發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于保護豬免于豬流行性腹瀉病毒(pedv)感染的疫苗以及保護豬免于pedv感染的方法。
背景技術(shù)：
：豬流行性腹瀉病毒是冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬的成員。其為正義(positive-sense)、有包膜、單鏈rna病毒。在1971年首次在英國育肥型和肥育豬中觀察到豬流行性腹瀉(ped)。在1980年代和1990年代，ped在整個歐洲，在國家諸如比利時、英國、德國、法國、荷蘭和瑞士流行。這些爆發(fā)相對溫和，且可以控制。目前，沒有跡象表明歐洲存在pedv。伴隨高死亡率的嚴重的pedv爆發(fā)在亞洲是常見的，其中它在某些地區(qū)可能已變得流行性。自2010年以來，中國已經(jīng)出現(xiàn)了爆發(fā)的大幅增加，這是由于新毒株的出現(xiàn)，而目前pedv是導(dǎo)致亞洲養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失的主要病原體之一。亞洲樣pedv毒株在2013年4月首次進入美國，并且已傳播至加拿大和拉丁美洲。pedv最通常經(jīng)由與受感染的豬的糞-口接觸來傳播，并且也可能通過受污染的設(shè)備、污染物或人員引入。受感染的豬、骯臟的鞋子、衣服、手、設(shè)備或卡車可以傳播該疾病。但也有跡象表明pedv可以通過空氣傳播。衛(wèi)生和生物安全是最佳的預(yù)防手段。在豬中，疾病的嚴重程度是可變的，并且取決于畜群的流行病學(xué)狀況。主要且通常唯一的臨床體征是急性水樣腹瀉和嘔吐。在未接種疫苗的動物中，可以在所有年齡的豬中都觀察到嘔吐、急性水樣腹瀉和食欲不振；發(fā)病率接近100％。尤其乳豬是非常易感的，并且它們通常表現(xiàn)出水樣腹瀉、脫水和代謝性酸中毒，其中死亡率通常在50％和80％之間。另一方面，育肥型和生長型豬表現(xiàn)出腹瀉、厭食和抑郁癥，其發(fā)病率高，但死亡率低(1-3％)。當(dāng)將pedv感染的豬引入未接種疫苗的場所時，臨床體征通常在4-5天內(nèi)出現(xiàn)。pedv不能傳播至人類。發(fā)明目標(biāo)本領(lǐng)域中描述了旨在保護豬免于pedv感染的疫苗。然而，在許多情況下未報告或未明確報告實際保護。需要能夠在未接種疫苗的豬中誘導(dǎo)水平與豬在野生型感染后獲得的抗體水平相當(dāng)?shù)牟《局泻涂贵w(“vn”)的疫苗，同時，所述疫苗對于豬是安全的。發(fā)明概述為了實現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，已經(jīng)設(shè)計了通過施用對應(yīng)于至少3.0e6(即，3.0x106)tcid50殺死的全pedv的抗原的劑量用于如上發(fā)明領(lǐng)域部分中所用的疫苗，所述疫苗包含非活pedv抗原和含有不可代謝的油的佐劑，其中所述疫苗中的油的總量為小于50%v/v。已經(jīng)顯示，用該疫苗，豬可以安全地免疫并且能夠達到至少與pedv野生型感染后存活的動物中獲得的典型滴度相當(dāng)?shù)膙n滴度。不可代謝的油，盡管在許多情況下對豬不安全，看起來優(yōu)于其它佐劑，諸如廣泛使用的可代謝的油和氫氧化鋁凝膠，并且當(dāng)以受限量施用時對于該特定疫苗是安全的。所述油的典型最小量為1％，但可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10%或甚至更高。