本發(fā)明涉及褐藻膠寡糖及其衍生物及其在治療炎癥方面的應用。

背景技術：

炎癥(Inflammation)是指生物組織受到外傷、出血或病原感染、異物等刺激，激發(fā)的生理反應。炎癥反應涉及一些特定自體活性物質，如前列腺素類和白三烯類物質，及特定炎性細胞因子，如白介素類等物質的變化。炎癥的發(fā)生除清除異物、消除感染外。過度的炎癥反應還能夠損傷機體自身物質。目前，常用抗炎藥物除對因使用抗生素外，主要是甾體和非甾體抗炎藥物。

褐藻膠是褐藻細胞壁的主要組成成分，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸通過1,4-糖苷鍵連接形成的線性陰離子多糖。褐藻膠是一種高分子化合物，分子量較大，一般在幾萬至幾百萬道爾頓之間。褐藻膠來源豐富，并已廣泛應用于食品、化工和醫(yī)藥業(yè)等。褐藻膠具有抗凝血、抗病毒、抗菌、提高免疫力、抗腫瘤和抗炎等多種生物活性。

但由于褐藻膠分子量較大，使其在藥物應用方面受到一定的限制。因此通過各種降解方法制備的褐藻膠寡糖，包括甘露糖醛酸寡糖、 古羅糖醛酸寡糖、甘古糖醛酸寡糖及其衍生物，在糖化學、糖生物學、糖工程以及糖類藥物等研究領域具有重要的研究價值?？梢允褂煤芏喾椒ń到夂衷迥z得到褐藻膠寡糖，包括酶解法、化學降解法和物理降解法。

技術實現要素：

本發(fā)明提供一種褐藻膠寡糖及其衍生物在治療炎癥中的用途。本發(fā)明所述褐藻膠寡糖是褐藻膠水解降解產物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述褐藻膠寡糖是分子量在300-4500Da范圍內的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽。本發(fā)明所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽是選自β-D-甘露糖醛酸通過1，4糖苷鍵連接形成的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其藥學上可接受的鹽。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及式(I)或式(II)的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽。本發(fā)明提供在氧化劑存在下制備的還原端1位為羧基的式(II)的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽。本發(fā)明還提供所述各種褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽用于制備治療炎癥的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及用于治療炎癥的本發(fā)明所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽。本發(fā)明還涉及一種治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受 鹽。

本發(fā)明在一個方面涉及下列結構式(I)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，

式(I)中，n表示0-20的一個或多個整數，例如n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一個或多個整數。

本發(fā)明中還涉及由下列結構式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，

式(II)中，n表示0-20的一個或多個整數，例如n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一個或多個整數。

上述式(I)和(II)中，優(yōu)選n＝0-10，更優(yōu)選n＝2-8，最優(yōu)選n＝4。n＝0-10的褐藻膠寡糖(優(yōu)選n＝2-8，最優(yōu)選n＝4)的生物效果較佳的原因尚不清楚，可能是它們較易被機體細胞識別和接受。在一些實施方式中，n還可以是選自所述0-20范圍內的一個或多個整數。

