本申請對2014年3月19日提出于韓國專利局的韓國專利申請第10-2014-0032356號主張優(yōu)先權(quán)，上述申請的公開內(nèi)容作為參照插入于本說明書。

本發(fā)明涉及將枳實（Poncirus trifoliata）提取物作為有效成分的抗流行性感冒病毒組合物。

背景技術(shù)：

流行性感冒病毒為在人和動物身上呈現(xiàn)出高的發(fā)病率和死亡率的呼吸器官疾病的原因。流行性感冒病毒有A型、B型及C型，在A型中作為亞種有H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N9、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H5N2及H10N7。在禽流感的情況下，一直認(rèn)為僅在禽類和豬之間傳染，但是，1997年，在香港發(fā)生了與感染上述病毒的禽類相接觸的人中的18名被感染，且其中6名死亡的事件，從而得知人類也會被感染。2003年，因禽流感，在香港2名感染者中的1名死亡，在荷蘭83名感染者中1名獸醫(yī)死亡，且全世界約300名以上的人被感染并呈現(xiàn)出60％以上的死亡率，在香港引起死亡的病毒為H5N1病毒，而在荷蘭引起死亡的病毒為H7N7病毒。尤其，在上述病毒中，高致病性的H5N1流行性感冒A病毒的變異極快，而且也容易向其他動物轉(zhuǎn)移。被感染的禽類與其他雞、飼養(yǎng)鴨相接觸或者通過排泄物來傳播禽流感，因此很難預(yù)防。尤其，問題在于，可通過被感染的禽類容易向人類傳染。若人類感染到禽流感，則發(fā)生變種病毒的可能性更大，引起突變的變種病毒可引起人與人之間的傳播。即，有可能產(chǎn)生被發(fā)生人與人之間傳染的變種病毒。

2009年4月，作為流行性感冒A型病毒的新重組體的H1N1病毒最初在墨西哥和美國傳染到94名的人（疾病預(yù)防控制中心疾病預(yù)防控制中心（CDC）2009）。同年4月之后，上述病毒繼續(xù)轉(zhuǎn)移到人與人之間，從而在2009年6月11日，世界衛(wèi)生組織將上述病毒分類為21世紀(jì)的第一大型流行性感冒（世界衛(wèi)生組織（WHO）2009）。

2013年，發(fā)生了A型流行性感冒的H7N9禽流流行性感冒，且還使人體感染，因而，存在在中國，直至2014年2月死亡人數(shù)達(dá)22名的事例。

在季節(jié)性流感的情況下，引起上述季節(jié)性流感的原因為H1N1、H3N2流行性感冒A病毒，在全世界每年250000～00000多名人因上述病毒而死亡。

疫苗起到防止流行性感冒病毒在動物和動物、人和人及動物和人類之間擴散的重要作用，但是，因突變發(fā)生率高的流行性感冒病毒的特性上，將以下一季節(jié)有可能流行的變種流行性感冒病毒為靶設(shè)計疫苗，因此，疫苗無法預(yù)防所有流行性感冒病毒。

作為流行性感冒治療劑，目前使用如作為M2離子通道抑制劑的金剛胺（amantadine）和金剛烷乙胺（rimantadine）、作為唾液酸苷酶抑制劑的奧塞米韋（oseltamivir）和扎那米韋（zanamivir）及作為肌苷單磷酸脫氫酶抑制劑的病毒唑（ribavirin）等的3種抗流行性感冒治療劑。上述治療劑有效減少臨床癥狀，但是因副作用及耐性病毒性變種表達(dá)而被限制使用。因此，急需對于流行性感冒的有效的抗病毒治療劑。

植物通過長時間的進(jìn)化增加了對于病毒的抵抗能力，因此，不僅具有對于流行性感冒的優(yōu)秀抗病毒效果，而且還具有對因病毒感染所引起的炎癥產(chǎn)生高的治療效果方面，作為天然“生物材料”的潛在資源備受關(guān)注。

在說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻(xiàn)，并未表了其引用。所引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確說明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

