本申請要求2014年4月8日提交的第61/976,791號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)和任何權(quán)益，該申請的內(nèi)容通過引用整體并入本文中。

公開領(lǐng)域

本公開涉及用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)或個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的方法。具體地講，本公開涉及包括人乳寡糖的營養(yǎng)組合物用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)或個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的用途。

背景

免疫系統(tǒng)在保護(hù)個體免受病原體感染中起重要作用。通常，免疫反應(yīng)的有效性取決于免疫系統(tǒng)檢測和響應(yīng)病原體感染的能力。免疫系統(tǒng)對病原體感染的檢測和響應(yīng)依賴于特定免疫蛋白的表達(dá)。

概述

本文公開了用于增強(qiáng)個體中的粘膜先天免疫的方法。這種免疫是通過向個體施用包括人乳寡糖(HMO)的營養(yǎng)組合物來增強(qiáng)。

公開了一種用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的方法。所述方法包括向個體施用營養(yǎng)組合物的步驟。所述營養(yǎng)組合物包括約0.05至約0.5mg/mL 2’-巖藻糖基乳糖(2’-FL)、約0.05至約0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的組合。

本公開還提供了用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的營養(yǎng)組合物，其中所述營養(yǎng)組合物包含約0.05至約0.5mg/mL 2’-巖藻糖基乳糖(2’-FL)、約0.05至約0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的組合。

本公開還提供了營養(yǎng)組合物用于制造用來增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的藥物的用途，其中所述組合物包含約0.05至約0.5mg/mL 2’-FL、約0.05至約0.5mg/mL LNnT或二者的組合。

在另一個方面，公開了一種用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的方法。所述方法包括向個體施用營養(yǎng)組合物的步驟。所述營養(yǎng)組合物包括中性人乳寡糖。

本公開還提供了用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的營養(yǎng)組合物，其中所述營養(yǎng)組合物包含中性人乳寡糖。

本公開還提供了營養(yǎng)組合物用于制造用來增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的藥物的用途，其中所述組合物包含中性人乳寡糖。

附圖簡述

圖1(A-D)提供了圖表，其示出了在暴露于實(shí)施例1中所述的各種治療的細(xì)胞中編碼各種粘膜先天免疫受體蛋白和細(xì)胞因子IL1B的基因的RNA表達(dá)水平的變化。

圖2是示出了在暴露于實(shí)施例2中所述的各種治療的細(xì)胞中編碼粘膜先天免疫防御蛋白MUC2的基因的RNA表達(dá)水平的變化的圖表。

詳述

本公開涉及用于增強(qiáng)個體中的粘膜先天免疫的方法。更明確地說，這種免疫是通過向個體施用包括人乳寡糖(HMO)的營養(yǎng)組合物來增強(qiáng)。

公開了一種用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的方法。所述方法包括向個體施用營養(yǎng)組合物的步驟。所述營養(yǎng)組合物包括約0.05至約0.5mg/mL 2’-巖藻糖基乳糖(2’-FL)、約0.05至約0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的組合。

本公開還提供了用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的營養(yǎng)組合物，其中所述營養(yǎng)組合物包含約0.05至約0.5mg/mL 2’-巖藻糖基乳糖(2’-FL)、約0.05至約0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的組合。

本公開還提供了營養(yǎng)組合物用于制造用來增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的藥物的用途，其中所述組合物包含約0.05至約0.5mg/mL 2’-FL、約0.05至約0.5mg/mL LNnT或二者的組合。

在另一個方面，公開了一種用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的方法。所述方法包括向個體施用營養(yǎng)組合物的步驟。所述營養(yǎng)組合物包括中性人乳寡糖。

本公開還提供了用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的營養(yǎng)組合物，其中所述營養(yǎng)組合物包含中性人乳寡糖。

本公開還提供了營養(yǎng)組合物用于制造用來增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的藥物的用途，其中所述組合物包含中性人乳寡糖。

在本說明書中，涉及方法的內(nèi)容在適當(dāng)?shù)臅r候也適用于組合物，反之亦然。

本公開的適用性的其它范圍將從下文提供的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求變得顯而易見。應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述(包括公開的實(shí)施方案和附圖)在本質(zhì)上僅僅是示例性的，僅旨在用于說明的目的，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍、其應(yīng)用或用途。