本發(fā)明所述的例如式(I)和(II)褐藻膠寡糖可以采用專利號為ZL200580009396.5中的方法制備及進行結構鑒定。在本發(fā)明的一個較 佳實施方式中，結構式(I)所示的褐藻膠寡糖的制備方法是：將含有多聚甘露糖醛酸鈉鹽(它是褐藻膠的一種成分并在商業(yè)上可獲得，或者例如參照中國專利ZL200580009396.5進行制備)的溶液(優(yōu)選水溶液)置于高壓釜中，于pH2-6、溫度100-120℃的條件下反應2-6小時。然后從高壓釜中將反應后的溶液取出，并中和(例如使用NaOH溶液)該反應后的溶液至中性。在攪拌的情況下，將所述中性溶液緩慢加入到乙醇(例如，工業(yè)乙醇、95％乙醇或無水乙醇)中，進行醇沉。然后，過濾分離醇沉所得固體物質(例如抽濾)，優(yōu)選在過濾時用乙醇(優(yōu)選無水乙醇)洗滌過濾所得固體物質。將分離得到的固體物質(通常為白色)進行干燥，即為式(I)所示褐藻膠寡糖粗品混合物。優(yōu)選地，可將該褐藻膠寡糖粗品混合物進一步配成溶液(優(yōu)選水溶液)，然后向該溶液中加入95％乙醇，再次進行醇沉。過濾分離再次醇沉所得沉淀物并任選地用無水乙醇洗滌。分離該沉淀物并干燥，得到固體物質。將該固體物質配成溶液(優(yōu)選水溶液)，用濾膜(例如3μm孔徑的濾膜)過濾該溶液并收集所得濾液。將該濾液在分子排阻色譜(Bio-Gel-P6或Bio-Gel-P10凝膠柱，例如1.6×180cm或其他尺寸)上進行洗脫分離，作為流動相的洗脫液可以是NH₄HCO₃等等。使用多個容器從該色譜依次收集洗脫液，并用硫酸-咔唑法檢測各容器洗脫液中的糖含量。硫酸-咔唑法檢測法是使用硫酸-咔唑顯色，用常規(guī)紫外光譜儀檢測，結果以光密度值(OD值)表示，不同的光密度值表示糖含量不同。出于方便的目的，可將不同分子量褐藻膠寡糖依次稱為組分1、2、3……等等。根據該檢測結果分別收集含 有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分(例如組分1、2、3……等等)的洗脫液各自分別濃縮、除鹽、并冷凍干燥，從而得到具有不同分子量的式(I)所示褐藻膠寡糖。所述具有不同分子量褐藻膠寡糖對應于式(I)所示褐藻膠寡糖中n具有不同的值。當目標產物是褐藻膠寡糖混合物時，可以通過將含有不同褐藻膠寡糖組分的洗脫液分別干燥后混合、或將含有不同褐藻膠寡糖組分的洗脫液合并后干燥，從而得到目標混合物。

結構式(II)所示的褐藻膠寡糖的制備方法是：將上述未經分子排阻色譜分離的式(I)所示褐藻膠寡糖粗品混合物或者分離后的具有不同n值的式(I)所示褐藻膠寡糖與氧化劑在加熱條件下反應，從而得到式(II)所示的褐藻膠寡糖。在一個具體實施方式中，所述氧化劑是氫氧化銅(例如通過向氫氧化鈉溶液中加入硫酸銅溶液并立即混勻而得到的)。將新鮮氧化劑加入到上述未經分子排阻色譜分離的式(I)所示褐藻膠寡糖粗品混合物或者分離后的具有不同n值的式(I)所示褐藻膠寡糖制成的溶液(例如水溶液)中加熱反應，直至不再有磚紅色沉淀產生。將該反應體系進行離心處理以去除沉淀從而得到上清液。出于檢驗氧化反應是否徹底的目的，可取少許上清液再次加入所述氧化劑，檢查是否還有磚紅色沉淀產生。若還有磚紅色沉淀產生，則將上述離心所得全部上清液與另外部分的所述氧化劑繼續(xù)進行反應，直至檢驗時不再有磚紅色沉淀產生為止。將最后得到的反應體系離心分離獲得上清液。向所得上清液中加入乙醇(例如，工業(yè)乙醇、95％乙醇或無水乙醇)進行醇沉。過濾分離醇沉所得固體物 質，并用無水乙醇洗滌該固體物質。干燥所得固體物質。根據與上述結構式(I)的褐藻膠寡糖的制備方法中相同的分子排阻色譜分離方法進行分離。從而得到具有不同分子量的式(II)所示褐藻膠寡糖。所述具有不同分子量的褐藻膠寡糖對應于式(II)所示褐藻膠寡糖中n具有不同的值。當目標產物是褐藻膠寡糖混合物時，可以通過將含有不同褐藻膠寡糖組分的洗脫液分別干燥后混合、或將含有不同褐藻膠寡糖組分的洗脫液合并后干燥，從而得到目標混合物。

本發(fā)明所述式(I)或式(II)褐藻膠寡糖或其藥學上可接受鹽的衍生物包含一個或多個羥基被無機酸或有機酸酯化的酯。能與本發(fā)明式(I)或式(II)褐藻膠寡糖或其藥學上可接受鹽的一個或多個羥基形成酯的所述有機酸包括但不限于：甲酸、乙酸、草酸、羥基乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、丁二酸、戊酸、丙烯酸、草酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、甲磺酸、乳酸、水楊酸、乙酰水楊酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、丙酮酸、羥基丁酸、己二酸、鄰苯二甲酸、扁桃酸、苯甲酸、硼酸等。能與本發(fā)明式(I)或式(II)褐藻膠寡糖或其藥學上可接受鹽的一個或多個羥基形成酯的所述無機酸包括但不限于：硫酸、亞硫酸、磷酸、偏磷酸、亞磷酸、次磷酸、焦磷酸、多聚磷酸等。

