本發(fā)明涉及一種藥物偶聯(lián)體，尤其涉及一種具有細胞內吞介導功能的靶向配體-藥物偶聯(lián)體，屬于生物醫(yī)藥化學領域。
背景技術：
：通常病變細胞的病理及生理特征都與正常細胞有顯著不同，其中之一表現(xiàn)為病變細胞表面具有特異性或過度表達的物質(如：抗原，化學信號，受體等)，這些物質在正常細胞中無表達或低表達?？贵w藥物偶聯(lián)體(ADC)，多肽-藥物偶聯(lián)體(PDC)，就是基于這一原理對疾病進行治療的。目前雖已有一些藥物上市或進入臨床研究，但由于藥物設計原理的原因，ADC和PDC藥物在臨床應用中均具有很大的局限性。ADC目前主要應用于在腫瘤治療領域。其所使用的靶向抗體對腫瘤細胞表面抗原具有極高的親和力10-9～10-12(Kd，mole/Liter),因此其與目標細胞高特異性結合的同時，對含有相同靶點的正常細胞也有較高的結合能力。同時由于ADC在體內的代謝時間較長(1-3周)，因此其在體內留存的時間內會不斷地殺傷正常細胞，極大的增大了藥物的毒副作用。因此其所適用的病癥必須是腫瘤和正常細胞表面抗原數(shù)量懸殊極大的，而目前所知滿足此要求的疾病很少。PDC在臨床或臨床前研究中用于治療多種疾病，例如CN104248770A、及CN102397554B中均有揭示相應的多肽藥物，但這些只是簡單的把化療藥物與多肽連接，或在包埋了化療藥物的納米顆粒或高分子材料里添加多肽，這樣帶來的缺點是，大部分多肽由于分子量較大及帶電荷的性質導致其無法進入細胞，因此目前此類PDC 大多數(shù)只適用于胞外治療，嚴重限制了PDC的應用范圍和藥效。腫瘤細胞和其他病變細胞(如血管內皮細胞、白細胞、腦毛細血管內皮細胞)表面存在著多種特異性或過表達受體，如鐵蛋白受體(TFR)、密度脂蛋白受體、葉酸受體、低、尿酸激酶受體、腫瘤壞死因子受體，ICAM，整合素受體LFA-1等。這些受體的配體可分為蛋白類(鐵蛋白、載脂蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白1即LRP1等)，多肽類(胰島素、SOR-C13、黃體生成素釋放激素LHRH、生長激素抑制素SST-14等)，小分子類(葉酸及類似物，糖類化合物)。這些配體與受體結合具有特異性好、親和力適中和生物效應明顯的特性，與治療性藥物偶聯(lián)形成配體-藥物偶聯(lián)體(LDC)可以明顯提高藥物的靶向性和藥效，同時降低毒性。其中蛋白類配體由于分子量大不易人工合成，且穩(wěn)定性差。而多肽和小分子類配體分子量較小，可化學合成，化學修飾改善特性，在體內代謝較快，同時與受體親和力適中10-6～10-9(mole/liter,Kd)，因此其在特異性地結合病變細胞的同時，對較低水平表達目標受體的正常細胞的殺傷力大大降低。但此類配體-藥物偶聯(lián)體在應用過程中仍存在很多有待解決的問題，如達不到治療窗口所需的較強的親和力，合適的半衰期和快速的細胞內吞。因此它們偶聯(lián)常規(guī)化療藥物(如多柔比星，紫杉醇)時療效低，偶聯(lián)高效藥物分子(如ADC常用的藥物分子MMAE,DM1,等)后毒性大，未達到腫瘤治療有效劑量就導致動物中毒死亡。因此需要通過改造LDC，使其可以作用于病變細胞表面廣泛存在的較高表達受體，拓寬靶向范圍和治療窗口，增強藥效、并避免藥物副作用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于解決上述的技術問題，提供一種具有細胞內吞 介導功能的靶向配體-藥物偶聯(lián)體。本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種具有細胞內吞介導功能的靶向配體-藥物偶聯(lián)體，所述藥物偶聯(lián)體包括藥物分子及與所述藥物分子偶聯(lián)的連接子，其特征在于，所述藥物偶聯(lián)體還包括具有介導作用的分子及與細胞表面受體特異性結合的配體，所述配體為多肽或小分子配體，所述分子與配體可互相偶聯(lián)、并與藥物分子或連接子偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體、或分別單獨與藥物分子和連接子之一偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體。優(yōu)選地，所述具有介導作用的分子為葉酸及其類似物，或穿膜肽。優(yōu)選地，所述葉酸類似物包括5-甲基四氫葉酸，5-甲?；臍淙~酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亞甲基四氫葉酸。優(yōu)選地，所述穿膜肽包括腫瘤歸巢肽、線粒體穿透肽、可活化細胞穿膜肽、抗菌肽。優(yōu)選地，所述多肽的序列為Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，命名為P10。優(yōu)選地，所述多肽的序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名為P11。優(yōu)選地，所述多肽的序列為Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]，命名為P12。優(yōu)選地，所述多肽的序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名為P13。