除非本文另有說明，否則術(shù)語“施用”應(yīng)該被理解為包括：a)向個體提供營養(yǎng)組合物；b)消耗營養(yǎng)組合物的行為；及其組合。

除非本文另有說明，否則如本文所使用的術(shù)語“營養(yǎng)組合物”指的是各種形式的營養(yǎng)產(chǎn)品，包括但不限于：液體、固體、粉末、半固體、半液體、營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及本領(lǐng)域中已知的任何其它營養(yǎng)食品。應(yīng)當(dāng)理解的是，在施用給個體(例如，提供給個體或被其消耗)之前，粉末形式的營養(yǎng)組合物可以在加入水或其它液體后被重構(gòu)以形成液體營養(yǎng)組合物。如下面所討論，在本文所公開的某些實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物包括下列中的至少一種：蛋白質(zhì)來源、碳水化合物來源和脂肪來源。本文所公開的營養(yǎng)組合物通常適用于由人口服消耗。

除非本文另有說明，否則術(shù)語“個體”是指哺乳動物，包括但不限于：人、馴養(yǎng)家畜(例如，牛、馬、豬)或?qū)櫸?例如，狗、貓)。在本文所公開的某些實(shí)施方案中，個體是人。

除非本文另有說明，否則術(shù)語“大體上不含”意指營養(yǎng)組合物含有小于功能量的成分。這個量會根據(jù)成分而變化，但以這種成分的重量計(jì)，通常小于約1％，包括小于約0.5％，包括小于約0.1％，包括小于約0.01％，包括小于約0.001％，并且還包括0％。

除非本文另有說明，否則如本文所使用的術(shù)語“人乳寡糖”或“HMO”是指在人母乳中發(fā)現(xiàn)的許多復(fù)合碳水化合物(其可以為酸性或中性形式)和其前體。示例性人乳寡糖包括但不限于乳-N-新四糖和2'-巖藻糖基乳糖。示例性人乳寡糖前體包括但不限于巖藻糖。作為人母乳的自然成分，HMO的特性在很大程度上被認(rèn)為是良性的。術(shù)語“人乳寡糖”或“HMO”應(yīng)該被理解為包括“中性HMO”，例如巖藻糖基化寡糖和N-乙酰化寡糖。

用于本文所公開的方法中的營養(yǎng)組合物可以包含如本文所描述的產(chǎn)品的元素以及本文所描述的或在營養(yǎng)產(chǎn)品應(yīng)用中另外有用的任何額外的或可選的元素、由其組成或基本上由其組成。例如，如本文所使用，術(shù)語“包含”意指組合物或方法包括所列舉的特征，但是不排除其它特征，并且術(shù)語“由…組成”意指組合物或方法僅包括所列舉的特征。

除非本文另有說明，否則所提供的HMO的濃度是在施用給個體的營養(yǎng)組合物中的HMO的濃度。所述濃度是在稀釋濃縮液體或?qū)⒎勰┡c液體混合以形成適于施用給個體的液體營養(yǎng)組合物后的最終濃度。

如先前所論述，本文公開了用于增強(qiáng)個體中的粘膜先天免疫的方法。在一些實(shí)施方案中，粘膜先天免疫增強(qiáng)涉及增強(qiáng)下列中的一者或二者：個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)和個體對病原體的粘膜先天免疫檢測。該增強(qiáng)是通過向個體施用包括一種或多種HMO的營養(yǎng)組合物而實(shí)現(xiàn)，如本文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。