本發(fā)明所述式(I)或式(II)寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽包含：無機鹽，如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈹鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、鋅鹽、硒鹽、釩鹽、錫鹽、硅鹽、鍶鹽，或與賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸形成的堿性加成鹽，其中優(yōu)選鈉鹽。所述藥用鹽可用 常規(guī)方法制得。

本發(fā)明所述用于治療炎癥的藥物包含所述式(I)或式(II)褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，以及一種或多種藥學上可接受載體。本發(fā)明所述藥物可以是片劑、硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊、微囊劑、顆粒劑、糖漿劑、注射劑、顆粒劑、乳劑、懸浮液、溶液和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑的形式。

本發(fā)明所述藥學上可接受載體是指本領域技術人員熟知的藥學上可接受的載體，本發(fā)明的藥學上可接受載體包括但不限于：填充劑、潤濕劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、助流劑、掩味劑、表面活性劑、防腐劑等。填充劑包括但不限于乳糖、微晶纖維素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸鈣等。潤濕劑與黏合劑包括但不限于羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解劑包括但不限于羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素等。潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、氫化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸鎂等。粘合劑包括但不限于阿拉伯膠、藻酸、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖結合劑、糊精、右旋糖、乙基纖維素、明膠、液體葡萄糖、瓜爾膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、硅酸鋁鎂、麥芽糖糊精、甲基纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、預明膠化淀粉、藻酸鈉、山梨醇、淀粉、糖漿和黃蓍膠。助流劑包括但不限于膠體二氧化硅、粉狀纖維素、三硅酸鎂、二氧化硅和滑石粉。掩味劑包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、 糖漿、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麥芽糖醇、甘草甜素。表面活性劑包括但不限于吐溫-80、泊洛沙姆。防腐劑包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等。

制備各種含有各種比例活性成分的藥物組合物的方法是已知的，或根據本發(fā)明的公開內容對于本領域技術人員是顯而易見的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制備所述藥物組合物的方法包括摻入適當的藥學賦形劑、載體、稀釋劑等。

以已知的方法制造本發(fā)明的藥物制劑，包括常規(guī)的混合、溶解或凍干方法。

本發(fā)明的藥物以適于選定的施用方式的各種途徑施用，例如口服或腸胃外(通過靜脈內、肌內、局部或皮下途徑)。

因此，本發(fā)明的藥物以適當的藥學上可以接受的載體(如惰性稀釋劑或可食用的載體)可以全身施用，例如，口服。它們可以封閉在硬或軟殼的明膠膠囊中，可以壓為片劑。對于口服治療施用，活性化合物可以結合一種或多種賦形劑，并以可吞咽的片劑、頰含片劑、含片、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿、圓片等的形式使用。這種制劑應該包含至少0.1％的活性化合物。這種制劑中活性化合物的比例當然可以變化，可以占給定的單位劑型重量的大約0.01％至大約99％。在這種治療有用的藥物制劑中，活性化合物的量使得能夠獲得有效劑量水平。

片劑、含片、丸劑、膠囊劑等也可以包含：粘合劑，如黃蓍膠、 阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸氫二鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；和甜味劑，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或調味劑，如薄荷、冬青油或櫻桃香味。當單位劑型是膠囊時，除了上面類型的材料，它還可以包含液體載體，如植物油或聚乙二醇。各種其他材料可以存在，作為包衣，或以其他方式改變固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可以用明膠、蠟、蟲膠或糖等包衣。糖漿或酏劑可以包含活性化合物，蔗糖或果糖作為甜味劑，對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯作為防腐劑，染料和調味劑(如櫻桃香料或桔子香料)。當然，用于制備任何單位劑型的任何材料應該是藥學上可以接受的且以應用的量為無毒。此外，活性化合物可以摻入緩釋制劑和緩釋裝置中。

活性化合物也可以通過輸注或注射到靜脈內或腹膜內施用?？梢灾苽浠钚曰衔锘蚱潲}的水溶液，任選可混和的無毒的表面活性劑。也可以制備在甘油、液體聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散劑。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長。

