直徑。實(shí)施例2：用于在90體積％甲醇溶液中制備可吸入胰島素顆粒的批生產(chǎn)過程在包括離心攪拌器或攪拌棒的400ml容器中，將1克生物合成人胰島素API粉末(即來自Sigma-Aldrich的重組胰島素)溶解于110ml的具有約1.9的pH及含有90體積％(基于所述酸性溶液的總體積)甲醇(另外10體積％含有水和HCl)的酸性溶液中。攪拌所得溶液直到所述胰島素溶液完全或大致完全澄清以形成溶解的胰島素溶液。然后，減慢攪拌至更慢模式(例如約50rpm的旋轉(zhuǎn)速度)，并逐滴添加25ml的0.1MNaAc緩沖溶液(具有5.64的pH)以滴定溶解的胰島素溶液。所述澄清的溶解的胰島素溶液變成乳白色和淡黃色的包括微?；葝u素顆粒的懸浮液。滴定完成或大致完成后，向所述懸浮液中添加約135ml乙醇，再繼續(xù)攪拌30分鐘。微粒化胰島素顆粒作為固體從懸浮液的上清液中被分離出，并且該固體經(jīng)乙醇洗滌兩次以除去甲醇和鹽。該固體在室溫下真空干燥。產(chǎn)物重量用于計(jì)算回收率。使用激光衍射粒徑分析儀(即JEOLCarryScopeJCM-5700SEM儀器)分析粒徑。上述步驟重復(fù)四(4)次用于微?；葝u素各批次。表1顯示了根據(jù)實(shí)施例2所述所制備的四(4)批次的回收率的再現(xiàn)性。從表1可看出，實(shí)施例2的回收率高于86％。表1批次ID回收率％186.4286.1386.8486.2平均86.4標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差％0.4表2示出了在實(shí)施例2分批生產(chǎn)的微粒化人胰島素顆粒的粒徑分布的再現(xiàn)性。從表2得出結(jié)論，根據(jù)如實(shí)施例2所述制備的微?；葝u素的粒徑，例如具有＜5μm的粒徑適合于肺部遞送。例如，在表2中能夠看到，對(duì)于實(shí)施例2的微?；葝u素，平均粒徑D50為1.54μm，平均粒徑D10為0.75μm，平均粒徑D90為3.04μm，其適合于肺部遞送。D50為基于所述樣品的總體積計(jì)在最大顆粒直徑以下有50體積％的樣品具有較小顆粒的直徑，且在最大顆粒直徑以上有50體積％的樣品具有較大顆粒的直徑。D10為基于所述顆粒的總體積計(jì)10體積％的顆粒的顆粒直徑比D10的顆粒直徑較小。D90為基于所述顆粒的總體積計(jì)90體積％的顆粒的顆粒直徑比D90的顆粒直徑較小。表2根據(jù)美國藥典(USP)的<621>章和用于人胰島素專題論文的雜質(zhì)檢測的USP方法，通過高效液相色譜(HPLC)檢測加工前后的胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性。圖4是表示胰島素在實(shí)施例2所述的微粒化工藝前后的雜質(zhì)分布圖。如圖4所示，在微?；に嚻陂g，所述胰島素中的雜質(zhì)，例如胰島素二聚體、高分子量蛋白質(zhì)、A-21脫氨胰島素或相關(guān)化合物的量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化。圖5是根據(jù)實(shí)施例2所述所制備的溶解的胰島素顆粒的高效液相色譜(HPLC)色譜圖。圖5的HPLC色譜圖示出了微?；葝u素的保留時(shí)間相對(duì)于原始胰島素原料的保留時(shí)間沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化。從微?；葝u素顆粒的分析得到的證據(jù)表明，在微?；に嚻陂g，所述胰島素的化學(xué)完整性得以保持或大致上保持。使用來自SympatecGmbh的激光衍射CUVETTECUV-50ML/US儀器評(píng)估微?；葝u素顆粒的粒徑分布。在乙醇介質(zhì)(乙醇溶液)中檢測微?；葝u素顆粒。獲得的數(shù)據(jù)顯示，基于所述顆粒的總體積計(jì)，超過99體積％的顆粒具有小于5μm的粒徑，以及所有的四(4)個(gè)批次的體積平均直徑的平均值為1.79μm，如表2所示。因此，基于所述微粒化胰島素顆粒的總體積計(jì)，所述微?；葝u素顆粒可包括99體積％或更多(例如99至100體積％)的具有小于5μm的粒徑的顆粒。在一些實(shí)施方案中，基于微?；葝u素顆粒的總體積計(jì)，所述微?；葝u素顆粒可包括高達(dá)99體積％的具有小于5μm的粒徑的顆粒。