通常，包括在用于本文所公開的方法中的營養(yǎng)組合物中的HMO可以包括本領(lǐng)域中已知的多種HMO中的任一個。此類HMO包括在人母乳中發(fā)現(xiàn)的寡糖。在某些實(shí)施方案中，適用于在所公開的方法中使用的營養(yǎng)組合物的HMO包括任何中性HMO，包括HMO前體。中性HMO和前體的具體非限制性實(shí)例包括：D-葡萄糖(Glc)；D-半乳糖(Gal)；L-巖藻糖(Fuc)；乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-六糖、對-乳-N-六糖、乳-N-新六糖、對-乳-N-新六糖；巖藻糖基寡糖(即，乳-N-巖藻五糖I；乳-N-巖藻五糖II；2'-巖藻糖基乳糖；3'-巖藻糖基乳糖；乳-N-巖藻五糖III；乳-N-二巖藻六糖I；和乳二巖藻四糖)。這些HMO更全面地描述于美國專利申請公開第2009/0098240號中，該申請?jiān)诖送ㄟ^引用整體并入本文中。在某些實(shí)施方案中，用于在所公開的方法中使用的營養(yǎng)組合物中的HMO包括以下HMO中的至少一種：乳-N-新四糖(LNnT)和2'-巖藻糖基乳糖(2’-FL)。

在某些實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物可以包括或不包括本文所公開的任何HMO或HMO的組合。在具體實(shí)施方案中，當(dāng)營養(yǎng)組合物包括LNnT或2'-FL時，營養(yǎng)組合物大體上不含其它HMO。在其它實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物包括LNnT和2'-FL二者。另外，在具體實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物大體上不含除LNnT或2'-FL以外的任何HMO。換句話說，在這樣的實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物可以：(1)含有LNnT，但大體上不含所有其它HMO；(2)含有2'-FL，但大體上不含所有其它HMO；或(3)可以含有LNnT和2'-FL，但大體上不含所有其它HMO。

在一些實(shí)施方案中，HMO是以在營養(yǎng)組合物中的HMO的總量(即，存在的所有HMO)(mg總HMO/mL施用的營養(yǎng)組合物)為至少約0.001mg/mL存在于營養(yǎng)組合物中，包括至少約0.01mg/mL，包括約0.001mg/mL至約20mg/mL，包括約0.01mg/mL至約20mg/mL，包括約0.001mg/mL至約10mg/mL，包括約0.01mg/mL至約10mg/mL，包括約0.001mg/mL至約5mg/mL，包括約0.01mg/mL至約5mg/mL，包括約0.001mg/mL至約1mg/mL，包括約0.001mg/mL至約0.23mg/mL，包括約0.01mg/mL至約0.23mg/mL總HMO含于營養(yǎng)組合物中。通常，營養(yǎng)組合物中的總HMO的量將取決于所存在的一種或多種特定HMO以及營養(yǎng)組合物中的其它組分的量。

在2’-FL存在于營養(yǎng)組合物中并且該營養(yǎng)組合物被用于增強(qiáng)對病原體的粘膜先天免疫檢測的方法中的一些實(shí)施方案中，2’-FL是以約0.001mg/mL至約2.5mg/mL，包括約0.01mg/mL至約2.5mg/mL的量存在。在一些實(shí)施方案中，2’-FL是以小于1mg/mL的濃度存在于營養(yǎng)組合物中，包括小于0.5mg/mL，包括約0.05至約0.5mg/mL，且包括約0.05至約0.25mg/mL。

在2’-FL存在于營養(yǎng)組合物中并且該營養(yǎng)組合物被用于增強(qiáng)對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的方法中的其它實(shí)施方案中，2’-FL是以小于1mg/mL，包括小于0.5mg/mL，包括約0.05至約0.5mg/mL，且包括約0.05至約0.25mg/mL的濃度存在。

在LNnT存在于營養(yǎng)組合物中的一些實(shí)施方案中，LNnT是以約0.001mg/mL至小于約0.2mg/mL，包括約0.01mg/mL至小于約0.2mg/mL，以及大于約0.32mg/mL，包括約2mg/mL的量存在。在一些實(shí)施方案中，LNnT是以小于1mg/mL，包括小于0.5mg/mL，包括約0.05至約0.5mg/mL，且包括約0.25mg/mL至約0.5mg/mL的濃度存在于營養(yǎng)組合物中。

在一些實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物可以含有任何本文所公開的HMO的任何組合。這些HMO可以以個別HMO濃度的任何組合或本文所公開的總HMO濃度存在。因此，在一些實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物包括LNnT和2'-FL二者，它們各自具有小于1mg/mL的濃度。在具體的實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物包括LNnT和2'-FL，它們各自具有約0.05至約0.5mg/mL的濃度。