適于注射或輸注的藥物劑型可以包括包含適于無菌的可注射或可輸注的溶液或分散劑的即時制劑的活性成分(任選封裝在脂質體中)的無菌水溶液或分散劑或無菌粉末。在所有情況下，最終的劑型在生產和儲存條件下必須是無菌的、液體的和穩(wěn)定的。液體載體可以是溶劑或液體分散介質，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、無毒的甘油酯及其合適的混合 物?？梢跃S持合適的流動性，例如，通過脂質體的形成，通過在分散劑的情況下維持所需的粒子大小，或通過表面活性劑的使用?？梢酝ㄟ^各種抗細菌劑和抗真菌劑(如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)產生預防微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，如糖、緩沖劑或氯化鈉。通過使用延緩吸收劑的組合物(例如，單硬脂酸鋁和明膠)可以產生可注射的組合物的延長吸收。

通過將合適的溶劑中的需要量的活性化合物與需要的上面列舉的各種其他成分結合，然后進行過濾滅菌，制備無菌可注射溶液。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，這會產生活性成分加上任何另外需要的無菌過濾溶液中存在的成分的粉末。

有用的固體載體包括粉碎的固體(如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等)。有用的液體載體包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本發(fā)明的組合藥物可以任選在無毒的表面活性劑的幫助下以有效含量溶解或分散在其中?？梢约尤胱魟?如香味)和另外的抗微生物劑來優(yōu)化對于給定用途的性質。

增稠劑(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或改性無機材料)也可和液體載體用于形成可涂覆的糊劑、凝膠、軟膏、肥皂等，直接用于使用者的皮膚上。

化合物或其活性鹽或衍生物的治療需要量，不僅取決于選擇的特定的鹽，而且取決于施藥方式、待治療的疾病的本質和患者的年齡和狀態(tài)，最終取決于在場醫(yī)師或臨床醫(yī)生的決定。

上述制劑可以以單位劑型存在，該單位劑型是含有單位劑量的物理分散單元，適于向人體和其它哺乳動物體給藥。單位劑型可以是膠囊或片劑，或是很多膠囊或片劑。根據所涉及的具體治療，活性成分的單位劑量的量可以在大約0.01到大約1000毫克或更多之間進行變化或調整。

在一些實施方式中，本發(fā)明還涉及用于治療炎癥的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽，所述用于治療炎癥的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自β-D-甘露糖醛酸通過1，4糖苷鍵連接形成的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其藥學上可接受的鹽。在一些優(yōu)選的方面，所述用于治療炎癥的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自下列結構式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是選自0-20的一個或多個整數。所述用于治療炎癥的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽還可以選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖 及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，并且n是選自0-10的一個或多個整數。所述用于治療炎癥的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽還可以選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，并且n是選自2-8的一個或多個整數。所述用于治療炎癥的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽還可以選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，并且n是4。

在一些實施方式中，本發(fā)明還涉及一種治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽。在一些實施方式，所述治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自β-D-甘露糖醛酸通過1，4糖苷鍵連接形成的甘露糖醛酸寡糖或還原端1位為羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其藥學上可接受的鹽。在一些實施方式，所述治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自下列結構式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是選自0-20的一個或多個整數。在一些實施方式，所述治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，并且n是選自0-10的一個或多個整數。在一些實施方式，所述治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽，并且n是選自2-8的一個或多個整數。在一些實施方式，所述治療炎癥的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的根據本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽，其中所述褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽選自式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接 受的鹽，并且n是4。

本文使用的術語“治療”一般是指獲得需要的藥理和/或生理效應。該效應根據完全或部分地預防疾病或其癥狀，可以是預防性的；和/或根據部分或完全穩(wěn)定或治愈疾病和/或由于疾病產生的副作用，可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋了對患者疾病的任何治療，包括：(a)預防易感染疾病或癥狀但還沒診斷出患病的患者所發(fā)生的疾病或癥狀；(b)抑制疾病的癥狀，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解疾病的癥狀，即，導致疾病或癥狀退化。

在本發(fā)明全部實施方式中，本發(fā)明所述的褐藻膠寡糖及其衍生物還包括包含所述一種或多種褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受鹽的混合物。例如，n還可以是選自各自所述數值范圍內的多個整數。

