本發(fā)明涉及褐藻膠寡糖及其衍生物及其在治療疼痛方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

疼痛(pain)是一種復(fù)雜的生理心理活動，是臨床上最常見的癥狀之一。急性疼痛往往是其他疾病的一個癥狀，而慢性疼痛本身就是一種疾病。目前，全世界約有30％的人患有慢性疼痛，我國至少有1億以上疼痛患者。偏頭痛是臨床上常見的頭痛類型之一。以反復(fù)發(fā)作性的頭痛為特點(diǎn)，發(fā)作間歇期正常。偏頭痛的確切發(fā)病原因尚不清楚，臨床以發(fā)作時的對癥治療和預(yù)防性治療為主，還沒有理想的治療藥物。

褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁的主要組成成分，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸通過1，4-糖苷鍵連接形成的線性陰離子多糖。褐藻膠是一種高分子化合物，分子量較大，一般在幾萬至幾百萬道爾頓之間。褐藻膠來源豐富，并已廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥業(yè)等。褐藻膠具有抗凝血、抗病毒、抗菌、提高免疫力、抗腫瘤和抗炎等多種生物活性。

但由于褐藻膠分子量較大，使其在藥物應(yīng)用方面受到一定的限 制。因此通過各種降解方法制備的褐藻膠寡糖，包括甘露糖醛酸寡糖、古羅糖醛酸寡糖、甘古糖醛酸寡糖及其衍生物，在糖化學(xué)、糖生物學(xué)、糖工程以及糖類藥物等研究領(lǐng)域具有重要的研究價(jià)值?？梢允褂煤芏喾椒ń到夂衷迥z得到褐藻膠寡糖，包括酶解法、化學(xué)降解法和物理降解法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種褐藻膠寡糖及其衍生物在治療疼痛中的用途。本發(fā)明所述褐藻膠寡糖是褐藻膠水解降解產(chǎn)物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述褐藻膠寡糖是分子量在300-4500Da范圍內(nèi)的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽是選自β-D-甘露糖醛酸通過1，4糖苷鍵連接形成的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選地，本發(fā)明還涉及式(I)或式(II)的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明還提供在氧化劑存在下制備的還原端1位為羧基的式(II)的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明提供所述各種褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽用于制備治療疼痛的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及用于治療疼痛的本發(fā)明所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明還涉及一種治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的本發(fā)明 所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽。

本發(fā)明在一個方面涉及下列結(jié)構(gòu)式(I)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，

式(I)中，n表示0-20的一個或多個整數(shù)，例如n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一個或多個整數(shù)。

本發(fā)明中還涉及由下列結(jié)構(gòu)式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，

式(II)中，n表示0-20的一個或多個整數(shù)，例如n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一個或多個整數(shù)。

上述式(I)和(II)中，優(yōu)選n＝0-10，更優(yōu)選n＝2-8，最優(yōu)選n＝4。n＝0-10的褐藻膠寡糖(優(yōu)選n＝2-8，最優(yōu)選n＝4)的生物效果較佳的原因尚不清楚，可能是它們較易被機(jī)體細(xì)胞識別和接受。在一些實(shí)施方式中，n還可以是選自所述0-20范圍內(nèi)的一個或多個整數(shù)。

本發(fā)明所述的例如式(I)和(II)褐藻膠寡糖可以采用專利號為 ZL200580009396.5中的方法制備及進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。在本發(fā)明的一個較佳實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)式(I)所示的褐藻膠寡糖的制備方法是：將含有多聚甘露糖醛酸鈉鹽(它是褐藻膠的一種成分并在商業(yè)上可獲得，或者例如參照中國專利ZL200580009396.5進(jìn)行制備)的溶液(優(yōu)選水溶液)置于高壓釜中，于pH2-6、溫度100-120℃的條件下反應(yīng)2-6小時。然后從高壓釜中將反應(yīng)后的溶液取出，并中和(例如使用NaOH溶液)該反應(yīng)后的溶液至中性。在攪拌的情況下，將所述中性溶液緩慢加入到乙醇(例如，工業(yè)乙醇、95％乙醇或無水乙醇)中，進(jìn)行醇沉。然后，過濾分離醇沉所得固體物質(zhì)(例如抽濾)，優(yōu)選在過濾時用乙醇(優(yōu)選無水乙醇)洗滌過濾所得固體物質(zhì)。將分離得到的固體物質(zhì)(通常為白色)進(jìn)行干燥，即為式(I)所示褐藻膠寡糖粗品混合物。優(yōu)選地，可將該褐藻膠寡糖粗品混合物進(jìn)一步配成溶液(優(yōu)選水溶液)，然后向該溶液中加入95％乙醇，再次進(jìn)行醇沉。過濾分離再次醇沉所得沉淀物并任選地用無水乙醇洗滌。分離該沉淀物并干燥，得到固體物質(zhì)。將該固體物質(zhì)配成溶液(優(yōu)選水溶液)，用濾膜(例如3μm孔徑的濾膜)過濾該溶液并收集所得濾液。將該濾液在分子排阻色譜(Bio-Gel-P6或Bio-Gel-P10凝膠柱，例如1.6×180cm或其他尺寸)上進(jìn)行洗脫分離，作為流動相的洗脫液可以是NH₄HCO₃等等。使用多個容器從該色譜依次收集洗脫液，并用硫酸-咔唑法檢測各容器洗脫液中的糖含量。硫酸-咔唑法檢測法是使用硫酸-咔唑顯色，用常規(guī)紫外光譜儀檢測，結(jié)果以光密度值(OD值) 表示，不同的光密度值表示糖含量不同。出于方便的目的，可將不同分子量褐藻膠寡糖依次稱為組分1、2、3......等等。根據(jù)該檢測結(jié)果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分(例如組分1、2、3......等等)的洗脫液各自分別濃縮、除鹽、并冷凍干燥，從而得到具有不同分子量的式(I)所示褐藻膠寡糖。所述具有不同分子量褐藻膠寡糖對應(yīng)于式(I)所示褐藻膠寡糖中n具有不同的值。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物是褐藻膠寡糖混合物時，可以通過將含有不同褐藻膠寡糖組分的洗脫液分別干燥后混合、或?qū)⒑胁煌衷迥z寡糖組分的洗脫液合并后干燥，從而得到目標(biāo)混合物。