在某些實(shí)施方案中，HMO是合成的，例如，通過微生物發(fā)酵、酶處理、化學(xué)合成或其組合而產(chǎn)生。

申請人已意外地發(fā)現(xiàn)，特定HMO(例如，LNnT和2'-FL)可以用于增強(qiáng)個體中的粘膜先天免疫。出乎意料的是，這些HMO可以用于增強(qiáng)下列中的一個或多個：個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)以及對病原體的粘膜先天免疫檢測。申請人已經(jīng)鑒定了方法，其包括施用含有一種或多種HMO(包括上述的那些HMO)的營養(yǎng)組合物來增強(qiáng)個體的粘膜先天免疫。

在一些實(shí)施方案中，個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)是通過施用包括LNnT和2'-FL中的一個或兩個的營養(yǎng)組合物來增強(qiáng)。在這些實(shí)施方案的某些中，如果存在，2'-FL是以約0.05至約0.5mg/mL的濃度存在，且如果存在，LNnT是以約0.05至約0.5mg/mL的濃度存在。

不受理論的束縛，據(jù)信本文所公開的方法(即，施用包含上述HMO的營養(yǎng)組合物)通過增加免疫蛋白的表達(dá)來增強(qiáng)個體中對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，向個體施用營養(yǎng)組合物通過增加以下物質(zhì)的表達(dá)來增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)：一種或多種粘膜先天免疫受體、一種或多種細(xì)胞因子、一種或多種粘膜先天免疫防御蛋白或其組合。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)中增加的粘膜先天免疫受體是Toll樣受體3(TLR3)、Toll樣受體4(TLR4)和趨化因子受體2(CCR2)中的一種或多種。在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞因子白介素-1β(IL1B)的表達(dá)增加。在特別具體的實(shí)施方案中，粘膜先天免疫防御蛋白是粘蛋白2(MUC2)。不受理論的束縛，據(jù)信粘膜先天免疫受體和細(xì)胞因子的表達(dá)增加可以通過增強(qiáng)先天防御和/或改善粘膜免疫功能來增強(qiáng)對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)。這些受體的表達(dá)增加被認(rèn)為導(dǎo)致具有抗微生物活性的粘膜先天免疫防御蛋白(包括MUC2)的表達(dá)增加，這導(dǎo)致增強(qiáng)的抗微生物反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，個體對病原體的粘膜先天免疫檢測是通過施用包括中性HMO的營養(yǎng)組合物來增強(qiáng)。中性HMO可以是任何中性HMO，包括上文所列舉的任何中性HMO。在特別具體的實(shí)施方案中，用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的中性HMO是2’-FL。在2’-FL是中性HMO的那些實(shí)施方案中，2’-FL可以以本文所公開的任何濃度存在于營養(yǎng)組合物中。在特定的實(shí)施方案中，2’-FL是以小于1mg/mL的濃度存在于營養(yǎng)組合物中。在另一個特別具體的實(shí)施方案中，用于增強(qiáng)個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的中性HMO是LNnT。在LNnT是中性HMO的那些實(shí)施方案中，LNnT可以以本文所公開的任何濃度存在于營養(yǎng)組合物中。在特定的實(shí)施方案中，LNnT是以小于1mg/mL的濃度存在于營養(yǎng)組合物中。

不受理論的束縛，據(jù)信本文所公開的方法(即，施用包含上述HMO的營養(yǎng)組合物)通過增加免疫蛋白的表達(dá)來增強(qiáng)個體中對病原體的粘膜先天免疫檢測。在一些實(shí)施方案中，向個體施用營養(yǎng)組合物通過增加一種或多種粘膜先天免疫受體的表達(dá)和/或通過增加一種或多種細(xì)胞因子的表達(dá)來增強(qiáng)個體的粘膜先天免疫檢測。在特定實(shí)施方案中，粘膜先天免疫受體是TLR3、TLR4和CCR2中的一個或多個。在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是IL1B。不受理論的束縛，據(jù)信這些受體和/或IL1B的表達(dá)增加通過增加個體對病原體的免疫監(jiān)視來增強(qiáng)對病原體的粘膜先天免疫檢測。