優(yōu)選地，所述連接子為二肽序列的多肽類連接子、二硫鍵連接子或pH依賴型連接子。優(yōu)選地，所述二肽序列為包含有纈氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-賴氨酸、纈氨酸-賴氨酸序列，所述二硫鍵連接子為DMDS、MDS、DSDM、NDMDS，所述pH依賴型連接子為順烏頭酸酐。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P10中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P11中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P12中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P13中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽優(yōu)選地，所述一種具有細胞內吞介導功能的靶向配體-藥物偶聯(lián)體的應用，所述靶向配體-藥物偶聯(lián)體可應用于腫瘤、免疫調節(jié)、心血管疾病的治療。本發(fā)明的有益效果：1)靶向和內吞(穿膜)結構的結合，通過在受體靶向的多肽序列上加了具有內吞介導作用的分子或有穿膜功能的結構使得此藥物均能進入細胞，實現(xiàn)以任何受體靶向的多肽做為制導部分。2)利用雙靶向配體增強藥物偶聯(lián)體對病變細胞的親和性和靶向性，從而可以攜帶高效的毒素藥物如MMAE，拓寬此類藥物的治療窗口避免藥物副作用。3)連接子在細胞外部(胞間質、血液循環(huán)系統(tǒng)等)無法釋放藥物分子，保證了藥物在體內循環(huán)時的穩(wěn)定性，并降低藥物毒性，不會對正常細胞產生毒害作用。進入靶向細胞內部后，連接子裂解釋放出具有治療作用的藥物分子，同時可避免產生多藥耐藥性(MDR)。4)該偶聯(lián)體可以將藥物分子更換為多種化學結構中含有可以發(fā)生?；磻挠坞x氨基，腫瘤、免疫治療、心血管疾病、抗生素等藥物，如美登素類(MMAE，MMAF)、DM1、SiRNA等。此偶聯(lián)體不僅拓寬了LDC類藥物的靶向范圍和治療窗口，而且增強了藥效、避免了毒副作用。附圖說明圖1是偶聯(lián)體在移植腫瘤動物體內濃度變化對比圖。具體實施方式以下結合實施例具體說明本發(fā)明的制備方法：本發(fā)明揭示了一種具有細胞內吞介導功能的靶向配體-藥物偶聯(lián)體，所述藥物偶聯(lián)體包括藥物分子及與所述藥物分子偶聯(lián)的連接子，所述藥物偶聯(lián)體還包括具有內吞介導作用的分子及與細胞表面受體特異性結合的配體，所述配體可以是多肽或小分子配體，但也存在一些有特例的配體同時具有內吞功能和靶向受體結合的功能(如葉酸，P11,P12多肽)。所述內吞介導分子與配體可互相偶聯(lián)后、再與藥物分子或連接子偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體、或分別單獨與藥物分子和連接子之一偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體。其中，所述具有內吞介導作用的分子為葉酸及其類似物，或穿膜肽。所述葉酸類似物包括5-甲基四氫葉酸，5-甲酰基四氫葉酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亞甲基四氫葉酸。采用葉酸和穿膜肽的具體原因是，由于葉酸和穿膜肽根據不同的作用機理均可大幅度改善藥物分子細胞內吞特性。其中葉酸相對分子質量小，易于修飾和穿透腫瘤細胞、免疫原性低，因而具有到達靶點時間短、血液清除速度快、穿透力強、人體免疫反應低等優(yōu)點。同時，大多數(shù)腫瘤細胞表面的葉酸受體數(shù)目和活性明顯高于正常細胞，其受體FR在某些腫瘤細胞表面高度表達，而在正常組織無或很少表達，因而具有良好的腫瘤組織特異性。細胞穿膜肽是一類以非受體依賴方式，非經典內吞方式直接穿過細胞膜進入細胞的多肽。能夠運載多種生物學活性物質進入細胞內，并發(fā)揮相應的生物學活性和治療作用，其轉導效率高且不會造成細胞損傷，這一特性保證了各種大分子藥物細胞內的高效輸送。所述以配體形式存在的多肽序列可以有多種形式，例如，為Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，為 Soricidin蛋白碳端的13個氨基酸SOR-C13，命名為P10(US7119168，US12/886397)。所述P10上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進行替換，至少保留40％同源性?；驗镚lu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黃體生成素釋放激素LHRH(TrendsEndocrinolMetab,2004,15(7):300-310,ArchGynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名為P11。所述P11上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進行替換，至少保留40％同源性。