要解決的問題

本發(fā)明人員為了從來源于植物的天然提取物發(fā)掘可發(fā)揮抗流行性感冒病毒功效的物質(zhì)而進(jìn)行了研究。其結(jié)果，查明了枳實的提取物（具體地，枳實種子提取物）對多種流行性感冒病毒，例如，流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒具有非常卓越的抗病毒效果，由此完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的在于提供抗流行性感冒病毒組合物。

根據(jù)以下發(fā)明的詳細(xì)說明及發(fā)明要求保護(hù)范圍更加明確本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點。

解決問題的方案

根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供包含枳實提取物作為有效成分的抗流行性感冒病毒組合物。

本發(fā)明人員為了來源于植物的天然提取物發(fā)掘可發(fā)揮抗流行性感冒病毒功效的物質(zhì)而進(jìn)行了研究。其結(jié)果，查明了枳實的提取物（具體地，枳實種子提取物）對多種流行性感冒病毒，例如，流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒具有非常卓越的抗病毒效果，由此完成了本發(fā)明。

作為本發(fā)明的組合物的有效成分的枳實種子提取物可利用在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中公知的多種提取方法來從枳實獲得。本發(fā)明中所利用的枳實樹（Poncirus trifoliata）為在京畿道以南生長的落葉灌木，互生高度為3～5厘米的堅硬的刺。葉子互生，且為3出葉，在葉柄存在很小的翼，小葉為革質(zhì)，并呈倒卵形或橢圓形，鈍頭或微凹頭，而且還是銳底，長度為25毫米。五月開花，且為白色，頂生或腋生，結(jié)1個或2個果，5個花萼葉和花葉離生，具有很多雄蕊，在子房具有密毛。果實圓潤，且其直徑為3厘米，香氣漂浮，但無法食用，九月成熟，種子呈長的橢圓形，長度為1～1.3厘米。果實用于藥用，苗木用于橘樹的砧木，成木在南部地區(qū)用于樹籬笆（韓國植物百科全書、李昌福，經(jīng)文社，1993年）。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的枳實提取物可從枳實樹的樹干、根、葉、花瓣、花蕾獲得，更優(yōu)選地，是枳實的果實或枳實種子的提取物。

在本發(fā)明的組合物中所利用的枳實種子提取物為對枳實種子的提取溶液進(jìn)行處理來獲取的情況下，可利用多種提取溶液。優(yōu)選地，可利用極性溶劑或非極性溶劑。作為適合的極性溶劑包含：（i）水，（ii）乙醇（優(yōu)選為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、1-戊醇、2-丁氧基乙醇或乙二醇），（iii）醋酸，（iv）二甲基甲酰胺（DMFO，dimethyl-formamide）及（v）二甲基亞砜（DMSO，dimethyl sulfoxide）。作為適合的非極性溶劑包含丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸甲酯、氟代烷烴、戊烷、己烷、2，2，4-三甲基戊烷、癸烷、環(huán)己烷、環(huán)戊烷、二異丁烯、1-戊烯、1-氯丁烷、1-氯戊烷、鄰二甲苯、二異丙醚、2-氯丙烷、甲苯、1-氯丙烷、氯苯、苯、二乙醚、二乙基硫醚、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯胺、二乙胺、乙醚、四氯化碳及四氫呋喃。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，在本發(fā)明中所利用的提取溶劑包含（a）水、（b）碳數(shù)1～4的無水或含水低級醇（甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等）、（c）上述低級醇和水的混合溶劑，（d）丙酮、（e）乙酸乙酯，（f）氯仿、（g）乙酸丁酯，（h）1，3-丁二醇、（?。┖怂峒埃╦）二乙醚。

根據(jù)本發(fā)明的再一實例，本發(fā)明的枳實種子提取物通過對枳實處理水、甲醇、乙醇或它們的組合來獲得。

根據(jù)本發(fā)明的特定實例，本發(fā)明的枳實種子提取物通過對枳實種子處理乙醇進(jìn)行來獲得。

如上所述，在本說明書中所使用的術(shù)語“提取物”具有在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中通用為粗提物（crude extract）的含義，但是在廣義上，也包含對提取物進(jìn)行分餾（fractionation）分流物。即，枳實種子提取物不僅包含利用上述提取溶液來取得的枳實種子提取物提取物，而且還包含在此追加適用純化過程取得的提取物。例如，使上述提取物通過具有規(guī)定分子量截留值的超濾膜，來取得的分餾物，基于多種色譜法（為了基于大小、電荷、疏水性或親和性的分離而被制作）的分離等，追加實施的多種純化方法取得的分餾物也包含在本發(fā)明的枳實種子提取物。