結(jié)構(gòu)式(II)所示的褐藻膠寡糖的制備方法是：將上述未經(jīng)分子排阻色譜分離的式(I)所示褐藻膠寡糖粗品混合物或者分離后的具有不同n值的式(I)所示褐藻膠寡糖與氧化劑在加熱條件下反應(yīng)，從而得到式(II)所示的褐藻膠寡糖。在一個具體實(shí)施方式中，所述氧化劑是氫氧化銅(例如通過向氫氧化鈉溶液中加入硫酸銅溶液并立即混勻而得到的)。將新鮮氧化劑加入到上述未經(jīng)分子排阻色譜分離的式(I)所示褐藻膠寡糖粗品混合物或者分離后的具有不同n值的式(I)所示褐藻膠寡糖制成的溶液(例如水溶液)中加熱反應(yīng)，直至不再有磚紅色沉淀產(chǎn)生。將該反應(yīng)體系進(jìn)行離心處理以去除沉淀從而得到上清液。出于檢驗(yàn)氧化反應(yīng)是否徹底的目的，可取少許上清液再次加入所述氧化劑，檢查是否還有磚紅色沉淀產(chǎn)生。若還有磚紅色沉淀產(chǎn)生，則將上述離心所得全部上清液與另外部分的所述氧化劑繼 續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，直至檢驗(yàn)時不再有磚紅色沉淀產(chǎn)生為止。將最后得到的反應(yīng)體系離心分離獲得上清液。向所得上清液中加入乙醇(例如，工業(yè)乙醇、95％乙醇或無水乙醇)進(jìn)行醇沉。過濾分離醇沉所得固體物質(zhì)，并用無水乙醇洗滌該固體物質(zhì)。干燥所得固體物質(zhì)。根據(jù)與上述結(jié)構(gòu)式(I)的褐藻膠寡糖的制備方法中相同的分子排阻色譜分離方法進(jìn)行分離。從而得到具有不同分子量的式(II)所示褐藻膠寡糖。所述具有不同分子量的褐藻膠寡糖對應(yīng)于式(II)所示褐藻膠寡糖中n具有不同的值。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物是褐藻膠寡糖混合物時，可以通過將含有不同褐藻膠寡糖組分的洗脫液分別干燥后混合、或?qū)⒑胁煌衷迥z寡糖組分的洗脫液合并后干燥，從而得到目標(biāo)混合物。

本發(fā)明所述式(I)或式(II)褐藻膠寡糖或其藥學(xué)上可接受鹽的衍生物包含一個或多個羥基被無機(jī)酸或有機(jī)酸酯化的酯。能與本發(fā)明式(I)或式(II)褐藻膠寡糖或其藥學(xué)上可接受鹽的一個或多個羥基形成酯的所述有機(jī)酸包括但不限于：甲酸、乙酸、草酸、羥基乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、丁二酸、戊酸、丙烯酸、草酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、甲磺酸、乳酸、水楊酸、乙酰水楊酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、丙酮酸、羥基丁酸、己二酸、鄰苯二甲酸、扁桃酸、苯甲酸、硼酸等。能與本發(fā)明式(I)或式(II)褐藻膠寡糖或其藥學(xué)上可接受鹽的一個或多個羥基形成酯的所述無機(jī)酸包括但不限于：硫酸、亞硫酸、磷酸、偏磷酸、亞磷酸、次磷酸、焦磷酸、多聚磷酸等。