抗原的最小劑量，即，對應(yīng)于至少3.0e6tcid50殺死的全pedv的抗原的劑量，已經(jīng)證明是獲得所需滴度所需的，并且可能甚至通過如本領(lǐng)域眾所周知的重復(fù)接種疫苗來進一步改進。本發(fā)明還涉及保護豬免于豬流行性腹瀉病毒(pedv)感染的方法，其包括向豬施用包含非活pedv抗原和含有不可代謝的油的佐劑的疫苗，其中所述疫苗中的油的總量為小于50%v/v，且以對應(yīng)于至少3.0e6tcid50殺死的全pedv的劑量施用所述抗原，以及還涉及疫苗，其用于保護豬免于豬流行性腹瀉病毒(pedv)感染，所述疫苗包含非活pedv抗原和含有不可代謝的油的佐劑，其中所述疫苗中的油的總量為小于50%v/v，且所述抗原以對應(yīng)于至少1.5e6tcid50殺死的全pedv的劑量提供。定義疫苗是保護免于接種疫苗后感染病原微生物的組合物，即預(yù)防或減少微生物感染或免于由感染導(dǎo)致的臨床疾病的組合物，所述保護、預(yù)防或減少通常通過在接種疫苗的宿主中例如經(jīng)由抗體干擾微生物本身來實現(xiàn)。接種疫苗因此預(yù)防或至少降低感染水平和/或預(yù)防或至少降低由該感染導(dǎo)致的臨床疾病的水平。安全疫苗是這樣的疫苗，其在施用疫苗之后的頭24小時內(nèi)引發(fā)典型的低于2.0℃、優(yōu)選低于1.5℃、優(yōu)選低于1.0℃的直腸溫度升高，同時，如果其產(chǎn)生局部反應(yīng)，所述反應(yīng)必須是溫和的(腫脹低于10cm2，優(yōu)選低于5cm2，更優(yōu)選低于3cm2，甚至更優(yōu)選低于2cm2，最優(yōu)選低于1cm2)和短暫的(在2周內(nèi)、優(yōu)選1周內(nèi)、更優(yōu)選3天內(nèi)、最優(yōu)選一天內(nèi)消失)。非活的豬流行性腹瀉病毒抗原意指不同于活的(能夠復(fù)制的)全病毒的pedv抗原。具體而言，其涵蓋殺死的病毒和病毒亞單位，后者任選地被重組表達。不可代謝的油是在動物的壽命期間(對于豬，這直到豬為26-30周齡)，在施用之后不被個體動物代謝的油(礦物、天然或合成來源的液體物質(zhì)，其不能與水自由混合)。所述油可以分布在動物體內(nèi)，但不會被動物的代謝過程降解。實例是礦物油諸如液體石蠟油或重礦物油、天然油諸如角鯊?fù)?氫化的鯊魚肝油)、以及合成油諸如合成c15-c17烴類。對應(yīng)于至少“x”tcid50殺死的全pedv的非活抗原的劑量意指非活性抗原(即，不同于能夠復(fù)制的全微生物的抗原)的劑量使得用非活抗原至少獲得與用每劑量包含“x”tcid50殺死的全ped病毒的疫苗可以獲得的vn滴度相同的vn滴度。殺死的全病毒意指由殺死(滅活)活的全病毒導(dǎo)致的抗原性構(gòu)成。這不排除病毒顆粒在滅活或任何進一步下游處理期間至少部分破裂。對應(yīng)于蛋白(的一部分)的多肽意指所述多肽至少含有該蛋白(的部分)，其在蛋白(的該部分)的長度上與天然存在的蛋白具有至少80％的序列同源性，優(yōu)選至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99直至最高達100％的序列同源性。pedv的刺突蛋白是約1400個氨基酸長的大型i型跨膜蛋白。像冠狀病毒的其它刺突蛋白一樣，所述蛋白是高度糖基化的。所述刺突蛋白被布置在兩個結(jié)構(gòu)域中：稱為s1的負責(zé)受體結(jié)合的n-末端結(jié)構(gòu)域和負責(zé)融合的c-末端s2結(jié)構(gòu)域。