在本發(fā)明中所利用的枳實種子提取物可通過減壓蒸餾及冷凍干燥或噴霧干燥等的追加過程被制成粉末狀態(tài)。

如可在以下實施例中確認(rèn)，枳實種子提取物在犬腎細(xì)胞（MDCK）中呈現(xiàn)出提高對于流行性感冒病毒感染的生存率、流行性感冒的預(yù)防及治療效果。呈現(xiàn)出與作為當(dāng)前廣泛使用的流行性感冒治療劑達(dá)菲同等以上的抗病毒功效，尤其，在3mg/ml以上的高濃度中，還完全不對細(xì)胞毒性產(chǎn)生影響，從而確認(rèn)了枳實種子提取物可用作用于流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒感染疾病的預(yù)防或治療的抗病毒劑使用的可能性。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的組合物對流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒具有0.07、13.7μg/ml的EC₅₀值（50％有效濃度（effective concentration））。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的組合物可以為基于流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型疾病的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物。

除上述說明的有效成分之外，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物包含在藥劑學(xué)上接受的載體。包含于本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上接受的載體作為制劑時通常所使用的物質(zhì)，上述藥劑學(xué)組合物包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，當(dāng)并不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除上述成分之外還可包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。藥劑學(xué)上接受的的載體及制劑詳細(xì)記載于Remington's Pharmaceutical Sciences（19th ed.,1995）。

本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥量可根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病狀、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及過敏反應(yīng)性等因素開多種處方。另一方面，優(yōu)選地，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的口服給藥量為每日0.001～100㎎/kg（體重）。

本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物可以口服或非口服給藥，在非口服給藥的情況下，可通過鼻腔、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、硬皮給藥等方式給藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)所適用的疾病的種類確定給藥途徑。

本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物通過本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易實施的方法，利用藥劑學(xué)上接受的載體和/或成型賦形劑來進(jìn)行制劑化，由此可制成單位容量形態(tài)或者可內(nèi)置于多容量容器內(nèi)來制備。此時，劑型可以為油或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以為浸膏劑、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，而且還可包含分散劑或穩(wěn)定劑。

除作為有效成分的枳實種子提取物之外，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物還可與現(xiàn)有的已公知為具有抗病毒效果的的其他藥理活性成分一同使用。例如，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物還可包含金剛烷乙胺、奧塞米韋、扎那米韋、病毒唑或者與上述藥物一同使用，由此可進(jìn)一步提高抗病毒功效。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，能夠以用于因流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒所引起的疾病的預(yù)防或改善的食品組合物的形態(tài)提供本發(fā)明的組合物。

在本發(fā)明的組合物制備成食品組的情況下，不僅包含枳實種子提取物作為有效成分，而且還包含當(dāng)制作食品時通常所添加的成分，例如，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、營養(yǎng)素、調(diào)味劑及香味劑。作為上述碳水化合物的例如下：單糖，例如，葡萄糖，果糖等；二糖，例如，麥芽糖、蔗糖、寡糖等；以及多糖，例如，如糊精、環(huán)糊精等的普通的糖及木糖醇、山梨糖醇、赤蘚等的糖醇。作為香味劑可使用天然香味劑（索馬甜、甜葉菊提取物（例如，萊鮑迪苷A、甘草甜素等。））及合成香味劑（糖精、阿斯巴甜等）。例如，在本發(fā)明的組合物制備成清涼劑的情況下，除本發(fā)明的枳實種子提取物之外，還可包含檸檬酸、液態(tài)果糖、蔗糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取液、棗提取物、甘草提取液等。