在一些實(shí)施方案中，本文所公開的方法涉及施用具有HMO的選定組合的營養(yǎng)組合物。HMO的組合可以是本文所公開的或本領(lǐng)域中另外已知的HMO的任何組合，只要該組合能有效增加粘膜先天免疫。在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及施用含有2’-FL和LNnT中的一種而非兩種的營養(yǎng)組合物。在其它實(shí)施方案中，所述方法涉及施用大體上不含除2’-FL或LNnT以外的任何HMO的營養(yǎng)組合物。

在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及施用營養(yǎng)組合物，其包括濃度各自低于約0.5mg/mL的LNnT和/或2’-FL。在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及施用含有約0.05至約0.25mg/mL 2’-FL和/或約0.25mg/mL至約0.5mg/mL LNnT的營養(yǎng)組合物。

在一些實(shí)施方案中，本文所公開的方法涉及施用包括下列中的至少一種的營養(yǎng)組合物：蛋白質(zhì)來源、碳水化合物來源和脂肪來源。應(yīng)當(dāng)理解的是，蛋白質(zhì)來源包括一種或多于一種蛋白質(zhì)來源，碳水化合物來源包括一種或多于一種碳水化合物來源，并且脂肪來源包括一種或多于一種脂肪來源。另外，某些來源可以提供一種以上的常量營養(yǎng)物(例如，脂肪和蛋白質(zhì))。

在其中營養(yǎng)組合物包括蛋白質(zhì)來源的那些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)來源可以包括但不限于下列中的一個或多個：乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、乳清蛋白水解物、酸性酪蛋白、酪蛋白酸鈉、酪蛋白酸鈣、酪蛋白酸鉀、酪蛋白水解物、乳蛋白濃縮物、乳蛋白分離物、乳蛋白水解物、脫脂奶粉、濃縮脫脂乳、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、大豆蛋白水解物、豌豆蛋白濃縮物、豌豆蛋白分離物、豌豆蛋白水解物、膠原蛋白、馬鈴薯蛋白、大米蛋白、真菌蛋白、由微生物表達(dá)的蛋白質(zhì)及其組合。

在其中營養(yǎng)組合物包括碳水化合物來源的那些實(shí)施方案中，所述碳水化合物來源可以包括但不限于下列中的一個或多個：麥芽糊精；水解或改性淀粉或玉米淀粉；葡萄糖聚合物；玉米糖漿；玉米糖漿固體；大米來源的碳水化合物；高果糖玉米糖漿；蜂蜜；糖醇，諸如麥芽糖醇、赤蘚糖醇、山梨糖醇、甘油；蔗糖；葡萄糖；果糖；乳糖；異麥芽酮糖、舒可曼(sucromalt)、普魯蘭(pullulan)、馬鈴薯淀粉和其它緩慢消化的碳水化合物；寡糖，諸如寡聚果糖或寡聚半乳糖；膳食纖維，包括但不限于燕麥纖維、菊粉、聚右旋糖、大豆纖維、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、瓜耳膠、結(jié)冷膠、刺槐豆膠、魔芋粉、羥丙基甲基纖維素、黃蓍膠、刺梧桐膠、阿拉伯膠、殼聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、黃原膠、藻酸鹽、果膠、低和高甲氧基果膠、谷類β-葡聚糖、角叉菜膠和洋車前子、水溶性膳食纖維如耐消化性麥芽糊精、抗性改性食物淀粉、其它抗性淀粉；水果或蔬菜來源的可溶性和不溶性纖維；及其組合。

在其中營養(yǎng)組合物包括脂肪來源的那些實(shí)施方案中，所述脂肪來源可以包括但不限于下列中的一個或多個：椰子油、分餾椰子油、大豆油、玉米油、橄欖油、紅花油、高油酸紅花油、中鏈甘油三酯油、高γ-亞麻酸紅花油、向日葵油、高油酸向日葵油、棕櫚油、棕櫚仁油、棕櫚油精、菜籽油、海洋油、藻類油、棉籽油、互酯化油、轉(zhuǎn)酯化油、甘油單酯、甘油二酯、游離脂肪酸及其組合。營養(yǎng)組合物還可以包括本文所描述的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪來源的任何組合。

通常，本文所公開的方法涉及以允許增強(qiáng)對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)和/或增強(qiáng)對病原體的粘膜先天免疫檢測的任何方式施用營養(yǎng)組合物。