實施方案在根據(jù)本發(fā)明使用的疫苗的一個實施方案中，所述抗原的劑量對應(yīng)于至少1.5e7tcid50殺死的全pedv。在該劑量下，看起來可能獲得對應(yīng)于pedv野生型感染后誘導(dǎo)的峰值水平的滴度水平。在另一個實施方案中，所述油的總量為小于40%v/v。減少油的量預(yù)期甚至進一步增加安全性。優(yōu)選地，油的量在10％和40％之間，更優(yōu)選地在15％和30％之間。在又另一個實施方案中，將所述油乳化在親水性溶劑中。在親水性溶劑諸如例如水中乳化所述油，預(yù)期進一步增加疫苗的安全性。在又另一個實施方案中，除了不可代謝的油以外，所述疫苗還包含維生素e乙酸酯。該油性、可生物降解的物質(zhì)可以進一步改進疫苗功效和穩(wěn)定性。在一個實施方案中，所述抗原含有對應(yīng)于pedv的刺突蛋白的s1結(jié)構(gòu)域的c末端三分之二的多肽。ped病毒的該部分已經(jīng)證明能夠并提供所需vn滴度。優(yōu)選地，所述多肽對應(yīng)于pedv的刺突蛋白的s1結(jié)構(gòu)域或甚至pedv的整個刺突蛋白。一種將刺突蛋白呈遞至免疫系統(tǒng)的簡單方法是提供殺死的全pedv作為抗原。在另一個實施方案中，所述疫苗用于向母豬(術(shù)語“母豬”不排除雌性動物實際上是小母豬)施用以保護該母豬的后代免于豬流行性腹瀉病毒感染?？雌饋?，目前疫苗能夠誘導(dǎo)非常高滴度的抗體。母豬能夠甚至進一步將這些抗體集中于其初乳中，因此，據(jù)信當(dāng)前疫苗完全適合于通過哺乳保護該母豬的后代免于pedv感染(通常稱為生乳免疫)。優(yōu)選地，母豬在其懷孕時接種疫苗，但母豬也可以在臨懷孕之前接種疫苗。實際上，天然水平滴度可以在至少四個月期間保護豬(參見：nationalhogfarmer,sep2,2014michaelmurtaugh,cheryldvorak,suzannestonedepartmentofveterinaryandbiomedicalsciences,universityofminnesota,st.paul;www.nationalhogfarmer.com)，因此，鑒于懷孕持續(xù)少于4個月的事實，在懷孕之前誘導(dǎo)高滴度應(yīng)當(dāng)能夠經(jīng)由哺乳提供對后代的保護。本發(fā)明現(xiàn)在將使用以下實施例進一步解釋。實施例實施例1病毒中和測定在vero細胞上使用病毒中和(vn)測定法測試血清中針對pedv的中和抗體的存在。簡言之，在含有抗生素青霉素和鏈霉素的amem-tpb細胞培養(yǎng)基中制備測試樣品或參考血清的連續(xù)兩倍稀釋液。每種稀釋物與等體積的100tcid50的感染性pedv毒株混合，所述感染性pedv毒株在感染易感vero細胞后表達綠色熒光蛋白(gfp)。在37℃下預(yù)溫育1小時后，將病毒/血清稀釋混合物轉(zhuǎn)移至含有vero-ccl81細胞的96孔微量滴定板。在37℃下溫育48小時后，通過顯微鏡測定指示病毒復(fù)制的gfp熒光的程度。將抗體滴度計算為其中表明無病毒復(fù)制的最高血清稀釋度的倒數(shù)的log2。獲得的vn滴度被表示為從重復(fù)測量計算的平均值。以該方式，確定了在感染后存活的野生型pedv感染的豬中的vn滴度為5.0log2/ml或更高的水平，其中峰值水平為8.0至9.0log2。實施例2佐劑類型的影響研究設(shè)計20只pedv血清陰性的仔豬可用于該試驗。當(dāng)仔豬為大約五周齡時，將它們經(jīng)由肌內(nèi)(im)途徑接種疫苗，并在其后2周加強。