本發(fā)明的視頻組合物可用于因流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒所引起的疾病的預(yù)防或改善。本發(fā)明的食品組合物以與上述醫(yī)藥組合物相同的方式被制劑化，來用于功能性食品或可添加于各種食品。優(yōu)選地，可添加本發(fā)明的組合物的食品為飲料、維生素復(fù)合劑、健康輔助食品等。例如，在本發(fā)明的食品組合物制備成如清涼劑等飲料類的情況下，除枳實種子提取物之外，還可包含檸檬酸、液態(tài)果糖、蔗糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁及各種植物提取物等。

本發(fā)明提供包含用于因上述流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒引起的疾病的預(yù)防或改善的食品組合物的健康食品。健康食品是指向飲料、茶等食品原材料添加枳實種子提取物或者制成膠囊、粉末、懸浮液等的食品，在攝取健康食品的情況下，可帶來健康方面的特定效果，與一般藥品不同，將食品作為原材料，從而存在當(dāng)長時間服用藥物時無可發(fā)生的副作用等的優(yōu)點。像這樣，本發(fā)明的健康食品可日常攝取，因此非常有用。在如上所述的健康食品中，枳實種子提取物的添加量根據(jù)作為對象的健康食品的種類不同，由此無法一律規(guī)定添加量，但是，通常，對對象食品添加0.01至50重量百分比，優(yōu)選地，0.1至20重量百分比范圍。并且，在顆粒、片劑或膠囊形態(tài)的食品的情況下，通常添加0.1至100重量百分比，優(yōu)選地，在0.5至80重量百分比范圍下添加。根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的健康食品可以為飲料形態(tài)。

本發(fā)明的食品組合物或健康功能食品可有用地用作在金剛烷乙胺、奧塞米韋、扎那米韋、病毒唑等抗病毒治療劑的給藥前后或同時服用的輔助食品。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，能夠以用于因流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N病毒及流行性感冒B型病毒所引起的疾病的預(yù)防或改善的動物飼料添加用組合物的形態(tài)提供本發(fā)明的組合物。

本發(fā)明的動物飼料添加用組合物對流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒具有抗流行性感冒病毒功效，因此，若將其添加到家畜的飼料，則可期待因上述病毒所引起的疾病的預(yù)防或改善效果。在本說明書中，飼料是指維持家畜的生命，且供給用于生產(chǎn)奶、肉、蛋、毛皮等所需的有機或無機營養(yǎng)素的物質(zhì)。飼料可根據(jù)營養(yǎng)價值、主要成分、流通、水分含量配合狀態(tài)及加工形態(tài)等分為多種，在本發(fā)明中，飼料包括粗飼料、精飼料、補充飼料、蛋白質(zhì)飼料、淀粉飼料、脂肪質(zhì)飼料、纖維質(zhì)飼料，但并不局限于此。

上述飼料添加劑所包含的枳實種子提取物可以為高濃縮液、粉末或顆粒形態(tài)。除枳實種子提取物之外，本發(fā)明的飼料添加用組合物可包含在檸檬酸、富馬酸、己二酸、乳酸、蘋果酸等的有機酸或者磷酸鈉、磷酸鉀、酸性焦磷酸鹽、多磷酸鹽（聚磷酸鹽）等的磷酸鹽或者多酚、兒茶素（catechin）、α-生育酚、迷迭香提取物、維生素C、綠茶提取物、甘草提取物、脫乙酰殼多糖、單寧酸等的天然的抗氧化劑中的一種或一種以上。

本發(fā)明的飼料添加用組合物可包含氨基酸、無機鹽、維生素、抗生物質(zhì)、抗菌物質(zhì)、抗氧化劑、抗真菌酶、其他生菌形態(tài)的微生物制劑等的輔助劑成分；谷物，例如，粉碎或破碎的小麥、燕麥、大麥、玉米及米；植物性蛋白質(zhì)飼料，例如，將油菜、大豆向日葵作為有效成分的物質(zhì)；動物性蛋白質(zhì)飼料，例如，血粉、肉粉、骨粉及海鮮粉；糖粉及乳制品，例如，由各種奶粉及乳漿粉末形成的干燥成分；脂質(zhì)，例如，如借助加熱任意液化的動物性脂肪及植物性脂肪等的主要成分；營養(yǎng)補充劑，如消化及吸收提高劑、成長促進(jìn)劑、疾病預(yù)防劑等的添加劑。