本發(fā)明所述式(I)或式(II)寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽包含：無機(jī)鹽，如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈹鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、鋅鹽、硒鹽、釩鹽、錫鹽、硅鹽、鍶鹽，或與賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸形成的堿性加成鹽，其中優(yōu)選鈉鹽。所述藥用鹽可用常規(guī)方法制得。

本發(fā)明所述用于治療疼痛的藥物包含所述式(I)或式(II)褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，以及一種或多種藥學(xué)上可接受載體。本發(fā)明所述藥物可以是片劑、硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊、微囊劑、顆粒劑、糖漿劑、注射劑、顆粒劑、乳劑、懸浮液、溶液和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑的形式。

本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受載體是指本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥學(xué)上可接受的載體，本發(fā)明的藥學(xué)上可接受載體包括但不限于：填充劑、潤濕劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、助流劑、掩味劑、表面活性劑、防腐劑等。填充劑包括但不限于乳糖、微晶纖維素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸鈣等。潤濕劑與黏合劑包括但不限于羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解劑包括但不限于羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素等。潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、氫化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸鎂等。粘合劑包括但不限于阿拉伯膠、藻酸、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖結(jié)合劑、糊精、右旋糖、乙基纖維素、明膠、 液體葡萄糖、瓜爾膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、硅酸鋁鎂、麥芽糖糊精、甲基纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、預(yù)明膠化淀粉、藻酸鈉、山梨醇、淀粉、糖漿和黃蓍膠。助流劑包括但不限于膠體二氧化硅、粉狀纖維素、三硅酸鎂、二氧化硅和滑石粉。掩味劑包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖漿、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麥芽糖醇、甘草甜素。表面活性劑包括但不限于吐溫-80、泊洛沙姆。防腐劑包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等。

制備各種含有各種比例活性成分的藥物組合物的方法是已知的，或根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，Martin，E.W.，ed.，Mack Publishing Company，19th ed.(1995)所述。制備所述藥物組合物的方法包括摻入適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)賦形劑、載體、稀釋劑等。

以已知的方法制造本發(fā)明的藥物制劑，包括常規(guī)的混合、溶解或凍干方法。

本發(fā)明的藥物以適于選定的施用方式的各種途徑施用，例如口服或腸胃外(通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下途徑)。

因此，本發(fā)明藥物以適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可以接受的載體(如惰性稀釋劑或可食用的載體)可以全身施用，例如，口服。它們可以封閉在硬或軟殼的明膠膠囊中，可以壓為片劑。對于口服治療施用，活性化合物可以結(jié)合一種或多種賦形劑，并以可吞咽的片劑、頰含片劑、含片、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿、圓片等的形式使用。這種制劑應(yīng)該包 含至少0.1％的活性化合物。這種制劑中活性化合物的比例當(dāng)然可以變化，可以占給定的單位劑型重量的大約0.01％至大約99％。在這種治療有用的藥物制劑中，活性化合物的量使得能夠獲得有效劑量水平。

片劑、含片、丸劑、膠囊劑等也可以包含：粘合劑，如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸氫二鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；和甜味劑，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或調(diào)味劑，如薄荷、冬青油或櫻桃香味。當(dāng)單位劑型是膠囊時，除了上面類型的材料，它還可以包含液體載體，如植物油或聚乙二醇。各種其他材料可以存在，作為包衣，或以其他方式改變固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可以用明膠、蠟、蟲膠或糖等包衣。糖漿或酏劑可以包含活性化合物，蔗糖或果糖作為甜味劑，對羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯作為防腐劑，染料和調(diào)味劑(如櫻桃香料或桔子香料)。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料應(yīng)該是藥學(xué)上可以接受的且以應(yīng)用的量為無毒。此外，活性化合物可以摻入緩釋制劑和緩釋裝置中。

活性化合物也可以通過輸注或注射到靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用?？梢灾苽浠钚曰衔锘蚱潲}的水溶液，任選可混和的無毒的表面活性劑。也可以制備在甘油、液體聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散劑。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長。

適于注射或輸注的藥物劑型可以包括包含適于無菌的可注射或可輸注的溶液或分散劑的即時制劑的活性成分(任選封裝在脂質(zhì)體中)的無菌水溶液或分散劑或無菌粉末。在所有情況下，最終的劑型在生產(chǎn)和儲存條件下必須是無菌的、液體的和穩(wěn)定的。液體載體可以是溶劑或液體分散介質(zhì)，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、無毒的甘油酯及其合適的混合物?？梢跃S持合適的流動性，例如，通過脂質(zhì)體的形成，通過在分散劑的情況下維持所需的粒子大小，或通過表面活性劑的使用。可以通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑(如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)產(chǎn)生預(yù)防微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，如糖、緩沖劑或氯化鈉。通過使用延緩吸收劑的組合物(例如，單硬脂酸鋁和明膠)可以產(chǎn)生可注射的組合物的延長吸收。

通過將合適的溶劑中的需要量的活性化合物與需要的上面列舉的各種其他成分結(jié)合，然后進(jìn)行過濾滅菌，制備無菌可注射溶液。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這會產(chǎn)生活性成分加上任何另外需要的無菌過濾溶液中存在的成分的粉末。