另一方面，在本發(fā)明的全部實施方式中，本發(fā)明所述數值范圍意在涵蓋所述范圍內的任意整數。例如，在本發(fā)明的全部實施方式中，式(I)或式(II)表示的褐藻膠寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的藥學上可接受的鹽中n可以是0-20范圍內的任意整數，比如n可以是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的一個或多個整數。

本發(fā)明所述炎癥包括各種炎癥，包括但不限于急性炎癥、慢性炎癥、血管炎癥、神經炎癥、中樞神經炎癥、外周神經炎癥、關節(jié)炎(例如骨關節(jié)炎、骶髂關節(jié)炎等、牛皮癬關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎等)、強直性脊柱炎、炎癥性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性 結腸炎)、炎癥性糖尿病性潰瘍、炎癥性皮膚病(例如銀屑病、特應性皮炎、濕疹)等。

除非特別指定，本發(fā)明所述的百分含量是指重量百分含量。

下面，本發(fā)明將通過實施例展示本發(fā)明的有益效果。本領域技術人員會知道，這些實施例是示例性的，而不是限制性的。這些實施例不會以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1：式(I)所示褐藻膠寡糖柱分離圖。A：P6柱分離圖；B：P10柱分離圖。

圖2：式(II)所示褐藻膠寡糖柱分離圖。A：P6柱分離圖；B：P10柱分離圖。

具體實施方式

實施例一 褐藻膠寡糖的制備

稱取1g多聚甘露糖醛酸鈉鹽(重均分子量8235Da，上海綠谷制藥有限公司提供)，加入適量蒸餾水配成1％(重量百分比)的多聚甘露糖醛酸鈉水溶液。用鹽酸將所述1％的多聚甘露糖醛酸鈉水溶液的pH值調節(jié)為4，然后將該水溶液置于高壓釜中。在110℃溫度下加熱反應4小時。從高壓釜中取出該反應后的溶液并使其冷卻。冷卻后，用NaOH溶液調節(jié)該反應后溶液的pH值得到中性液體。在攪拌條件 下，將所述中性液體緩慢加入到該液體體積4倍體積量的乙醇中，進行醇沉并靜置過夜。過濾分離醇沉所得固體物質，并在過濾分離時用無水乙醇洗滌過濾分離所得固體物質，最終得到白色濾餅。將該濾餅置于60℃烘箱中干燥，得褐藻膠寡糖粗品。

取上述褐藻膠寡糖粗品1g，配成10％的水溶液，用95％乙醇溶液再次進行醇沉。過濾分離再次醇沉所得沉淀物用無水乙醇洗滌該沉淀物。分離該沉淀物并干燥，得到固體物質。將該固體物質配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔徑膜過濾該水溶液并收集濾液。將該濾液在分子排阻色譜Bio-Gel-P6凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)上進行洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管從該柱色譜收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各試管中洗脫液的糖含量。根據該檢測結果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，棄去組分1，得到分別具有不同分子量的式(I)所示褐藻膠寡糖組分2-12(根據后續(xù)檢測可知，n分別具有0-10的值)(圖中的Volume表示以試管數目表示的洗脫液體積)(圖lA)。將Bio-Gel-P6凝膠柱難以分離的組分繼續(xù)用Bio-Gel-P10凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各試管中洗脫液的糖含量。根據該檢測結果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自 分別減壓濃縮并冷凍干燥，而得到分別具有不同分子量的式(I)所示褐藻膠寡糖組分13-24(根據后續(xù)檢測可知，n分別具有11-22的值)(圖中的Volume表示以試管數目表示的洗脫液體積)(圖lB)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是兩種具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻膠寡糖可以在P6柱上得到較好的分離，分子量在3000-6000Dalton的褐藻膠寡糖可以在P10柱上得到較好的分離。經與已有對照品比較，紫外光譜分析、紅外光譜分析、¹H-NMR光譜分析、¹³C-NMR光譜分析以及質譜分析后可知，在P6柱圖(圖1A)和P10柱圖(圖1B)中，分別得到組分2-24，其分別為n是0-22的式(I)所示褐藻膠寡糖化合物。根據譜圖結果，合并n＝2-8的式(I)所示褐藻膠寡糖洗脫液并干燥，然后得到n＝2-8的式(I)所示褐藻膠寡糖混合物。