本發(fā)明的飼料添加用組合物可以為干燥或液體狀態(tài)的制劑形態(tài)，上述飼料添加用組合物可包含飼料添加用成型添加劑。例如，飼料添加用成型添加劑可以為沸石、玉米粉或糠，但并不局限于此。

本發(fā)明的飼料添加用組合物還可包含一個以上的酶制劑。例如，如脂肪酶的脂肪分解酶、通過分解植酸（phytic acid）來制備磷酸鹽和磷酸肌醇的植酸酶（phytase）、作為包含于淀粉和糖原等的水解α-1，4-糖苷鍵（α-1,4-glycoside bond）的淀粉酶、作為用于水解有機磷酸酯的酶的磷酸酶（phosphatase）用于分解纖維素的羧甲基纖維素、用于分解木糖的木聚糖酶、用于將麥芽糖水解成兩個分子的葡萄糖的麥芽糖酶及用于使蔗糖水解來制備葡萄糖-果糖混合物的轉(zhuǎn)換酶等。

本發(fā)明的動物飼料添加用組合物可單獨向動物給藥或者可在食用載體中，與其他飼料添加劑一同給藥，并且，上述飼料添加用組合物呈現(xiàn)出抗流行性感冒病毒效果，或者可包含公知為有用于包括流行性感冒的呼吸器官病毒感染疾病的預(yù)防或改善的其他物質(zhì)。并且，上述動物飼料添加用組合物以頂肥或直接向動物飼料混合這些或者與飼料單獨，或者以額外的口服劑型，或者與其他成分的組合來容易進(jìn)行給藥。通常，可使用本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的單人每日攝入量或分割每日攝取量。

例如，可使用本發(fā)明的飼料添加用組合物的動物可包括如食用牛、奶牛、牛犢、豬、豬、豬仔、綿羊、山羊、馬、兔、狗、貓等的家畜，如小雞、蛋雞、家庭用雞、公雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、小鳥等的家禽，但并不局限于此。

包含具有本發(fā)明的枳實種子提取物的飼料添加劑的飼料中能夠以干燥重量為基準(zhǔn)，每1kg飼料添加1g至100g的包含枳實種子提取物的飼料添加劑來取得。飼料混合物完全混合之后，根據(jù)成分的粉碎程度取得輕粘性的粗?；蝾w粒物質(zhì)。通過篩子供給上述物質(zhì)或者為了追加加工及包裝而制成所需要的分離的形狀。此時，優(yōu)選地，為了在儲存過程中的分離而向飼料添加水，接著進(jìn)行通常的顆?；?、膨脹化或壓縮工序。過剩的水可被干燥去除。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明提供包含枳實種子提取物作為有效成分的對于流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒的消毒用組合物。

本發(fā)明的流行性感冒病毒消毒用組合物還可包含根據(jù)制劑，為了流行性感冒病毒的殺傷而可添加的公知的添加物。

本發(fā)明的流行性感冒病毒消毒用組合物可制備成液劑、片劑、顆粒劑、散劑等多種形態(tài)的制劑。

例如，在液相配合的情況下，可向本發(fā)明的消毒用組合物添加的公知添加劑為乙醇或異丙醇。尤其，甲醇或異丙醇自身具有消毒力且對人體無害，尤其，能夠以具有上述藥理作用的天然提取物的均勻分散為目的添加乙醇或異丙醇。上述醇并不局限于此，可包含1.0重量百分比至80.0重量百分的乙醇，優(yōu)選地，包含10.0重量百分比至50.0重量百分比的乙醇。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中，在液相配合的情況下，作為使抗流行性感冒病毒消毒劑溶解及分散的目的，可使用純化水。此時，純化水的含量為確定所添加的成分的含量之后的剩余量。