有用的固體載體包括粉碎的固體(如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等)。有用的液體載體包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本發(fā)明的組合藥物可以任選在無毒的表面活性劑的幫助下以有效含量溶解或分散在其中?？梢约尤胱魟?如香味) 和另外的抗微生物劑來優(yōu)化對于給定用途的性質(zhì)。

增稠劑(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或改性無機(jī)材料)也可和液體載體用于形成可涂覆的糊劑、凝膠、軟膏、肥皂等，直接用于使用者的皮膚上。

化合物或其活性鹽或衍生物的治療需要量，不僅取決于選擇的特定的鹽，而且取決于施藥方式、待治療的疾病的本質(zhì)和患者的年齡和狀態(tài)，最終取決于在場醫(yī)師或臨床醫(yī)生的決定。

上述制劑可以以單位劑型存在，該單位劑型是含有單位劑量的物理分散單元，適于向人體和其它哺乳動物體給藥。單位劑型可以是膠囊或片劑，或是很多膠囊或片劑。根據(jù)所涉及的具體治療，活性成分的單位劑量的量可以在大約0.01到大約1000毫克或更多之間進(jìn)行變化或調(diào)整。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及用于治療疼痛的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽，所述用于治療疼痛的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽選自β-D-甘露糖醛酸通過1，4糖苷鍵連接形成的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一些優(yōu)選的方面，所述用于治療疼痛的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽選自下列結(jié)構(gòu)式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是選自0-20的一個或多個整數(shù)。所述用于治療疼痛的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽還可以選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，并且n是選自0-10的一個或多個整數(shù)。所述用于治療疼痛的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽還可以選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，并且n是選自2-8的一個或多個整數(shù)。所述用于治療疼痛的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽還可以選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，并且n是4。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及一種治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽。在一些實(shí)施方式，所述治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的 藥學(xué)上可接受鹽選自β-D-甘露糖醛酸通過1，4糖苷鍵連接形成的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一些實(shí)施方式，所述治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽選自下列結(jié)構(gòu)式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是選自0-20的一個或多個整數(shù)。在一些實(shí)施方式，所述治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，并且n是選自0-10的一個或多個整數(shù)。在一些實(shí)施方式，所述治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接 受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，并且n是選自2-8的一個或多個整數(shù)。在一些實(shí)施方式，所述治療疼痛的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽，并且n是4。

本文使用的術(shù)語“治療”一般是指獲得需要的藥理和/或生理效應(yīng)。該效應(yīng)根據(jù)完全或部分地預(yù)防疾病或其癥狀，可以是預(yù)防性的；和/或根據(jù)部分或完全穩(wěn)定或治愈疾病和/或由于疾病產(chǎn)生的副作用，可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋了對患者疾病的任何治療，包括：(a)預(yù)防易感染疾病或癥狀但還沒診斷出患病的患者所發(fā)生的疾病或癥狀；(b)抑制疾病的癥狀，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解疾病的癥狀，即，導(dǎo)致疾病或癥狀退化。

在本發(fā)明全部實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物還包括包含所述一種或多種褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受鹽的混合物。例如，n還可以是選自各自所述數(shù)值范圍內(nèi)的多個整數(shù)。

另一方面，在本發(fā)明的全部實(shí)施方式中，本發(fā)明所述數(shù)值范圍意 在涵蓋所述范圍內(nèi)的任意整數(shù)。例如，在本發(fā)明的全部實(shí)施方式中，式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽中n可以是0-20范圍內(nèi)的任意整數(shù)，比如n可以是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的一個或多個整數(shù)。除非特別指定，本發(fā)明所述的百分含量是指重量百分含量。

在本發(fā)明的全部實(shí)施方式中，本發(fā)明所述疼痛包括但不限于實(shí)施例中所列的疼痛類型，例如急性和慢性疼痛，諸如神經(jīng)病性疼痛和術(shù)后痛、慢性下背痛、叢集性頭痛、皰疹神經(jīng)痛、幻肢痛、中樞性痛、牙痛、阿片樣物質(zhì)抗性疼痛、內(nèi)臟痛、手術(shù)痛、骨損傷痛、勞累和分娩過程中的疼痛、因灼傷包括曬傷導(dǎo)致的疼痛、產(chǎn)后痛、偏頭痛、心絞痛和與泌尿生殖道相關(guān)的疼痛(包括膀胱炎)、血管性疼痛、神經(jīng)性疼痛、偏頭痛、三叉神經(jīng)痛、肋間神經(jīng)痛、手術(shù)切口痛、慢性筋膜炎痛、足跟痛、糖尿病周圍神經(jīng)病變疼痛、幻肢痛、肌肉疼痛、骨骼疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、癌性疼痛、非癌性疼痛等。該術(shù)語還包括感受傷害性疼痛或傷害感受。