實施例二 褐藻膠寡糖氧解產物的制備

取5g上述未經分子排阻色譜分離的褐藻膠寡糖粗品配成5％(重量百分比)的水溶液。通過向50ml的10％(重量百分比)氫氧化鈉溶液中加入25ml的5％(重量百分比)的硫酸銅溶液并立即混勻制備得到新鮮氧化劑氫氧化銅。將該新鮮氧化劑氫氧化銅立即加入到40ml上述5％(重量百分比)的褐藻膠寡糖溶液中，同時通過沸水浴進行加熱，直至不再有磚紅色沉淀產生。將該反應體系進行離心處理以去除沉淀從而得到上清液。取少許上清液再次加入所述氧化劑，檢查是否還有磚紅色沉淀產生。若還有磚紅色沉淀產生，則將上述離心所得全部上清液與另外部分的所述氧化劑繼續(xù)進行反應，直至檢驗不 再有磚紅色沉淀產生為止。將最后得到的反應體系離心分離獲得上清液。向上清液中加入4倍體積量的95％乙醇進行醇沉，并靜置過夜。過濾分離醇沉所得固體物質，并用無水乙醇洗滌該固體物質。將所得固體物質置于60℃烘箱中烘干，得到式(II)所示褐藻膠寡糖粗品。

取上述褐藻膠寡糖粗品1g，配成10％(重量百分比)的水溶液，用95％乙醇溶液再次進行醇沉，過濾分離再次醇沉所得沉淀物并任選地用無水乙醇洗滌。分離該沉淀物并干燥，得到固體物質。將該固體物質配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔徑膜過濾該水溶液并收集濾液。將該濾液在分子排阻色譜Bio-Gel-P6凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)上進行洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管從該柱色譜收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各集液管中洗脫液的糖含量。根據該檢測結果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，棄去組分1，得到分別具有不同分子量的式(II)所示褐藻膠寡糖組分2-12(根據后續(xù)檢測可知，n分別具有0-10的值)(圖中的Volume表示以試管數目表示的洗脫液體積)(圖2A)。將Bio-Gel-P6凝膠柱難以分離的組分繼續(xù)用Bio-Gel-P10凝膠柱(1.6×180cm，購自Bio-Rad公司)洗脫分離，作為流動相的洗脫液為0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多個5毫升試管收集洗脫液，然后用硫酸-咔唑法檢測所述各試管中洗脫液的糖含量。根據該檢測結果分別收集含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫液。將含有不同分子量褐藻膠寡糖組分的洗脫 液各自分別減壓濃縮并冷凍干燥，而得到分別具有不同分子量的式(II)所示褐藻膠寡糖組分13-23(根據后續(xù)檢測可知，n分別具有11-21的值)(圖中的Volume表示以試管數目表示的洗脫液體積)(圖2B)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是兩種具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻膠寡糖可以在P6柱上得到較好的分離，分子量在3000-6000Dalton的褐藻膠寡糖可以在P10柱上得到較好的分離。經與已有對照品比較，紫外光譜分析、紅外光譜分析、¹H-NMR光譜分析、¹³C-NMR光譜分析以及質譜分析后可知，在P6柱圖(圖2A)和P10柱圖(圖2B)中，分別得到組分2-23，其分別為n是0-21的式(II)所示褐藻膠寡糖化合物。根據譜圖結果，收集并合并n＝2-8的式(II)所示褐藻膠寡糖洗脫液并干燥，然后得到n＝2-8的式(II)所示褐藻膠寡糖混合物。

實施例三 褐藻膠寡糖衍生物對二甲苯致小鼠炎癥的作用

1實驗材料

1.1藥品與試劑

按照實施例二的方法制備得到式(II)褐藻膠寡糖(n＝2-8，即圖中的組分4-10)混合物。該混合物為類白色粉末，易溶于水；阿司匹林，石家莊歐意藥業(yè)有限公司生產；二甲苯為國產分析純試劑。

1.2實驗動物

昆明小鼠，雄性，體重21±1.5g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。

1.3實驗儀器

電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

2實驗方法

2.1動物分組與給藥

二甲苯是非特異性致炎因子，可在局部引起以血管通透性增加、白細胞游走為主要變化的急性炎癥。二甲苯在建立動物炎癥模型中作為致炎劑被廣泛使用。使用二甲苯建立的炎癥模型是本領域常用的動物炎癥模型。