又或者為Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]，即生長激素抑制素SST-14(Science，1973，179(68)：77-79)，命名為P12。所述P12上的氨基酸序列同樣也可以以天然、非天然氨基酸進行替換，至少保留40％同源性。也可以為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黃體生成素釋放激素LHRH類似物(TrendsEndocrinolMetab,2004,15(7):300-310,ArchGynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名為P13。所述P13上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進行替換，在序列同源區(qū)間至少保留40％同源性。所述連接子為二肽序列的多肽類連接子、二硫鍵連接子或pH依賴型連接子。具體的，所述二肽序列為包含有纈氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-賴氨酸、纈氨酸-賴氨酸序列，所述二硫鍵連接子可為DSDM、DMDS、MDS，所述pH依賴型連接子為順烏頭酸酐。以上所述連接子的具體結構式見下表1所示。表1：二硫鍵連接子的結構式：由于本發(fā)明中的連接子需要在細胞內通過特定的條件如低PH裂解，二硫鍵還原，或溶酶體酶解后才能釋放所攜帶藥物，偶連體所攜帶的藥物在沒有釋放下來前是沒有毒性的，使得偶聯(lián)體具有較低的毒性，同時保證了本發(fā)明中藥物的穩(wěn)定性。所述藥物分子為具有治療作用的藥物基團，包括細胞毒素(美登素衍生物MMAE、MMAF、DM1、卡奇霉素、多卡霉素、阿多來新、安曲霉素等)、化療藥物(紫杉醇，多柔比星)、酶抑制劑、酶激動劑、SiRNA或其他生物活性分子。其共同特點是化學結構中含有可以發(fā)生酰化反應的游離氨基，這些游離氨基被其他化學基團修飾后，將顯著降低藥物的細胞毒性，并在去除化學基團后可以恢復。以下闡述本發(fā)明的作用機理：首先，該配體-藥物偶聯(lián)體與靶向細胞的受體結合后，通過具有內吞介導作用的分子的透膜遞送功能，被靶向細胞內吞，進入細胞內部。進入靶向細胞內部后，通過細胞內部環(huán)境的變化(特異性酶切、pH變化、二硫鍵還原等)連接子可以裂解釋放出具有治療作用的藥物分子(相當于去除藥物分子的修飾基團)。而在細胞外部(胞間質)、 血液循環(huán)系統(tǒng)等部位連接子無法釋放藥物分子，則該偶聯(lián)體是一個無細胞毒性或低毒性的藥物，不會對正常細胞產生毒害作用。該偶聯(lián)體可以將藥物分子更換為多種腫瘤、免疫治療、心血管疾病、抗生素等藥物，如美登素類(MMAE，MMAF)、DM1、SiRNA等。以下當內吞介導分子為葉酸或穿膜肽R9，多肽為P10，連接子為MC-Val-Cit-PAB，藥物分子為MMAE時，具體闡述本發(fā)明的合成方法及過程：步驟一、P10保護肽樹脂的合成稱取替代度為1.1mmol/g的WangResin100g于固相反應柱中，加入DMF，氮氣鼓泡溶脹30分鐘；稱取Fmoc-Arg(pbf)-OH142.7g(220mmol)，HOBt35.6g(264mmol)，DMAP2.7g(22mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入40.8mlDIC(264mmol)，活化5分鐘，加入反應柱，反應3小時后，抽干，洗滌3遍。將104ml醋酸酐、88.5ml吡啶溶于500mlDMF中，混合加入以上洗滌后的樹脂，室溫封閉5h，DMF洗滌三次，甲醇收縮后抽干樹脂，得到Fmoc-Arg(pbf)-WangResin，檢測替代度為0.53mmol/g。稱取Fmoc-Arg(pbf)-WangResin(Sub＝0.53mmol/g)75.5克(40mmol)于反應柱中，用DMF清洗3次，再用DMF溶脹30分鐘。然后用DBLK脫除Fmoc保護基團，再用DMF洗滌6次。稱取Fmoc-Pro-OH40.4g(120mmol)，HOBt19.4g(144mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入22.2mlDIC(144mmol)，活化5分鐘，加入反應柱，反應2小時，然后用DBLK脫除Fmoc保護基團。重復上述操作，按照肽序依次偶聯(lián)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH,然后用DBLK脫除Fmoc保護基團，然后用DMF洗滌6次，用甲醇收縮兩次，抽干，獲得P10保護肽樹脂171.6g。步驟二、Folate-NHS的合成將葉酸(44.1g，100mmol)溶解在2升DMSO中，然后用DCC(24.8g,120mmol)和NHS(23g，200mmol)混合，將混合物于常溫下避光攪拌18小時。過濾不溶物，真空抽干，得到膠狀固體。用冰乙醚洗3遍，抽干成黃色粉末，得到53.8g，無需進一步純化，可以做下一步反應。步驟三、中間體Folate-P10(Folate-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH)的合成稱取Folate-NHS32.3g(60mmol)，用DMSO溶解，加入85.8g上述P10保護肽樹脂，反應5分鐘，滴加21ml(120mmol)DIEA，室溫繼續(xù)反應4h。