在一些實(shí)施方案中，本文所公開的方法涉及將營養(yǎng)組合物口服施用給個體。如本文所定義，口服施用包括其中營養(yǎng)組合物通過個體的食道的任何施用方式。例如，口服施用通常是指口服食用，但還可以包括鼻胃插管，其中將一根管子從個體的鼻部移動到胃部以施用組合物。特別合適的口服制劑包括營養(yǎng)飲料、粉末、棒狀物、凝膠或撒在食物上或溶解在水中的囊袋(sachet)。

一般，在本文所公開的方法中使用的營養(yǎng)組合物可以是能夠有效地提供給個體以增強(qiáng)個體的粘膜先天免疫的任何形式。在具體的實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物為以下形式中的一種或多種：液體和粉狀膳食補(bǔ)充劑、液體和粉狀人乳強(qiáng)化劑、液體和粉狀早產(chǎn)嬰兒配方、液體和粉狀嬰兒配方、液體和粉狀要素和半要素配方、液體和粉狀兒科配方、液體和粉狀幼兒配方、液體和粉狀較大嬰兒配方以及液體、粉狀和固體成人營養(yǎng)配方。

在其它實(shí)施方案中，所述方法涉及向個體局部施用HMO(例如，2’-FL、LNnT或兩者)。局部施用涉及將包括HMO的組合物施加到其中將發(fā)生充分吸收的部位(例如，粘膜表面如鼻腔、肺腔、陰道腔、眼或皮膚)。局部施用的常見形式包括但不限于：滴劑、噴霧劑、乳膏、軟膏、洗劑、糊劑、凝膠劑、氣霧劑和沐浴油。

在本文所公開的方法中施用的營養(yǎng)組合物通常可以通過本領(lǐng)域中已知的方法來制備。此類方法公開于多個專利申請公開和專利中，包括美國專利公開2012/0172307A1、美國專利6,365,218、美國專利6,306,908和美國專利公開2003/0118703A1，它們各自通過引用并入本文中以用于參考此類方法的公開內(nèi)容。

例如，在一種合適的制造方法中，制備至少三種不同的漿料，包括脂肪包蛋白質(zhì)(PIF)漿料、碳水化合物-礦物質(zhì)(CHO-MIN)漿料和水包蛋白質(zhì)(PIW)漿料。PIF漿料是通過加熱和混合油(例如，菜籽油、玉米油等)以及然后在持續(xù)加熱和攪動下添加乳化劑(例如，卵磷脂)、脂溶性維生素和總蛋白質(zhì)的一部分(例如，乳蛋白濃縮物)而形成。CHO-MIN漿料是通過在加熱攪動下將礦物質(zhì)(例如，檸檬酸鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉等)、痕量和超痕量礦物質(zhì)(TM/UTM預(yù)混物)、增稠劑或懸浮劑(例如微晶纖維素(avicel)、結(jié)冷膠、角叉菜膠)加入水中而形成。所得的CHO-MIN漿料保持繼續(xù)加熱和攪動10分鐘，然后添加其它礦物質(zhì)(例如，氯化鉀、碳酸鎂、碘化鉀等)和/或碳水化合物(例如，HMO、寡聚果糖、蔗糖、玉米糖漿等)。然后通過加熱混合和攪拌剩余的蛋白質(zhì)(如果有的話)形成PIW漿料。然后通過加熱攪拌將所得漿料混合在一起并將pH調(diào)節(jié)至6.6-7.0，之后對該組合物進(jìn)行高溫短時(HTST)加工，在此期間該組合物經(jīng)熱處理、乳化和均質(zhì)化，且然后冷卻。添加水溶性維生素和抗壞血酸，必要時將pH調(diào)節(jié)至所需范圍，添加香料，并加水以達(dá)到所需的總固體水平。然后無菌包裝所述組合物以形成無菌包裝的營養(yǎng)乳液。該乳液然后可以進(jìn)一步被稀釋，經(jīng)熱處理，并包裝形成即食或濃縮液體，或者它可以經(jīng)熱處理并且隨后被加工和包裝成可復(fù)水粉末，例如噴霧干燥的、干混的、團(tuán)聚的。