所有施加都給予至頸部中。所述疫苗在2ml中含有1.5·107tcid50的1mm雙乙烯亞胺(bei)滅活的殺死的全pedv(細胞培養(yǎng)適應(yīng)的dr13)。在臨第一次接種疫苗之前和其后一、二、三、四和五周收集血液樣品。從血液樣品收集血清，并測定病毒中和抗體滴度。在每次接種疫苗當(dāng)天和其后測量直腸溫度。將動物分成四組，每組五只動物(參見表1)。第一組接受市售佐劑xsolve?(可得自msdanimalhealth,boxmeer,thenetherlands)中配制的殺死的全病毒疫苗，使得最終疫苗包含21%v/v的不可代謝的油marcol?52和1.25%v/v的可代謝的油維生素e乙酸酯。第二組接受市售佐劑diluvacforte?(可得自msdanimalhealth,boxmeer,thenetherlands)中配制的相同抗原，使得最終疫苗包含7.5%v/v的可代謝的油維生素e乙酸酯。第三組接受含有明礬水凝膠的疫苗prosystem?ce(可得自merckanimalhealth,usa)中配制的相同抗原。第四組接受無佐劑的水中配制的相同抗原。表1.動物組及其處理的概述組別仔豬數(shù)pedv抗原劑量佐劑15殺死的全病毒1.5e7tcid50xsolve25殺死的全病毒1.5e7tcid50diluvacforte35殺死的全病毒1.5e7tcid50prosystemce45殺死的全病毒1.5e7tcid50-結(jié)果體溫每組的平均體溫的概述顯示于表2中。可以得出結(jié)論，沒有一種疫苗引起超過1℃的嚴重溫度升高，并且xsolve誘導(dǎo)了所測試的三種佐劑中的最大溫度升高。在該組中觀察到的最高個體溫度升高為1.7℃。表2.第一次或第二次接種疫苗后取得的平均直腸溫度。病毒中和測定每組的計算的平均vn滴度圖示顯示于圖1中?？梢缘贸鼋Y(jié)論，殺死的全病毒抗原能夠誘導(dǎo)良好的vn滴度。佐劑的貢獻如下：基于不可代謝的油的佐劑產(chǎn)生最高滴度，隨后是基于可代謝的油的佐劑，其后是基于氫氧化鋁凝膠的佐劑。實施例3非活抗原類型的影響研究設(shè)計60只pedv血清陰性的仔豬可用于該試驗。當(dāng)仔豬為大約五周齡時，將它們用2ml疫苗經(jīng)由肌內(nèi)(im)途徑免疫，并在其后3周加強。所有施加都給予至頸部中。實驗組的概述在表3中給出。在第一次接種疫苗之前和其后兩、三、四、五和六周收集血液樣品。從血液樣品收集血清，并測定病毒中和抗體滴度。在接種疫苗當(dāng)天和其后4和24小時測量直腸溫度。在每次接種疫苗后，在接種疫苗后2、4、6、8、10、12和14天在接種疫苗部位上觸診所有仔豬。表3.動物組及其處理的概述材料和方法亞單位疫苗本研究中使用的亞單位疫苗中存在的抗原基于pedv刺突(s)蛋白的s1結(jié)構(gòu)域。s1氨基酸序列源自與指標(biāo)毒株usa/colorado/2013相同的美國分離株。使用全長s1結(jié)構(gòu)域以及s1結(jié)構(gòu)域的n-末端三分之一或c-末端三分之二。為了促進蛋白純化和改善免疫原性，將一些s1蛋白用源自人或豬免疫球蛋白的fc片段c-末端標(biāo)記。所有蛋白都在hek293t細胞中表達，純化，并測定蛋白含量。簡言之，用編碼所需pedv多肽(任選地具有小鼠fc標(biāo)簽)的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t細胞。