DFM洗3遍，甲醇收縮，真空抽干，得到全保護肽樹脂320.3g。將上一步得到的肽樹脂80g加入到1000ml單口燒瓶中，預先配置裂解液640ml，TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚＝90:5:3：2(體積比)，將裂解液加入到燒瓶中，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用100mlTFA洗滌，合并濾液，加入到4500ml無水乙醚中析出黃色固體，離心，無水乙醚洗滌固體，真空干燥的到黃色固體40.6g，粗肽收率97.1％。HPLC純度76.3％。經HPLC純化制備，凍干得到Folate-P1028.25g，純度為98.6％。步驟四、中間體R9-P10(Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH) 的合成稱取部分第二步驟中得到的P10保護肽樹脂，按照R9的序列依次偶聯(lián)，得到R9-P10中間體。步驟五、中間體(Mc-Val-Cit-PAB-MMAE)的合成稱取MMAE7.18g(10mmol)加入到250ml三口燒瓶中，用無水DMF溶解，N2保護室溫攪拌至澄清。加入Mc-Val-Cit-PAB-PNP7.37g，HOAt72mg(2mmol),反應5分鐘，再滴加3.5ml(20mmol)DIEA，繼續(xù)室溫反應30分鐘，升溫40～50度反應至20h，期間通過HPLC監(jiān)測反應。真空抽干DMF，通過進一步純化得到產品Mc-Val-Cit-PAB-MMAE10.7g，純度為99.3％。步驟六、偶聯(lián)體LDC10B、LDC10H的合成：稱取上一步制備的得到Mc-Val-Cit-PAB-MMAE6.59g(5mmol)加入到5000ml單口燒瓶中，并加入3300ml磷酸緩沖液，攪拌，保持PH＝7.2至澄清，加入中間體10.5g(5.02mmol)Folate-P10或R9-P10，室溫反應2h，期間HPLC監(jiān)測反應。反應完全后，過濾，通過HPLC制備，凍干分別得到14.53gLDC10B,12.37gLDC10H純度99.2％，98.7％，收率分別為85.02％，81.34％。同理，通過以上方法可獲得具有偶聯(lián)體LDC11B，LDC12B，LDC13B，LDC11H，LDC12H。LDC10B，LDC11B，LDC12B，LDC13B，LDC10H，LDC11H，LDC12H的化學結構式分別如下表2所示：表2：偶聯(lián)體化學結構式示意表以下對偶聯(lián)體進行性能的測試，其中涉及的偶聯(lián)體為：LDC1為Folate-(PEG)3-MC-Val-Cit-PAB-MMAELDC10A為P10-MC-Val-Cit-PAB-MMAELDC11A為P11-MC-Val-Cit-PAB-MMAE偶聯(lián)體LDC10B對相關腫瘤細胞毒性實驗樣品：LDC10B對照樣品：MMAE，LDC1，LDC10A主要細胞株：人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實驗方法：1)人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株 GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3,細胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。2)將人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3,以1×103個細胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個小時。3)向鋪好細胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100ul/well，并設對照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時。半小時后，換無藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150ul/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個小時。5)在本酶標儀上490nm對培養(yǎng)板進行讀數(shù)，比較經處理和未處理培養(yǎng)物的細胞存活，測定50％細胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結果與分析：LDC10B對人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3等大多腫瘤細胞都有殺傷作用，且IC50值低于LDC1，LDC10A對照，其結果如表3所示。