下面，本發(fā)明將通過實(shí)施例展示本發(fā)明的有益效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道，這些實(shí)施例是示例性的，而不是限制性的。這些實(shí)施例不會以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1：式(I)所示褐藻膠寡糖柱分離圖。A：P6柱分離圖；B： P10柱分離圖。

圖2：式(II)所示褐藻膠寡糖柱分離圖。A：P6柱分離圖；B：P10柱分離圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一褐藻膠寡糖的制備

稱取1g多聚甘露糖醛酸鈉鹽(重均分子量8235Da，上海綠谷制藥有限公司提供)，加入適量蒸餾水配成1％(重量百分比)的多聚甘露糖醛酸鈉水溶液。用鹽酸將所述1％的多聚甘露糖醛酸鈉水溶液的pH值調(diào)節(jié)為4，然后將該水溶液置于高壓釜中。在110℃溫度下加熱反應(yīng)4小時。從高壓釜中取出該反應(yīng)后的溶液并使其冷卻。冷卻后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)該反應(yīng)后溶液的pH值得到中性液體。在攪拌條件下，將所述中性液體緩慢加入到該液體體積4倍體積量的乙醇中，進(jìn)行醇沉并靜置過夜。過濾分離醇沉所得固體物質(zhì)，并在過濾分離時用無水乙醇洗滌過濾分離所得固體物質(zhì)，最終得到白色濾餅。將該濾餅置于60℃烘箱中干燥，得褐藻膠寡糖粗品。

取上述褐藻膠寡糖粗品1g，配成10％的水溶液，用95％乙醇溶液再次進(jìn)行醇沉。過濾分離再次醇沉所得沉淀物用無水乙醇洗滌該沉淀物。分離該沉淀物并干燥，得到固體物質(zhì)。將該固體物質(zhì)配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔徑膜過濾該水溶液并收集濾液。將該濾液在分子排阻色譜Bio-Gel-P6凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)上進(jìn)行洗脫分離，作為流動相的洗脫液為 0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管從該柱色譜收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各試管中洗脫液的糖含量。根據(jù)該檢測結(jié)果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，棄去組分1，得到分別具有不同分子量的式(I)所示褐藻膠寡糖組分2-12(根據(jù)后續(xù)檢測可知，n分別具有0-10的值)(圖中的Volume表示以試管數(shù)目表示的洗脫液體積)(圖1A)。將Bio-Gel-P6凝膠柱難以分離的組分繼續(xù)用Bio-Gel-P10凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各試管中洗脫液的糖含量。根據(jù)該檢測結(jié)果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，而得到分別具有不同分子量的式(I)所示褐藻膠寡糖組分13-24(根據(jù)后續(xù)檢測可知，n分別具有11-22的值)(圖中的Volume表示以試管數(shù)目表示的洗脫液體積)(圖1B)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是兩種具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻膠寡糖可以在P6柱上得到較好的分離，分子量在3000-6000Dalton的褐藻膠寡糖可以在P10柱上得到較好的分離。經(jīng)與已有對照品比較，紫外光譜分析、紅外光譜分析、¹H-NMR光譜分析、¹³C-NMR光譜分析以及質(zhì)譜分析后可知，在P6柱圖(圖1A)和P10柱圖(圖1B)中，分別得到組分2-24， 其分別為n是0-22的式(I)所示褐藻膠寡糖化合物。根據(jù)譜圖結(jié)果，合并n＝2-8的式(I)所示褐藻膠寡糖洗脫液并干燥，然后得到n＝2-8的式(I)所示褐藻膠寡糖混合物。

實(shí)施例二褐藻膠寡糖氧解產(chǎn)物的制備

取5g上述未經(jīng)分子排阻色譜分離的褐藻膠寡糖粗品配成5％(重量百分比)的水溶液。通過向50ml的10％(重量百分比)氫氧化鈉溶液中加入25ml的5％(重量百分比)的硫酸銅溶液并立即混勻制備得到新鮮氧化劑氫氧化銅。將該新鮮氧化劑氫氧化銅立即加入到40ml上述5％(重量百分比)的褐藻膠寡糖溶液中，同時通過沸水浴進(jìn)行加熱，直至不再有磚紅色沉淀產(chǎn)生。將該反應(yīng)體系進(jìn)行離心處理以去除沉淀從而得到上清液。取少許上清液再次加入所述氧化劑，檢查是否還有磚紅色沉淀產(chǎn)生。若還有磚紅色沉淀產(chǎn)生，則將上述離心所得全部上清液與另外部分的所述氧化劑繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，直至檢驗(yàn)不再有磚紅色沉淀產(chǎn)生為止。將最后得到的反應(yīng)體系離心分離獲得上清液。向上清液中加入4倍體積量的95％乙醇進(jìn)行醇沉，并靜置過夜。過濾分離醇沉所得固體物質(zhì)，并用無水乙醇洗滌該固體物質(zhì)。將所得固體物質(zhì)置于60℃烘箱中烘干，得到式(II)所示褐藻膠寡糖粗品。