轉(zhuǎn)染后一天，用新鮮培養(yǎng)基替換細胞培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后六天，收集細胞培養(yǎng)基并將其通過離心澄清。隨后通過與a蛋白瓊脂糖珠結(jié)合來純化多肽。在允許多肽結(jié)合珠粒后，將其使用pbs洗滌三次，并且將多肽洗脫于0.5mhacph3中。通過使用3mtrisph8.8中和ph(最終ph7.5)。最后，使用nanodrop在od280處測定多肽濃度。將多肽儲存在-80℃下。s1蛋白的概述在圖2中給出。在xsolve中以10μgs1蛋白/2ml劑量配制亞單位疫苗。殺死的病毒疫苗kv疫苗含有用1mmbei滅活的殺死的全pedv。該毒株，細胞培養(yǎng)適應(yīng)的d13，與usa/colorado/2013共享93.3％的其氨基酸。將kv抗原在xsolve中配制為即用型制劑。病毒中和測定在vero細胞上使用病毒中和(vn)測定法測試血清中針對pedv的中和抗體的存在。簡言之，在含有抗生素青霉素和鏈霉素的amem-tpb細胞培養(yǎng)基中制備測試樣品或參考血清的連續(xù)兩倍稀釋液。每種稀釋物與等體積的100tcid50的感染性pedv毒株混合，所述感染性pedv毒株在感染易感vero細胞后表達綠色熒光蛋白(gfp)。在37℃下預(yù)溫育1小時時段后，將病毒/血清稀釋混合物轉(zhuǎn)移至含有vero-ccl81細胞的96孔微量滴定板。在37℃下溫育48小時后，通過顯微鏡測定指示病毒復(fù)制的gfp熒光的程度。將抗體滴度計算為其中表明無病毒復(fù)制的最高血清稀釋度的倒數(shù)的log2(每50μl)。獲得的vn滴度被表示為從重復(fù)測量計算的平均值。在允許使用毒株dr13或毒株gd01的替代vn測試中測試合并的血清。由于gd01需要胰蛋白酶用于感染，如下修改上述方法：在37℃下共溫育1小時后，將病毒/血清混合物在vero-ccl81細胞上在37℃下放置2小時。然后除去混合物，將細胞用pbs洗滌兩次，并且在加有10μg/ml胰蛋白酶的amem-tpb(對于gd01)(或在毒株dr13用于該程序的情況下，無胰蛋白酶的amem-tpb)存在的情況下，將細胞在37℃下溫育48小時。pedv抗體elisa在抗體elisa中測定血清中的針對源自usa/colorado/2013的pedv刺突蛋白的s1部分的抗體。為此，將板用100μlpedvs1(0.25μg/ml)包被。將血清在pbs0/1%bsa中1:900稀釋，并添加至包被的孔中，隨后在37℃下溫育1小時。在用pbs0/0.05%tween-20兩次洗滌后，將100μlpbs0/1%bsa/0.5%tween20中1:10,000稀釋的兔α豬igghrpo綴合物添加至孔中，并且將板在37℃下溫育1小時。用pbs0/0.05%tween-20三次洗滌后，向每個孔中添加100μl/孔的tmb“超緩慢”底物，隨后在室溫下溫育10分鐘(在黑暗中)。通過向每孔添加100μl的25％硫酸終止反應(yīng)。用elisa閱讀器測量在405nm處的光密度(od)。包括來自天然感染的豬的血清作為陽性對照。結(jié)果體溫每組的平均體溫的概述顯示于表4中?？梢缘贸鼋Y(jié)論，沒有一種疫苗引起超過1攝氏度的嚴重的平均溫度升高。在接種疫苗后4小時看到最大的溫度升高，但在大多數(shù)情況下，在接種疫苗后24小時溫度恢復(fù)至正常水平。對于組6中的一只動物，在加強接種疫苗后4小時，觀察到最高的個體溫度升高(2.3℃)。局部反應(yīng)在接種疫苗后2、4、6、8、10、12和14天，在肌內(nèi)疫苗施加部位觸診動物。