表3:偶聯(lián)體LDC10B腫瘤細胞毒性(IC50值)對照表單位(摩爾/升，M)細胞名稱H1299K562H460SKOV3HCC1954N87SK-BR-3293AMMAE0.86×10-90.54×10-90.77×10-90.62×10-90.45×10-90.68×10-90.52×10-91.15×10-9LDC12.62×10-79.31×10-81.92×10-71.02×10-79.44×10-82.39×10-79.82×10-85.10×10-7LDC10A5.09×10-71.11×10-74.83×10-71.25×10-71.06×10-75.17×10-71.09×10-79.28×10-7LDC10B5.88×10-81.48×10-85.04×10-81.57×10-81.41×10-87.51×10-81.59×10-84.33×10-7LDC11B偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性實驗樣品：LDC11B對照樣品：MMAE，LDC1，LDC11A主要細胞株：人子宮頸鱗癌細胞SIHA，人子宮內膜癌細胞HEC-1A，人肝癌細胞hepG2，人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人乳腺癌細胞SK-BR-3。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實驗方法：1)人子宮頸鱗癌細胞SIHA，人子宮內膜癌細胞HEC-1A，人肝癌細胞hepG2，人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人乳腺癌細胞SK-BR-3,細胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。2)將人子宮頸鱗癌細胞SIHA，人子宮內膜癌細胞HEC-1A，人肝癌細胞hepG2，人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳 腺癌細胞株HCC1954，人乳腺癌細胞SK-BR-3,以1×103個細胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個小時。3)向鋪好細胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100ul/well，并設對照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時。半小時后，換無藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150ul/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個小時。5)然后在本酶標儀上490nm對培養(yǎng)板進行讀數(shù)，比較經處理和未處理培養(yǎng)物的細胞存活，測定50％細胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結果與分析：LDC11B對人子宮頸鱗癌細胞SIHA，人子宮內膜癌細胞HEC-1A，人肝癌細胞hepG2，人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人乳腺癌細胞SK-BR-3等大多腫瘤細胞都有殺傷作用，且IC50值低于LDC1，LDC11A對照，具體結果如表4所示。表4：LDC11B偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性(IC50值)對照表單位(摩爾/升，M)細胞名稱H460SKOV3293AMMAE0.58×10-90.44×10-90.86×10-9LDC15.26×10-72.95×10-77.15×10-7LDC11A6.67×10-73.41×10-71.31×10-6LDC11B8.13×10-84.38×10-85.24×10-7LDC12B偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性實驗樣品：LDC12B對照樣品：MMAE主要細胞株：人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，人胃癌細胞N87。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實驗方法：1)人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，人胃癌細胞N87，細胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。2)將人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，人胃癌細胞N87，以1×103個細胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個小時。3)向鋪好細胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100ul/well，并設對照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時。半小時后，換無藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150ul/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個小時。