取小鼠，隨機分為空白對照組、褐藻膠寡糖衍生物25、50、100mg/kg組、陽性藥阿司匹林200mg/kg組，每組10只。于分組當天起，空白對照組灌胃生理鹽水，其他各組灌胃相應藥物，各組動物每天分別給藥1次，連續(xù)7天。末次給藥30分鐘后,將20微升二甲苯均勻涂抹于各組小鼠右耳廓兩面致炎，以左耳作對照。涂抹致炎劑后0.5小時將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳并以直徑9毫米打孔器分別在左右耳對稱部位打下圓形耳片，電子天平稱重，計算腫脹度和腫脹抑制率，小鼠耳廓腫脹度以每鼠左右耳片重量之差平均值來表示。

腫脹抑制率(％)＝(空白對照組腫脹度-給藥組腫脹度)/空白對照組腫脹度×100％

3統(tǒng)計學處理

對結果進行統(tǒng)計分析，結果以“均值±標準差”(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)進行比較。以p<0.05為差異有顯著意義，p<0.0l為差異有極顯著意義。

4實驗結果

褐藻膠寡糖衍生物對二甲苯致小鼠炎癥的作用

褐藻膠寡糖衍生物對二甲苯誘導小鼠耳廓腫脹的抑制作用以耳廓腫脹度、腫脹抑制率進行評價,結果見表1。由表1可見，褐藻膠寡糖衍生物連續(xù)給藥7天后，可明顯抑制二甲苯導致的小鼠耳廓腫脹(p<0.05和0.01)，表明褐藻膠寡糖衍生物具有明顯的抗炎作用。

表1.褐藻膠寡糖衍生物對二甲苯致炎癥小鼠耳廓腫脹度、腫脹抑制率的作用(n＝10，mean±SD)

*p<0.05 **p<0.01 vs 空白對照組

分別以式(I)或式(II)中各自n為選自0-20的單個整數的褐藻膠寡糖或其藥學上可接受鹽進行上述試驗，也得到了類似的結果。

實施例四 褐藻膠寡糖衍生物對LPS致大鼠中樞神經炎癥的作用

1實驗材料

1.1藥品與試劑

按照實施例二的方法制備得到式(II)褐藻膠寡糖(n＝2-8，即圖 中的組分4-10)混合物。該混合物為類白色粉末，易溶于水；細菌脂多糖(LPS)，購自SIGMA公司；雙氯芬酸鈉，吉林萬通藥業(yè)集團生產；IL-1β及TNF-α檢測試劑盒，由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供；戊巴比妥鈉由上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠提供。

1.2實驗動物

Wistar大鼠，5月齡，雄性，體重200-240g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。

1.3實驗儀器

DDT-2跳臺儀，中國醫(yī)學科學院藥物研究所；FSH-2型組織搗碎勻漿機，金壇市金城國盛實驗儀器廠；NH-2恒溫水浴鍋，金壇榮華儀器制造有限公司；FA2004型電子天平，上海天平儀器廠生產；Multiskan MK2酶標儀及Well wash 4MK2洗板機，芬蘭雷勃公司；XYJ80-2電動離心機，金壇市恒豐儀器廠；GL-88B漩渦混合器，其林貝爾儀器制造公司；HH.B11.600電熱恒溫箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

2實驗方法

2.1動物分組與給藥

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的保守成分，是其主要致病物質。LPS外周或腦內注射導致的炎癥模型是一種經典的中樞神經炎癥動物模型。該模型除導致腦組織IL-1β、TNF-α等炎癥因子明顯升高外，還可以導致動物學習記憶功能障礙。

取大鼠，隨機分為空白對照組、假手術組、LPS模型組、褐藻膠 寡糖衍生物12.5、25、50、100、200mg/kg組、陽性對照雙氯芬酸鈉10mg/kg組，每組10只。分組當天進行動物模型制備，空白對照組不作處理，假手術組側腦室注射生理鹽水，其余各組側腦室注射LPS溶液誘導中樞神經炎癥模型。動物分組后第二天開始灌胃蒸餾水或相應藥物：空白對照組、假手術組和LPS模型組動物灌胃蒸餾水；褐藻膠寡糖衍生物12.5、25、50、100、200mg/kg組、陽性對照雙氯芬酸鈉10mg/kg組給別給予相應劑量的藥物。每天給藥1次，連續(xù)給藥14天后，采用跳臺法觀察大鼠行為學變化。行為學檢測過程中繼續(xù)給予相應藥物。行為學測試結束后，處死大鼠，冰盤上快速剖取腦組織，棄去嗅球小腦和低位腦干，吸取血跡，準確稱量每側皮層腦組織100mg，按組織重量體積比為1:9加預冷的生理鹽水制成10％的組織勻漿，4℃3000rpm，離心10分鐘，取上清液，檢測腦組織IL-1β、TNF-α含量。