本發(fā)明的流行性感冒病毒消毒用組合物可制劑化成消毒劑或清洗劑。因此，本發(fā)明提供包含枳實種子提取物作為有效成分的流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒消毒用組合物的清洗劑及消毒劑。例如，本發(fā)明的流行新感冒病毒消毒用組合物可產(chǎn)品化為用于直接向動物相關(guān)設(shè)施及動物噴射的抗呼吸器官病毒消毒劑，動物相關(guān)設(shè)施或需要講衛(wèi)生的接待所等中，可產(chǎn)品化為用于手及器具等的洗滌的抗流行性感冒病毒消毒劑及清洗劑。除本發(fā)明的流行性感冒病毒消毒用組合物之外，上述消毒劑及或清洗劑還可包含消毒劑及清洗劑所需要的公知的成分。

發(fā)明的效果

對本發(fā)明的特征及優(yōu)點進(jìn)行歸納如下：

（i）本發(fā)明提供包含枳實種子提取物作為有效成分的對于流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒的抗流行性感冒病毒組合物。

（ii）作為本發(fā)明組合物的有效成分的枳實種子提取物抑制流行性感冒病毒的復(fù)制及感染，由此呈現(xiàn)出優(yōu)秀的抗病毒功效。

（iii）作為本發(fā)明組合物的有效成分的枳實種子提取物不僅治療流行性感冒A型1N1、H3N2或H5N1病毒及流行性感冒B型病毒的感染，而且還呈現(xiàn)出預(yù)防效果，與達(dá)菲不同，在高濃度下也不呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性，并且還在更低的濃度下呈現(xiàn)出效果。

（iv）本發(fā)明的組合物不僅可以用于因流行性感冒所引起的疾病的治療或預(yù)防用途的藥劑學(xué)組合物，而且還可開發(fā)成因流行性感冒病毒引起的疾病的改善或預(yù)防用途的功能型食品組合物、動物飼料添加用組合物或消毒劑用組合物。

附圖說明

圖1a為示出對于枳實種子提取物的流行性感冒A型H1N1病毒的犬腎細(xì)胞細(xì)胞結(jié)合（attachment）的抑制效果的曲線圖。圖1b為示出在犬腎細(xì)胞按表示的濃度對枳實種子提取物或達(dá)菲進(jìn)行處理之后，被流行性A型H1N1病毒感染的情況下，基于各個濃度的犬腎細(xì)胞的生存率的曲線圖。附加的照片為在上述實驗中對表示的濃度的枳實種子提取物及達(dá)菲進(jìn)行處理的情況下的細(xì)胞照片。

圖2a至圖2d為在分別被流行性感冒A型H1N1（a）、H5N1（b）、H3N2（c）或流行性感冒B型病毒（d）感染的犬腎細(xì)胞按表示濃度對枳實種子提取物或達(dá)菲進(jìn)行處理的情況下，基于各個濃度的犬腎細(xì)胞細(xì)胞的生存率的曲線圖。附加的照片為在上述實驗中，被流行性感冒A型H1N1病毒感染后，對表示的濃度的枳實種子提取物及達(dá)菲進(jìn)行處理的情況下的細(xì)胞照片。

具體實施方式

以下，通過實施例，更加詳細(xì)說明本發(fā)明。這些實施例僅用于更加具體說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。

實施例

實驗材料療及實驗方法

準(zhǔn)備枳實種子提取物

在1L的乙醇中提取粉碎的100g的干燥的枳實種子之后進(jìn)行過濾，上述步驟進(jìn)行2天，對回收的乙醇枳實種子提取物進(jìn)行減壓蒸發(fā)2～3天之后進(jìn)行冷凍干燥，從而獲得提取物。

細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃的溫度下，在5％的CO₂的條件下培養(yǎng)了用于實驗的犬腎細(xì)胞細(xì)胞株。在包含10％胎牛血清（FBS，Hyclone Thermo Scientific）及1％的青霉素-鏈霉素溶液（吉畢科公司（Gibco））的伊格爾最低限度必需培養(yǎng)基（EMEM，Eagle’s minimum essential medium，吉畢科公司）中進(jìn)行培養(yǎng)。