5)在本酶標儀上490nm對培養(yǎng)板進行讀數(shù)，比較經處理和未處理培養(yǎng)物的細胞存活，測定50％細胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結果與分析：LDC12B對人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，人胃癌細胞N87等腫瘤細胞都有殺傷作用，具體結果如表5所示。表5：LDC12B偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性(IC50值)對照表單位(摩爾/升，M)細胞名稱HCT-116GTL-16HEC-1ASH-SY5YN87MMAE1.27×10-86.38×10-98.74×10-92.4×10-83.83×10-9LDC12B8.26×10-76.12×10-76.31×10-73.96×10-71.2×10-6LDC13B偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性實驗樣品：LDC13B對照樣品：MMAE主要細胞株：人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人前列腺癌細胞PC-3，人胃癌細胞N87。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實驗方法：1)人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人前列腺癌細胞PC-3，人胃癌細胞N87，細胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。2)將人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人前列腺癌細胞PC-3，人胃癌細胞N87，以1×103個細胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個小時。3)向鋪好細胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100ul/well，并設對照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時。半小時后，換無藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)， 150ul/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個小時。5)在本酶標儀上490nm對培養(yǎng)板進行讀數(shù)，比較經處理和未處理培養(yǎng)物的細胞存活，測定50％細胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結果與分析：LDC13B對人結腸癌細胞HCT-116，人胃癌細胞株GTL-16，人子宮內膜癌細胞株HEC-1A，人前列腺癌細胞PC-3，人胃癌細胞N87等腫瘤細胞都有殺傷作用，具體結果如表6所示。表6：LDC13B偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性對照表,單位(摩爾/升，M)細胞名稱HCT-116GTL-16HEC-1APC-3N87MMAE1.27×10-86.38×10-98.74×10-91.28×10-83.83×10-9LDC13B1.07×10-67.55×10-79.4×10-71.18×10-63.26×10-7LDC10H偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性實驗樣品：LDC10H對照樣品：MMAE，LDC1，LDC10A主要細胞株：人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid方法：1)人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞 PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3,細胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。2)將人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺癌細胞SK-BR-3,以1×103個細胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個小時。3)向鋪好細胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100ul/well，并設對照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時。半小時后，換無藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150ul/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個小時。