3統(tǒng)計學處理

對結果進行統(tǒng)計分析，結果以“均值±標準誤”(mean±SE)表示，采用方差分析(ANOVA)進行比較。以p<0.05為差異有顯著意義，p<0.0l為差異有極顯著意義。

4實驗結果

(1)褐藻膠寡糖衍生物對LPS致中樞神經炎癥大鼠行為學的作用

跳臺實驗是測定動物學習記憶能力的實驗，屬一次性刺激回避反應實驗。其實驗裝置為一長方形反射箱，底部鋪以間距為5mm的銅 柵，可通適當的電流，銅柵上有一個高和直徑均為4.5cm的平臺。實驗時，先將動物放在銅柵上，當銅柵通電時，放在銅柵上的動物受到電擊，其正常反應是躲避電擊跳上平臺，大多動物有可能再次或多次跳下平臺受到電擊，受到電擊時又會迅速跳回平臺。如此訓練5分鐘，并記錄每只動物跳下平臺受到電擊的次數(即為錯誤次數)，以此衡量學習能力。24小時后重新測驗，此次測驗時，首先將動物放在平臺上，記錄第一次跳下平臺的時間(即為潛伏期)和3分鐘內跳下平臺受到電擊的次數(即為錯誤次數)，以此衡量記憶保持能力。

連續(xù)給藥14天結束后，于次日給藥后30分鐘，測試學習能力。學習能力的結果顯示，與空白對照組比較，假手術組大鼠錯誤次數組間無顯著性差異，表明手術對本實驗結果無影響；與空白對照組比較，LPS模型組大鼠錯誤次數明顯增加(p<0.01)，顯示LPS模型組大鼠學習能力顯著下降；與LPS模型組相比，褐藻膠寡糖衍生物組大鼠錯誤次數明顯明顯減少(p<0.05或0.01)，結果表明褐藻膠寡糖衍生物明顯改善中樞神經炎癥大鼠的學習能力。學習能力測試后動物休息1天，再進行記憶保持能力測試，結果顯示LPS模型組潛伏期明顯縮短，錯誤次數增加，說明LPS模型組記憶能力顯著下降。與LPS模型組相比，褐藻膠寡糖衍生物組潛伏期明顯增加，錯誤次數明顯減少(p<0.05或0.01)，結果表明褐藻膠寡糖衍生物明顯改善中樞神經炎癥大鼠的記憶保持能力。上述結果見表2-3。

(2)褐藻膠寡糖衍生物對LPS致中樞神經炎癥大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量的作用

腦組織IL-1β、TNF-α含量的測定結果顯示，假手術組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量與空白對照組無顯著性差異(p>0.05)，表明手術對本實驗結果無影響；LPS模型組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量明顯升高，與空白對照組比較具有統(tǒng)計學差異(p<0.01)；與LPS模型組相比，褐藻膠寡糖衍生物組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量均有不同程度減少，其中25、50、100、200mg/kg組與模型組比較具有統(tǒng)計學差異(p<0.05和0.01)。結果(見表4)表明褐藻膠寡糖衍生物可以抑制炎癥反應，治療中樞神經炎癥。

表2.褐藻膠寡糖衍生物對LPS致中樞神經炎癥大鼠學習成績的作用(跳臺法)(n＝10，mean±SE)

##p<0.01 vs 空白對照組；*p<0.05 **p<0.01 vs LPS模型組

表3.褐藻膠寡糖衍生物對LPS致中樞神經炎癥大鼠記憶成績的作用(跳 臺法)(n＝10，mean±SE)

##p<0.01 vs 空白對照組；*p<0.05 **p<0.01 vs LPS模型組

表4.褐藻膠寡糖衍生物對LPS致中樞神經炎癥大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量的作用(n＝10，mean±SE)

##p<0.01 vs 空白對照組；*p<0.05 **p<0.01 vs LPS模型組

分別以式(I)或式(II)中各自n為選自0-20的單個整數的褐藻膠寡糖或其藥學上可接受鹽進行上述試驗，也得到了類似的結果。