流行性感冒病毒的細(xì)胞結(jié)合調(diào)查方法

在4℃的溫度下，將96孔板接種的犬腎細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)了1小時?；旌狭餍行愿忻癏1N1病毒100TCID₅₀和分別不同濃度的枳實種子提取物或達(dá)菲并使細(xì)胞株感染之后，在4℃的溫度下培養(yǎng)3小時之后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，并再次在37℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。48小時之后，測定了細(xì)胞生存率。直接在顯微鏡下觀察細(xì)胞生存率，利用噻唑藍(lán)（MTT）分析試劑盒（韓國首爾，Dae ill lab servers co.），再次將細(xì)胞生存率定量數(shù)值化。EC₅₀值為在細(xì)胞生存率為50％的區(qū)間的抗病毒劑濃度。

枳實種子提取物的流行性感冒病毒感染預(yù)防效果調(diào)查方法

在96孔板中的每一個孔接種1×10⁴的犬腎細(xì)胞，并在37℃的溫度下培養(yǎng)16小時之后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次之后，將分別不同濃度的枳實種子提取物或達(dá)菲處理在犬腎細(xì)胞細(xì)胞。再次在37℃的溫度下培養(yǎng)6小時之后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并使細(xì)胞感染100TCID₅₀HIN1流行性感冒病毒之后，在37℃的溫度下進(jìn)行了培養(yǎng)。2小時后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次并去除未被感染的病毒之后，放入病毒成長培養(yǎng)基（伊格爾最低限度必需培養(yǎng)基，0.3％的牛血清蛋白，1％P/S，0.0005％的胰蛋白酶（trysin）），在37℃的溫度下培養(yǎng)48小時之后，觀察細(xì)胞的病變效應(yīng)（CPE，cytopathic effect）。

枳實種子提取物的抗病毒活性調(diào)查方法

在96孔板中的每一個孔接種1×10⁴的犬腎細(xì)胞，并在37℃的溫度下培養(yǎng)16小時之后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次之后，在37℃的溫度下，分別利用A型流行性感冒H5N1、H1N1、H3N2病毒或B型流行性感冒病毒100TCID50使細(xì)胞感染2小時后，再次用磷酸鹽緩沖液洗滌2次。在感染流行性感冒病毒的細(xì)胞中，對分別不同濃度的枳實種子提取物或達(dá)菲進(jìn)行處理之后，在37℃的溫度下，培養(yǎng)了48小時。以基于病毒感染的細(xì)胞病變效應(yīng)降低有效濃度50％值（EC₅₀）表示枳實種子提取物的抗病毒功效。枳實種子提取物的細(xì)胞毒性濃度的50％值（CC₅₀）以細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變形為基礎(chǔ)確定。以CC₅₀值除以EC₅₀值的選擇性指數(shù)（SI，selectivity index）表示枳實種子提取物的抗流行性感冒病毒的能力。

實驗結(jié)果

枳實種子提取物的病毒細(xì)胞結(jié)合抑制效果

根據(jù)上述實驗方法，混合流行性感冒H1N1病毒和分別不同濃度的枳實種子提取物或達(dá)菲來使細(xì)胞株感染之后進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果，在達(dá)菲的情況下，所有細(xì)胞被病毒感染，由此不具有抗病毒效果，另一方面，枳實種子提取物表示0.25mg/ml的EC₅₀值，由此呈現(xiàn)出抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合過程的效果（圖1a）。

枳實種子提取物的病毒預(yù)防效果

在根據(jù)上述實驗方法片培養(yǎng)的犬腎細(xì)胞，將分別不同濃度的枳實種子提取物或達(dá)菲處理在犬腎細(xì)胞之后，使細(xì)胞感染HIN1流行性感冒病毒之后，在37℃的溫度下培養(yǎng)48小時并觀察細(xì)胞的病變效應(yīng)。結(jié)果，對達(dá)菲進(jìn)行處理的細(xì)胞均被病毒感染而死，另一方面，在對枳實種子提取物進(jìn)行處理的情況下，EC₅₀值為123.5mg/ml（圖1b）。并且，用顯微鏡觀察細(xì)胞，其結(jié)果，在對達(dá)菲進(jìn)行處理的情況下，呈現(xiàn)出與感染的細(xì)胞相同的狀態(tài)，另一方面，對123.5mg/ml枳實種子提取物進(jìn)行處理的情況下，與正常細(xì)胞（Normal cell）類似，未呈現(xiàn)出被病毒感染的狀態(tài)（圖1b）。