取上述褐藻膠寡糖粗品1g，配成10％(重量百分比)的水溶液，用95％乙醇溶液再次進(jìn)行醇沉，過濾分離再次醇沉所得沉淀物并任選地用無水乙醇洗滌。分離該沉淀物并干燥，得到固體物質(zhì)。將該固體物質(zhì)配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔徑膜過濾該水溶 液并收集濾液。將該濾液在分子排阻色譜Bio-Gel-P6凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)上進(jìn)行洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管從該柱色譜收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各集液管中洗脫液的糖含量。根據(jù)該檢測結(jié)果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，棄去組分1，得到分別具有不同分子量的式(II)所示褐藻膠寡糖組分2-12(根據(jù)后續(xù)檢測可知，n分別具有0-10的值)(圖中的Volume表示以試管數(shù)目表示的洗脫液體積)(圖2A)。將Bio-Gel-P6凝膠柱難以分離的組分繼續(xù)用Bio-Gel-P10凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各試管中洗脫液的糖含量。根據(jù)該檢測結(jié)果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，而得到分別具有不同分子量的式(II)所示褐藻膠寡糖組分13-23(根據(jù)后續(xù)檢測可知，n分別具有11-21的值)(圖中的Volume表示以試管數(shù)目表示的洗脫液體積)(圖2B)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是兩種具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻膠寡糖可以在P6柱上得到較好的分離，分子量在3000-6000Dalton的褐藻膠寡糖可以在P10柱上得到較好的分離。經(jīng) 與已有對照品比較，紫外光譜分析、紅外光譜分析、¹H-NMR光譜分析、¹³C-NMR光譜分析以及質(zhì)譜分析后可知，在P6柱圖(圖2A)和P10柱圖(圖2B)中，分別得到組分2-23，其分別為n是0-21的式(II)所示褐藻膠寡糖化合物。根據(jù)譜圖結(jié)果，收集并合并n＝2-8的式(II)所示褐藻膠寡糖洗脫液并干燥，然后得到n＝2-8的式(II)所示褐藻膠寡糖混合物。

實(shí)施例三褐藻膠寡糖衍生物對醋酸致小鼠疼痛的作用

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

按照實(shí)施例二的方法制備得到式(II)褐藻膠寡糖(n＝2-8，即圖中的組分4-10)混合物。該混合物為類白色粉末，易溶于水；醋酸，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；阿司匹林，石家莊歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動物分組與給藥及處理

取小鼠，隨機(jī)分為5組，即空白對照組、陽性藥阿司匹林200mg/kg組、褐藻膠寡糖衍生物25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg組，每組10只動物。從分組當(dāng)天起，空白對照組每天灌胃20ml/kg蒸餾水，其余 各組灌胃給予相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于末次給藥后1小時，各組小鼠均腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml，記錄注射醋酸后20分鐘內(nèi)小鼠的扭體潛伏期(即從注射醋酸至扭體反應(yīng)發(fā)生的時間)和扭體次數(shù)，按下式計(jì)算扭體抑制率和鎮(zhèn)痛百分率(％)。

扭體抑制率(％)＝(空白對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/空白對照組平均扭體次數(shù)×100％

鎮(zhèn)痛百分率(％)＝[(實(shí)驗(yàn)組無扭體動物數(shù)-空白對照組無扭體動物數(shù))/實(shí)驗(yàn)組動物數(shù)]×100％

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)進(jìn)行比較。以p＜0.05為差異有顯著意義，p＜0.01為差異有極顯著意義。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1褐藻膠寡糖衍生物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的作用

醋酸溶液等化學(xué)物質(zhì)注射到小鼠腹腔，可刺激小鼠腹膜，引起間歇發(fā)作的持久性疼痛，表現(xiàn)為腹部收內(nèi)凹、腹前壁緊貼籠底、臀部歪扭和后肢伸張，呈一種特殊姿勢，稱為扭體反應(yīng)。扭體潛伏期(即從注射醋酸至扭體反應(yīng)發(fā)生的時間)和和一定時間內(nèi)的扭體次數(shù)，可以代表疼痛的嚴(yán)重程度。

褐藻膠寡糖衍生物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。褐藻膠寡糖衍生物對小鼠扭體反應(yīng)均有良好的抑制作用，并且 各劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，高劑量組效果最好。與空白對照組比較，扭體次數(shù)、扭體抑制率和鎮(zhèn)痛百分率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明褐藻膠寡糖衍生物具有治療疼痛的作用。

表1.褐藻膠寡糖衍生物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的作用(n＝10，mean±SD)

*p＜0.05 **p＜0.01 vs 空白對照組

分別以式(I)或式(II)中各自n為選自0-20的單個整數(shù)的褐藻膠寡糖或其藥學(xué)上可接受鹽進(jìn)行上述試驗(yàn)，也得到了類似的結(jié)果。