在一些實(shí)施方案中，本文所公開的方法是針對對病原體感染具有特定傾向或易感性的個體或可能已經(jīng)表現(xiàn)出感染癥狀的個體。此類個體可以被認(rèn)定為“需要”治療。在具體的實(shí)施方案中，“需要”治療的個體具有下列中的一個或多個：腸道感染、炎性腸病、腸易激綜合征、壞死性小腸結(jié)腸炎、結(jié)腸炎、腸梗阻、慢性應(yīng)激、其它胃腸道疾病、抗生素療法、放射療法、化學(xué)療法、手術(shù)、其它治療或療法；和脫水。

具有增強(qiáng)的粘膜先天免疫的個體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來鑒定。在一些實(shí)施方案中，個體對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)的增強(qiáng)是由通過個體具有先天免疫受體、選擇細(xì)胞因子和先天免疫防御蛋白中的一種或多種的增加表達(dá)來鑒定。先天免疫受體是TLR3、TLR4和CCR2中的一個或多個。IL1B是選擇細(xì)胞因子的實(shí)例。先天免疫防御蛋白優(yōu)選是MUC2。

在一些實(shí)施方案中，個體對病原體的粘膜先天免疫檢測的增強(qiáng)是由通過個體具有先天免疫受體和選擇細(xì)胞因子中的一種或多種的增加表達(dá)來鑒定。如上所討論，先天免疫受體是TLR3、TLR4和CCR2中的一個或多個。IL1B是選擇細(xì)胞因子的實(shí)例。

在一些實(shí)施方案中，個體對病原體的粘膜先天免疫檢測、對病原體的粘膜先天免疫反應(yīng)或兩者的增強(qiáng)是通過在將本文所公開的營養(yǎng)組合物施用給模型生物體之后在該模型生物體中測量先天免疫受體、選擇細(xì)胞因子和先天免疫防御蛋白中的一種或多種的表達(dá)變化來鑒定。模型生物體可以是用于測量這些性質(zhì)的任何已知的模型生物體。在一些實(shí)施方案中，模型生物體是豬，并且具體地說是小豬。

實(shí)施例

以下實(shí)施例說明本文所公開的方法的具體和示例性實(shí)施方案、特征或二者。雖然這些實(shí)施例描述了本文所述的特定HMO的使用，但是應(yīng)該認(rèn)識到，下文所述的方案可以用于測試任何HMO和由其制成的營養(yǎng)組合物增強(qiáng)個體中的粘膜先天免疫的能力。這些實(shí)施例只是為了說明的目的而提供并且不應(yīng)被視為對本公開的限制。

實(shí)施例1：HMO增加粘膜先天免疫受體和選擇細(xì)胞因子的表達(dá)

在此研究中，暴露于2’-FL或LNnT的細(xì)胞在體外暴露分析中單獨(dú)表現(xiàn)出增加的粘膜先天免疫受體的表達(dá)。

通過將LS174T人結(jié)直腸癌細(xì)胞(其為人腸道杯狀細(xì)胞的模型)暴露于HMO(2’-FL或LNnT)中的任一個來測試HMO增加粘膜先天免疫受體和細(xì)胞因子的表達(dá)的能力。LS174T細(xì)胞是從美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。LS174T細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10％Fetalplex、1.5g/L Na₂CO₃、10ml/L青霉素G-鏈霉素溶液的37℃5％CO₂下的最低必需培養(yǎng)基中。將細(xì)胞以0.2x 10⁵個細(xì)胞/ml/孔接種在24孔板上，并使其附著24-30小時。通過將凍干的HMO再懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)級水中至10％溶液并過濾滅菌，然后在培養(yǎng)基中稀釋到適當(dāng)?shù)乃絹碇苽浜懈鱄MO的溶液。使用相同的程序制備不含碳水化合物的溶液(即，僅有新鮮培養(yǎng)基，對照)。在制備含HMO的溶液之后，用1X HBSS沖洗LS174T細(xì)胞培養(yǎng)物，然后在0.5ml單獨(dú)的新鮮培養(yǎng)基(對照)或含有0.1mg/mL或1mg/mL 2’-FL(2FL)、LNnT(LNnT)、巖藻糖(FUCOSE)或乳糖(LAC)的新鮮培養(yǎng)基中孵育48小時。在孵育結(jié)束時用1ml TRIzol收獲細(xì)胞以獲得RNA樣品。