圖6是示出了分別使用包括1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A)、1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227)、或HFA134A及HFA227的混合物的推進(jìn)劑從三個(gè)定量霧化吸入器遞送的人胰島素(如根據(jù)實(shí)施例2所述生產(chǎn)的API)的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器研究的圖表。所述定量霧化吸入器如下文根據(jù)實(shí)施例11所述來制備。從圖6所示的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，當(dāng)三種不同的推進(jìn)劑(HFA134A、HFA227、以及HFA134A和HFA227的混合物)與根據(jù)實(shí)施例2所述所生產(chǎn)的微?；艘葝u素一起使用時(shí)，提供了可比較的結(jié)果。圖7是進(jìn)一步示出了在使用三種不同的推進(jìn)劑(分別為HFA134a、HFA227、HFA127、或HFA134A和HFA227的混合物)從定量霧化吸入器遞送的人胰島素(如實(shí)施例2所述的關(guān)于生產(chǎn)的API)的三個(gè)不同階段分類的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器分析結(jié)果的圖表。所述定量霧化吸入器如下文根據(jù)實(shí)施例11所述制備。從圖7所示的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，當(dāng)所述三種不同的推進(jìn)劑與根據(jù)實(shí)施例2所述所生產(chǎn)的微粒化人胰島素一起使用時(shí)，提供了可比較的結(jié)果。實(shí)施例3：在100體積％水溶液中制備可吸入胰島素顆粒的方法根據(jù)如實(shí)施例1所述制備可吸入人胰島素顆粒，不同的是使用pH為2.0(包括純化水和足以提供pH為2.0量的酸的溶液)的大致100體積％的純水溶液以替換含有實(shí)施例1的90體積％的甲醇的酸性溶液。如實(shí)施例2所述來分析生成的可吸入人胰島素顆粒的粒徑分布。粒徑分布分析的結(jié)果表明，可吸入人胰島素顆粒具有2.01μm的體積平均直徑。如上所述，根據(jù)如實(shí)施例1所述制備的可吸入人胰島素顆粒具有小于2μm的粒徑D50，所有4個(gè)批次的根據(jù)如實(shí)施例2(其也使用包含90體積％甲醇的酸性溶液來制備)所述制備的可吸入人胰島素顆粒的體積平均直徑的平均值為1.79μm。因此，可看出所述溶劑的組成(例如甲醇比水)可改變所產(chǎn)生的微粒化人胰島素的尺寸。實(shí)施例4：在低濃度的甲醇溶液中制備可吸入人胰島素顆粒的方法根據(jù)實(shí)施例1所述制備可吸入人胰島素顆粒，不同的是，使用約2.0pH(另外50體積％含有水和HCl)的基于所述酸性溶液的總體積計(jì)含有50體積％甲醇的酸性溶液或含有10體積％的甲醇(另外90體積％含有水和HCl)的酸性溶液來替換用于溶解實(shí)施例1的人胰島素原材料的所述含有90體積％的甲醇的酸性溶液。表4顯示了如實(shí)施例1、3和4所述的關(guān)于微?；艘葝u素顆粒的粒徑分布數(shù)據(jù)。表4因此得出結(jié)論，利用起始溶劑(例如甲醇溶液比水)和溶劑濃度(例如基于所述酸性溶液總體積計(jì)，10體積％、50體積％或90體積％的甲醇)來溶解人胰島素(原材料)可以影響所述微?；艘葝u素顆粒的粒徑。實(shí)施例5：在10體積％乙醇溶液中制備可吸入人胰島素顆粒的方法根據(jù)實(shí)施例1所述制備可吸入人胰島素顆粒，不同的是使用2.0pH的基于所述酸性溶液的總體積計(jì)含有10體積％乙醇(另外90％體積％含有水和HCl)的酸性溶液以替換含有90體積％的用于溶解實(shí)施例1的胰島素的甲醇的酸性溶液。如實(shí)施例2所述分析生成的可吸入人胰島素顆粒的粒徑分布。粒徑分析結(jié)果表明，可吸入人胰島素顆粒具有1.36μm的體積平均直徑。實(shí)施例6：使用90體積％甲醇溶液在不同pH下微?