從長度和寬度(以cm計)，計算局部反應(yīng)(即腫脹)的表面。組2b中的一只動物在加強接種疫苗后直接顯示非常溫和(<1cm2)和短暫的(在一天內(nèi)消失)腫脹。對于所有其它59只動物，沒有觀察到局部反應(yīng)。表4.第一次或第二次接種疫苗后取得的平均直腸溫度。病毒中和抗體對于殺死的全病毒疫苗，使用待通過血清抗體中和的dr13毒株進行病毒中和測定。每組的計算的平均vn滴度呈現(xiàn)于表5中。從該表可以得出結(jié)論，dr13kv抗原以明顯的劑量反應(yīng)方式誘導(dǎo)良好的vn滴度?？雌饋恚瑢?yīng)于3.0e6tcid50殺死的全pedv的最小劑量是誘導(dǎo)高于5log2的vn滴度所必需的。本實施例的結(jié)果證實了實施例2的結(jié)果。表5.pedv中和抗體滴度(log2/50μl)。以第一次接種疫苗后的周數(shù)表示時間(t)。對于亞單位疫苗，使用替代vn測試。這是因為在其它vn測試中使用的dr13-gfp毒株的刺突蛋白與衍生s1亞單位的us分離株的刺突蛋白約93.3％相同，并且與毒株gd01的刺突約92.7％相同。該序列差異可能解釋為什么在其它測試中不能檢測到vn抗體。因此，在每組中合并血清，并在允許使用dr13-gfp或gd01毒株的替代vn測試中測定血清中和抗體的存在。結(jié)果概述于表6中。表6.合并血清中的pedv中和抗體滴度(log2/50μl)。以第一次接種疫苗后的周數(shù)表示時間(t)。實際上，dr13毒株看起來不適合于檢測由亞單位疫苗誘導(dǎo)的vn滴度。然而，殺死的全病毒疫苗的合并血清中的dr13中和抗體滴度看起來與在第一次接種疫苗后4、5和6周個別測定的vn滴度的組平均值良好對應(yīng)(結(jié)果未顯示)。該結(jié)果證明：(i)可以合并血清以建立每組的vn滴度，和(ii)用于測定合并血清中的vn滴度的替代vn測定法提供與針對dr13-gfp專門開發(fā)的vn測定法相似的結(jié)果。如果測定gd01中和抗體滴度，則s1亞單位的結(jié)果(如表6、右側(cè)欄中所示)如下：除了s1-n-fc，它們都誘導(dǎo)vn滴度。數(shù)據(jù)顯示：(i)完整s1或其c-末端部分是用于觸發(fā)vn抗體應(yīng)答的良好抗原，和(ii)具有fc片段的c-末端延伸改善免疫應(yīng)答。此外，顯示10μg的s1亞單位能夠誘導(dǎo)vn滴度，其至少與用每劑量包含3e06tcid50殺死的全ped病毒的疫苗獲得的水平相同。因此，10μg的s1亞單位是對應(yīng)于至少3e06tcid50殺死的全ped病毒的劑量。為了檢查這后一種對應(yīng)關(guān)系，使用x-solve佐劑和0.4μg-2.0μg-10μg-50μg的s1亞單位的劑量范圍制作劑量-反應(yīng)曲線。在im接種疫苗(引發(fā)-加強方案，其具有三周的時間間隔)之后，較低劑量導(dǎo)致約僅1的最大vn滴度(log2/50μl，接種疫苗后6周)，而10μg組具有6.5的vn滴度，而50μg組具有7.0的vn滴度。這證實了10μg的s1亞單位是對應(yīng)于至少3e06tcid50殺死的全ped病毒(即，確定的能夠誘導(dǎo)至少5的vn滴度的最小劑量)的劑量。針對刺突的s1亞單位的抗體在接種疫苗后的最后兩個時間點，對上述合并的血清進行elisa。elisa數(shù)據(jù)與vn滴度良好對應(yīng)(參見表7)。表7.s1elisa中測量的1:900稀釋的血清的od450值。以第一次接種疫苗后的周數(shù)表示時間(t)。當(dāng)前第1頁12