5)然后在本酶標儀上490nm對培養(yǎng)板進行讀數(shù)，比較經處理和未處理培養(yǎng)物的細胞存活，測定50％細胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結果與分析：LDC10H對人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞A549，人前列腺癌細胞PC-3，人胚腎細胞293A，人肺癌細胞H1299，慢性粒細胞白血病細胞系K562，人肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3，人胃癌細胞株GTL-16，乳腺癌細胞株HCC1954，人胃癌細胞N87，人乳腺 癌細胞SK-BR-3等大多種瘤細胞都有殺死腫瘤細胞抑制生長，且IC50值低于LDC1，LDC10A對照，具體結果如表7所示。表7：LDC10H偶聯(lián)體對相關腫瘤細胞毒性對照表單位(摩爾/升，M)細胞名稱HCC1954H1299SKOV3H460293AMMAE0.29×10-90.71×10-90.49×10-90.56×10-91.18×10-9LDC17.79×10-81.86×10-72.01×10-71.37×10-76.33×10-7LDC10A4.18×10-77.88×10-76.41×10-77.24×10-79.62×10-7LDC10H3.6×10-89.04×10-87.38×10-88.53×10-82.13×10-7偶聯(lián)體動物模型藥效研究實驗目的：通過小鼠的腫瘤治療模型，了解偶聯(lián)體的抗腫瘤藥效LDC10系列偶聯(lián)體對移植腫瘤抑制實驗治療藥物：LDC10B，LDC10H動物：裸鼠，6-8周齡，雌性；實驗方法人大細胞肺癌細胞H460，人肺癌細胞A549，卵巢癌細胞SKOV3,乳腺癌細胞株HCC1954，細胞使用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。腫瘤產生，將7×106腫瘤細胞注射到裸鼠背部皮下，待腫瘤長到100左右，開始分組給藥治療。治療過程：小鼠以3只為1組，用5、10mg/kg劑量，7天間隔4次注射，LDC10B，LDC10H及對照MMAE，PBS進行治療。監(jiān)控動物的身體表現(xiàn)、體重和腫瘤尺寸。在實驗過程中記錄實驗動物的死亡數(shù)。結果與討論：LDC10B，LDC10H均能抑制人大細胞肺癌細胞H460，人肺癌細胞A549,卵巢癌細胞SKOV3,乳腺癌細胞株HCC1954，大多腫瘤在5、 10mg/kg劑量連續(xù)3次給藥后萎縮消失，具體結果如表8.1與表8.2所示。表8.1：LDC10B偶聯(lián)體對移植腫瘤抑制的效果對照表表8.2：LDC10H偶聯(lián)體對移植腫瘤抑制的效果對照表LDC11系列偶聯(lián)體對移植腫瘤抑制實驗治療藥物：LDC11A，LDC11B動物：裸鼠，6-8周齡，雌性；實驗方法人大細胞肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3,乳腺癌細胞株HCC1954，人乳腺癌細胞SK-BR-3，細胞使用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。腫瘤產生，將7×106腫瘤細胞注射到裸鼠背部皮下，待腫瘤長到100～200mm3左右，開始分組給藥治療。治療過程：小鼠以3只為1組，用5、10mg/kg劑量，7天間隔4次注射，LDC11A，LDC11B及對照MMAE，PBS進行治療。監(jiān)控動物的身體表現(xiàn)、體重和腫瘤尺寸。在實驗過程中記錄實驗動物的死亡數(shù)。結果與討論：LDC11B在10mg/kg劑量下均能抑制人大細胞肺癌細胞H460，卵巢癌細胞SKOV3,乳腺癌細胞株HCC1954，人乳腺癌細胞SK-BR-3腫瘤的生長，大多腫瘤連續(xù)3次給藥后萎縮消失。LDC11A由于毒性較大第一次注射后即導致動物的死亡。具體結果如表9.1和表9.2所示。表9.1：LDC11A偶聯(lián)體對移植腫瘤抑制的對照數(shù)據表表9.2：LDC11B偶聯(lián)體對移植腫瘤抑制的對照數(shù)據表偶聯(lián)體在移植腫瘤動物體內藥物濃度變化檢測樣品：LDC10B，LDC10H動物：裸鼠，6-8周齡，雌性；實驗方法人卵巢癌細胞SKOV3，乳腺癌細胞株HCC1954，細胞使用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細胞2-3天傳一次。腫瘤產生，將7×106腫瘤細胞注射到裸鼠背部皮下，待腫瘤長到100～200mm3，開始分組給藥。分組給藥：小鼠以3只為1組，用10mg/kg劑量，腹膜注射。采血：給藥前采血設定為0，給藥后20min、2h、4h、24h采血，采血后離心取血清冷凍保存。檢測：采用鼠抗MMAEElisa試劑盒檢測血清中MMAE，LDC10B、LDC10H，及LDC10B、LDC10H代謝物的總含量。結果與討論：在給藥后24小時后，僅能檢測到LDC10B在體內具有極少的藥物含量，而LDC10H藥物含量檢測為零，說明其游離態(tài)藥物在體內清除速度很快。具體結果如表10及圖1所示。表10：偶聯(lián)體在移植腫瘤動物體內藥物濃度變化數(shù)據對照表濃度ug/mlLDC10BLDC10H給藥前0020min10.80.772h5.0350.584h0.530.19624h0.11790當前第1頁1 2 3