通過來自這些細(xì)胞的RNA樣品的定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測定粘膜先天免疫受體蛋白TLR3、TLR4、CCR2和細(xì)胞因子IL1B的基因的RNA表達(dá)水平。所述受體蛋白和細(xì)胞因子的基因的RNA表達(dá)水平的倍數(shù)變化(倍數(shù)誘導(dǎo))基于GUSB轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的變化進(jìn)行歸一化。記錄的倍數(shù)變化是平均值+/-3SEM。在倍數(shù)表達(dá)方面具有統(tǒng)計(jì)顯著差異的治療(P<0.05)用不同的字母在條形柱上記錄。

如圖1A-1D中所示，暴露于濃度為1mg/mL的2’-FL的細(xì)胞相對于對照表現(xiàn)出所述四種基因中每一種的RNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性倍數(shù)變化。暴露于濃度為0.1mg/mL的2’-FL的細(xì)胞相對于對照表現(xiàn)出TLR3、TLR4和CCR2的RNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性倍數(shù)變化。出乎意料的是，這些基因響應(yīng)于0.1mg/mL 2’-FL治療比響應(yīng)于1mg/mL2’-FL治療具有更大的表達(dá)增加。特別出乎意料的是以下結(jié)果：在所測試的HMO中，只有2’-FL在0.1mg/mL的較低水平下顯示出多于一種基因(更具體地說，三種基因)的表達(dá)增加。

圖1A-1D中還示出了將細(xì)胞暴露于1mg/mL LNnT相對于對照產(chǎn)生所有四種基因的顯著的表達(dá)變化。CCR2表達(dá)在0.1mg/mL的LNnT濃度下也顯著提高。

實(shí)施例2：HMO增加粘膜先天免疫防御蛋白的表達(dá)

在此研究中，暴露于2’-FL的細(xì)胞在體外暴露分析中單獨(dú)表現(xiàn)出增加的粘膜先天免疫防御蛋白MUC2的表達(dá)。

如實(shí)施例1中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了qRT-PCR分析的目標(biāo)是測量編碼MUC2的基因的RNA表達(dá)以外。如圖2中所示，暴露于0.1mg/mL 2’-FL的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增加的MUC2基因表達(dá)。

除非本文另有說明，否則所有子實(shí)施方案和任選的實(shí)施方案是本文所述的所有實(shí)施方案的相應(yīng)的子實(shí)施方案和任選的實(shí)施方案。雖然本申請已通過其實(shí)施方案的描述加以說明，且雖然已相當(dāng)詳細(xì)地描述了這些實(shí)施方案，但申請人無意將隨附權(quán)利要求的范圍約束或以任何方式限制于這樣的細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易了解其它優(yōu)點(diǎn)和修改。因此，本申請?jiān)诟鼜V泛的方面并不限于所示出和描述的具體細(xì)節(jié)、代表性組合物或制劑和說明性實(shí)施例。因此，在不脫離本文中申請人的一般公開內(nèi)容的精神或范圍的情況下可以違背此類細(xì)節(jié)。

就在本說明書或權(quán)利要求中使用術(shù)語“包括(includes/including)”而言，其旨在以類似于術(shù)語“包含”在被用在權(quán)利要求中作為連接詞時所解釋的方式具有包含性。此外，就采用術(shù)語“或”(例如A或B)而言，旨在意指“A或B或兩者”。當(dāng)申請人意圖指示“僅A或B而非兩者”時，將采用術(shù)語“僅A或B而非兩者”。因此，在本文中使用術(shù)語“或”是包含性而非排它性使用。另外，就在本說明書或權(quán)利要求中使用術(shù)語“在...中”或“到...中”而言，其旨在另外意指“在...上”或“到...上”。此外，就在本說明書或權(quán)利要求中使用術(shù)語“連接”而言，其旨在不僅意指“直接連接”，而且還意指“間接連接”，諸如經(jīng)由另外一個或多個組件連接。

如在本發(fā)明的說明和隨附權(quán)利要求書中所使用，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”意圖也包括復(fù)數(shù)形式。