實(shí)施例四 褐藻膠寡糖衍生物對硝酸甘油致大鼠偏頭痛的作用

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥品與試劑

按照實(shí)施例二的方法制備得到式(II)褐藻膠寡糖(n＝2-8，即圖中的組分4-1O)混合物。該混合物為類白色粉末，易溶于水。

1.2實(shí)驗(yàn)動物

SD雄性大鼠，體重180-220g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限 公司提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動物分組與給藥

取SD大鼠，隨機(jī)分成空白對照組、模型組、褐藻膠寡糖衍生物12.5、25、50、100、200mg/kg組，每組8只。于分組當(dāng)天開始給藥，空白對照組和模型組灌胃給予蒸餾水，其余各組給予相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥28天，末次藥后30分鐘，除空白對照組動物予生理鹽水外，其余各組均在右肩皮下注射硝酸甘油10mg/kg造模。觀察大鼠造模后耳紅出現(xiàn)時間和持續(xù)時間，以及造模后30-45分鐘和60-75分鐘兩時間段中的撓頭次數(shù)；采用熒光分光光度法測定腦組織中5-HT的含量。于Ex356nm/Em 483nm波長處測定，結(jié)果以ng/g腦重表示。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)進(jìn)行比較。以p＜0.05為差異有顯著意義，p＜0.01為差異有極顯著意義。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

偏頭痛是血管與神經(jīng)機(jī)制相互作用下的一種血管、神經(jīng)的功能紊亂疾病。硝酸甘油可以通過擴(kuò)張腦膜血管、形成神經(jīng)源性炎癥及激活下丘腦、腦干及脊髓節(jié)段神經(jīng)元功能等作用，引起三叉神經(jīng)纖維的超敏性，造成偏頭痛。硝酸甘油模型是1995年建立的一種動物模型，目 前已成為經(jīng)典的動物偏頭痛模型。根據(jù)硝酸甘油致病機(jī)理，檢測模型動物由于血管擴(kuò)張引起的耳紅時間、由于疼痛引起的撓頭次數(shù)及腦組織致疼敏感因子5-羥色胺(5-HT)含量，可以評估偏頭痛的嚴(yán)重程度。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2-4)，硝酸甘油皮下注射后3分鐘左右，大鼠出現(xiàn)耳紅，耳紅持續(xù)2.5小時左右；且造模后30-45分鐘和60-75分鐘兩時間段中的撓頭次數(shù)顯著多于空白對照組，腦組織5-HT含量顯著低于空白對照組。褐藻膠寡糖衍生物在25-200mg/kg劑量下，可顯著延遲大鼠耳紅出現(xiàn)時間，縮短耳紅持續(xù)時間，減少其在30-45分鐘和60-75分鐘兩時間段中的撓頭次數(shù)，升高腦組織中5-HT的含量。表明褐藻膠寡糖衍生物可明顯抑制大鼠偏頭痛，也表明褐藻膠寡糖衍生物具有治療疼痛的作用。

表2.褐藻膠寡糖衍生物對硝酸甘油致偏頭痛大鼠耳紅出現(xiàn)時間和持續(xù)時間的作用(n＝8，mean±SD)

##p＜0.01 vs 空白對照組；*p＜0.05，**p＜0.01 vs 模型組

表3.褐藻膠寡糖衍生物對硝酸甘油致偏頭痛大鼠撓頭次數(shù)的作用(n＝8，mean±SD)

##p＜0.01 vs 空白對照組；*p＜0.05，**p＜0.01 vs 模型 組

表4.褐藻膠寡糖衍生物對硝酸甘油致偏頭痛大鼠腦組織5-HT含量的作用(n＝8，mean±SD)

##p＜0.01 vs 至白對照組；**p＜0.01 vs 模型組

分別以式(I)或式(II)中各自n為選自0-20的單個整數(shù)的褐藻膠寡糖或其藥學(xué)上可接受鹽進(jìn)行上述試驗(yàn)，也得到了類似的結(jié)果。

實(shí)施例五褐藻膠寡糖衍生物對電刺激三叉神經(jīng)節(jié)致偏頭痛大鼠的作用

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥品與試劑

按照實(shí)施例二的方法制備得到式(II)褐藻膠寡糖(n＝2-8，即圖中的組分4-10)混合物。該混合物為類白色粉末，易溶于水；；伊文氏藍(lán)，多聚甲醛，蔗糖，甘油，過氧化氫，Triton X-100，DAB均購自SIGMA公司；兔抗鼠c-fos抗體(Ab-5)，美國Oncogene Research Products；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG血清，Alexis，Switzerland；Avidin biotin peroxidase complex，Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA，USA。

1.2實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，5月齡，雄性，體重200～240g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