上述結(jié)果表示與達(dá)菲不同，枳實種子提取物抑制病毒感染細(xì)胞的過程，并揭示枳實種子提取物可具有對于流行性感冒的高預(yù)防效果的可能性。

枳實種子提取物的抗病毒活性

根據(jù)上述試驗方法，使犬腎細(xì)胞感染流行性感冒A型病毒H1N1、H3N2或H5N1或B型流行性感冒病毒之后，對各個不同濃度的枳實種子提取物或達(dá)菲進(jìn)行處理并分析了抗病毒活性（post-treatment assay）。枳實種子提取物的抗病毒功效以基于病毒感染的病變效應(yīng)降低有效濃度50％值表示，枳實種子提取物的細(xì)胞毒性濃度的50％值以細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變形為基礎(chǔ)確定。EC₅₀值和CC₅₀值通過Reed和Muench方法計算。以CC₅₀值除以EC₅₀值的選擇性指數(shù)表示枳實種子提取物的抗流行性感冒病毒的能力。表1表示在犬腎細(xì)胞中，比較達(dá)菲和枳實種子提取物的對于流行性感冒A型H1N1、H3N2或H5N1或流行性感冒B型病毒的抗流行性感冒病毒活性的結(jié)果。

表1

如表1所示，在作為陽性對照組使用的達(dá)菲的情況下，分別如下呈現(xiàn)：CC₅₀值為1111.1μg/ml，在H1N1、H3N2中，EC₅₀值為3.5μg/ml，在H5N1中，EC₅₀值為1.5μg/ml，在B型病毒中，EC₅₀值為13.7μg/ml。在枳實種子提取物的情況下，細(xì)胞毒性在3333.3μg/ml中未呈現(xiàn)，EC₅₀值分別如下呈現(xiàn)：在H1N1中，EC₅₀值為0.7μg/ml，在H3N2中，EC₅₀值為1.5μg/ml，在H5N1中，EC₅₀值為0.5μg/ml，在B型病毒中，EC₅₀值為13.7μg/ml。

觀察對于H1N1感染株的結(jié)果，在達(dá)菲的情況下，呈現(xiàn)出50％以上的抗病毒效果的EC₅₀值為3.5μg/ml，在枳實種子提取物的情況下，在0.2μg/ml以上時呈現(xiàn)出50％抗病毒效果（EC₅₀）。并且，用顯微鏡觀察細(xì)胞，其結(jié)果，在達(dá)菲的情況下，被感染而死的細(xì)胞很多，另一方面，在枳實種子提取物的情況下，在對0.07μg/ml的枳實種子提取物進(jìn)行處理的情況下也呈現(xiàn)出抗病毒效果（圖2a）。觀察對于H5N1感染株的結(jié)果，在達(dá)菲的情況下，在1.5μg/ml觀察了EC₅₀，在枳實種子提取物的情況下，在0.5μg/ml呈現(xiàn)出50％抗病毒效果（EC₅₀）（圖2b）。觀察對于H3N2感染株的結(jié)果，在達(dá)菲的情況下，在3.5μg/ml觀察到EC₅₀，在枳實種子提取物的情況下，在1.5μg/ml呈現(xiàn)出50％抗病毒效果（EC₅₀）（圖2c）。觀察對于流行性感冒B型感染株的結(jié)果，達(dá)菲和枳實種子提取物均在13.7μg/ml呈現(xiàn)出50％抗病毒效果（圖2d）。

綜上所述，以上結(jié)果表示枳實種子提取物對A型流行性感冒病毒H1N1、H3N2或H5N1或流行性感冒B型病毒具有與達(dá)菲相同水平的抗病毒活性。這種結(jié)果揭示枳實種子提取物可對流行性感冒具有比較高水平的治療效果的可能性。

以上，詳細(xì)記述了本發(fā)明的特定部分，對本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，這種具體的記述只是優(yōu)選實例，本發(fā)明并不局限于上述實例。因此，本發(fā)明的實際范圍通過以下的發(fā)明要求保護(hù)范圍及其的等同技術(shù)方案定義。