；艘葝u素為可吸入顆粒的方法根據(jù)實(shí)施例1所述制備可吸入人胰島素顆粒，不同的是利用一系列含有具有3至9pH的NaOH的緩沖溶液來替代利用具有5.64pH的緩沖溶液。根據(jù)實(shí)施例2所述分析所述生成的人胰島素顆粒的粒徑分布。也使用NaOH調(diào)節(jié)所述溶液的pH。滴定后所述粒徑分布分析結(jié)果和相應(yīng)的緩沖溶液的pH的示于表5中。從表5所示的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，使用具有3至9的pH的緩沖溶液適合于微?；に嚨膶?shí)施方案。表5實(shí)施例7：使用異丙醇共溶劑制備可吸入人胰島素顆粒的方法根據(jù)實(shí)施例1所述制備可吸入人胰島素顆粒，不同的是在滴定完成或大致完成后，使用異丙醇來替代實(shí)施例1的乙醇添加至所述懸浮液。生成的可吸入人胰島素顆粒的粒徑分布如實(shí)施例2所述進(jìn)行分析。所述粒徑分布分析的結(jié)果示出了所述可吸入人胰島素的體積平均直徑為1.27μm。實(shí)施例8：使用丙酮共溶劑制備可吸收的人胰島素顆粒的方法根據(jù)實(shí)施例1所述制備可吸入人胰島素顆粒，不同的是在所述滴定完成或大致完成后，使用丙酮來替代實(shí)施例1的添加至所述懸浮液的乙醇。生成的可吸入人胰島素顆粒的粒徑分布如實(shí)施例2所述進(jìn)行分析。所述粒徑分布分析的結(jié)果示出了所述可吸入人胰島素的體積平均直徑為1.32μm。實(shí)施例9：微?；示葝u素類似物為可吸入顆粒的的方法甘精胰島素是長效人胰島素類似物。本文使用的甘精胰島素是通過商購得到的甘精胰島素超濾獲得的。甘精胰島素在使用前經(jīng)洗滌并凍干。將70mg的經(jīng)洗滌和凍干的甘精胰島素溶解在7.7ml的pH為約2.2且包括基于所述酸性溶液的總體積計(jì)90體積％甲醇(另外10體積％包括水和HCl)的酸性溶液中，以形成包含甘精胰島素的溶解的胰島素溶液。逐滴添加1.75ml的pH為6.9的磷酸鹽緩沖溶液，以在所述甘精胰島素完全或大致上完全溶解后滴定溶解的甘精胰島素溶液。向溶液加入10ml的乙醇。上述溶解、滴定和添加醇在穩(wěn)定(大致連續(xù))的攪拌下進(jìn)行。澄清的溶解的甘精胰島素溶液成為包括微?；示葝u素顆粒(微?；示葝u素顆粒)的乳白色懸浮液。分離、清洗并干燥微?；示葝u素顆粒。使用根據(jù)實(shí)施例2所述的激光衍射檢測分析微?；示葝u素顆粒的粒徑分布。顆粒分布分析顯示，所述微?；示葝u素顆粒的體積平均直徑為2.27μm。圖8是微?；示葝u素顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖9是溶解的微粒化甘精胰島素顆粒的HPLC色譜圖。圖9所示的HPLC結(jié)果的保留時(shí)間表明所述甘精胰島素的化學(xué)性質(zhì)在微?；陂g沒有改變(或大致上沒有改變)。圖10和11是顯示由使用HFA134A作為推進(jìn)劑的定量霧化吸入器遞送的甘精胰島素顆粒的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器研究的結(jié)果的圖表。定量霧化吸入器如下文根據(jù)實(shí)施例11所述制備。圖10和11顯示的研究結(jié)果證實(shí)一致或基本一致的模式。實(shí)施例10：微?；T冬胰島素類似物為可吸入顆粒的方法門冬胰島素是一種速效胰島素類似物。本文使用的門冬胰島素通過超濾(從NovoNordisk，Denmark獲得)獲得。所述超濾的門冬胰島素在使用前經(jīng)清洗并凍干。將70mg的經(jīng)清洗和凍干的門冬胰島素溶解在7.7ml的pH為約2的并且包括HCl的酸性溶液中，以形成包含門冬胰島素的溶解的胰島素溶液。逐滴添加4.2ml的pH為5.64的乙酸鹽緩沖溶液，以在門冬胰島素完全或大致完全溶解后滴定溶解的門冬胰島素溶液。向所述溶液添加78ml的乙醇以獲得懸浮液。在穩(wěn)定(基本連續(xù))的攪拌下進(jìn)行上述溶解、滴定和添加乙醇。澄清的溶解的門冬胰島素溶液變?yōu)榘⒘；T冬胰島素顆粒(微?；T冬胰島素顆粒)的乳白色懸浮液。分離、清洗并干燥門冬胰島素顆粒。利用根據(jù)實(shí)施例2所述激光衍射檢測來分析微?；T冬胰島素顆粒的粒徑分布。