LZ-6臺鉆車，上海老港新興醫(yī)療器械廠；腦立體定位儀，STOELT ING；MD2000刺激器，南京醫(yī)科大學(xué)。

2試驗(yàn)方法

2.1動物分組與給藥

取雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白對照組，假手術(shù)組，模型組，褐藻膠寡糖衍生物12.5、25、50、100、200mg/kg組，每組10只動物。各組均口服給予相應(yīng)藥物，空白對照組、假手術(shù)組、模型組口服蒸餾水。連續(xù)給藥10天后，除空白對照組外，所有大鼠經(jīng)水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在立體定位儀上，頭頂正中切口，逐層切開皮膚、肌肉，于腦矢狀縫中部開口暴露顱蓋骨。在前囪后移3毫米，旁開3毫米處，用牙科鉆插孔，然后將電極插入三叉神經(jīng)節(jié)(以硬腦膜算起深度為9.5mm)，術(shù)后持續(xù)麻醉。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。調(diào)試好刺激電極，電刺激參數(shù)為周期200ms，幅度10v，波寬5ms，刺激10分鐘。假手術(shù)組動物只插入電極，不給刺激。刺激前7分鐘右股靜脈注射50mg/kg伊文氏藍(lán)，刺激結(jié)束20分鐘內(nèi)灌注固定。

刺激結(jié)束后5分鐘，左心室灌流2分鐘，開顱，取全腦，固定，待做病理切片免疫組化測定c-fos；另確定電極位置，分離電極插入處及另一腦半球?qū)?yīng)位置腦硬膜，去離子水洗滌后平鋪在載玻片上，37度干燥15分鐘，70％甘油固定。共聚焦顯微鏡上以647nm激發(fā)波長，680nm發(fā)射波長檢測刺激側(cè)及對照側(cè)指定區(qū)域的熒光強(qiáng)度，計(jì)算刺激側(cè)/對照側(cè)熒光強(qiáng)度的比值，用以指示血漿蛋白滲出率(Plasma Protein Extravasation，PPE)。全腦連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚10μm，免疫組化熒光標(biāo)記c-fos陽性細(xì)胞。共聚焦顯微鏡下，隨機(jī)選擇5個視野，測定三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)實(shí)驗(yàn)側(cè)及對照側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)目，再取5個視野的平均值，則為平均陽性細(xì)胞數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示，采用方差分析(AN0VA)進(jìn)行比較。以p＜0.05為差異有顯著意義，p＜0.01為差異有極顯著意義。

4試驗(yàn)結(jié)果

三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活是偏頭痛患者疼痛產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中腦膜的神經(jīng)性炎癥的發(fā)生在偏頭痛的疼痛產(chǎn)生和維持中起著重要的作用。當(dāng)分布于硬腦膜的三叉神經(jīng)受到刺激時，釋放血管活性物質(zhì)，使腦膜血管擴(kuò)張、血漿成分外滲、肥大細(xì)胞脫顆粒和血小板激活，產(chǎn)生偏頭痛。另外，疼痛刺激后釋放的神經(jīng)遞質(zhì)與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，在第二信使作用下，C-fos mRNA基因表達(dá)，在細(xì)胞核翻譯合成c-fos蛋白，產(chǎn)生對機(jī)體長時程的生理效應(yīng)。故偏頭痛時，三叉神經(jīng)脊束核和中縫大核的C-fos mRNA和c-fos蛋白表達(dá)的細(xì)胞數(shù)增多。因此，通過測定偏頭痛動物硬腦膜血清蛋白滲出量及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)c-fos陽性細(xì)胞數(shù)量可以反映偏頭痛的程度。

研究結(jié)果見表5，電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)明顯導(dǎo)致硬腦膜血清蛋白滲出，褐藻膠寡糖衍生物25、50、100、200mg/kg連續(xù)給藥10天， 可明顯抑制電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)導(dǎo)致的硬腦膜血清蛋白的滲出，其抑制率分別為43.1％、59.7％、79.2％、97.2％；電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)后三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)c-fos表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，褐藻膠寡糖衍生物25、50、100、200mg/kg連續(xù)給藥10天，可明顯抑制c-fos表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)的增加，其抑制率分別為61.1％、64.6％、81.7％、89.3％。結(jié)果顯示褐藻膠寡糖衍生物可明顯抑制電刺激三叉神經(jīng)節(jié)導(dǎo)致的大鼠偏頭痛。這表明褐藻膠寡糖衍生物具有治療偏頭痛的作用，也表明褐藻膠寡糖衍生物具有治療疼痛的作用。

表5.褐藻膠寡糖衍生物對電刺激三叉神經(jīng)節(jié)致偏頭痛大鼠硬腦膜血清蛋白滲出率(PPE率)及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)c-fos陽性細(xì)胞數(shù)的作用(n＝10，mean±SD)

##p＜0.01 vs 空白對照組；*p＜0.05，**p＜0.01 vs 模型組

分別以式(I)或式(II)中各自n為選自0-20的單個整數(shù)的褐藻膠寡糖或其藥學(xué)上可接受鹽進(jìn)行上述試驗(yàn)，也得到了類似的結(jié)果。