顆粒分布分析顯示微粒化門冬胰島素顆粒的體積平均直徑為2.72μm。圖12是微粒化門冬胰島素顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖13是溶解的微粒化門冬胰島素顆粒的HPLC色譜圖。圖13所示的HPLC結(jié)果的保留時(shí)間表明在微粒化期間所述門冬胰島素的化學(xué)性質(zhì)沒有改變(或大致上沒有改變)。圖14和15是顯示由使用HFA134A作為推進(jìn)劑的定量霧化吸入器遞送的甘精胰島素顆粒的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器研究的結(jié)果的圖表。定量霧化吸入器如下文根據(jù)實(shí)施例11所述制備。圖14和圖15顯示的研究結(jié)果證實(shí)一致或基本一致的模式。實(shí)施例11：用于體外安德森級(jí)聯(lián)沖擊器檢測的定量霧化吸入器的制備定量霧化吸入器(MDI)根據(jù)以下工藝制備。將合適的或適量的微?；艘葝u素API(例如微?；艘葝u素顆粒或微?；艘葝u素類似物顆粒)和乙醇填充到吸入器罐中。然后通過使用VWRAquasonic應(yīng)用超聲能量混合所述罐的內(nèi)容物5分鐘，以獲得均勻的或大致上均勻的懸浮液。添加不同的推進(jìn)劑，例如HFA134A、HFA227或其混合物，并且利用合適的閥通過夾緊來密封罐。將微?；艘葝u素(例如微粒化人胰島素顆?；蛭⒘；葝u素類似物顆粒)作為活性成分填充至定量霧化吸入器(MDI)中。吸入器中人胰島素或胰島素類似物的濃度為3mg/g。圖7、圖11和圖15所示的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器數(shù)據(jù)與使用激光衍射粒徑分析儀觀察到的粒徑分布結(jié)果良好地對(duì)應(yīng)。在本文提供的安德森級(jí)聯(lián)沖擊器數(shù)據(jù)中，釋放劑量是指沉積在安德森級(jí)聯(lián)沖擊器上的人胰島素或胰島素類似物的百分比。通過本文公開的工藝實(shí)施方案微粒化的人胰島素顆粒的表面的形狀和粗糙度(或平滑度)是非常合適的或有利的(例如合適于或有利于肺部遞送)。通過噴射研磨的微?；菍㈩w粒從毫米尺寸范圍研磨至更小的微米尺寸范圍的常用方法。噴射研磨過程涉及顆粒之間的頻繁碰撞以及由高速氣流引起的與研磨室的壁的碰撞。通過氣流的圓周運(yùn)動(dòng)和離心力從噴射研磨產(chǎn)生的微?；w粒從研磨室中提取。這些機(jī)械力可能損壞微?；w粒的表面和形狀，例如，如下面根據(jù)比較例1所述的，其可能不利于或不合適于肺部給藥。比較實(shí)施例1：通過噴射研磨制備人胰島素顆粒利用75PSI的研磨N2壓力以及約1g/min的進(jìn)料速率通過噴射研磨來制備人胰島素顆粒。圖16是利用所述噴射研磨方法微?；娜艘葝u素顆粒的原子力顯微鏡(AFM)圖像。如圖16可看出，通過噴射研磨制備的人胰島素顆粒具有粗糙的以及不規(guī)則的(或不均勻的)外觀。圖17是根據(jù)實(shí)施例2所述所微?；目晌肴艘葝u素顆粒的APM圖像。由于本文公開的工藝實(shí)施方案在室溫下進(jìn)行并且不涉及機(jī)械力和/或熱量(或大致上沒有機(jī)械力和/或熱量)，所述微粒化人胰島素顆粒具有更合適或更優(yōu)選用于人肺部給藥的形狀和表面。雖然已經(jīng)結(jié)合特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所公開的實(shí)施方案，而相反旨在涵蓋在其所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的各種變形和等效安排。在整個(gè)文本和權(quán)利要求中，所有如相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的，術(shù)語“約”和“大致上”用作近似的術(shù)語，而不是程度的術(shù)語，并且反映與測量、有效數(shù)字和可互換性相關(guān)聯(lián)的固有變差。此外，應(yīng)當(dāng)理解，除非另有說明，在本發(fā)明所公開的以及所附的權(quán)利要求中，即使數(shù)值前沒有術(shù)語“約”，其也被該術(shù)語隱含地修飾。當(dāng)前第1頁1 2 3