本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種具有止血作用的飛機(jī)草提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
：飛機(jī)草(EupatoriumodoratumLinn，Chromolaenaodorata(L.)R.M.King&H.Robinson)又名香澤蘭，為菊科澤蘭屬多年生草本植物，是我國(guó)外來(lái)入侵種中危害最為嚴(yán)重的植物之一。飛機(jī)草原產(chǎn)于南美洲，進(jìn)入我國(guó)已有70多年的歷史，現(xiàn)已廣泛分布于我國(guó)各個(gè)地方，如海南、云南南部和西南部、廣東、廣西、貴州、臺(tái)灣、香港和澳門(mén)等。在國(guó)外，越南、柬埔寨、泰國(guó)、菲律賓、馬來(lái)西亞、印度、澳大利亞、南非、墨西哥和巴拿馬等地飛機(jī)草也廣泛分布，已成為一種世界性的惡性雜草。人為創(chuàng)傷、意外創(chuàng)傷、手術(shù)操作等都會(huì)造成滲血、出血及內(nèi)傷出血，很多情況下很難控制，輕則增多失血量增加手術(shù)的難度，重則危及生命。任何外科手術(shù)意外創(chuàng)傷、破損都涉及到止血問(wèn)題。因此，迅速而有效的止血是在受到意外傷害或手術(shù)時(shí)生命安全的保證和最基本的前提。目前臨床上的止血藥物有促凝血因子活性藥，如血凝酶、維生素K1、K3、K4等；降低毛細(xì)血管通透性藥，如卡絡(luò)磺鈉、卡巴克絡(luò)等；抗纖維蛋白溶解藥，如氨甲苯酸、氨甲磺酸、6-氨基乙酸等；其他外用止血藥，如明膠海綿、云南白藥等。但上述藥物有的不良反應(yīng)明顯，有的臨床費(fèi)用較高，給患者造成較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有關(guān)飛機(jī)草莖、葉乙醇提取物在制備對(duì)于出血、滲血而起到良好止血效果的藥物中的應(yīng)用目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，利用飛機(jī)草制備止血藥物將達(dá)到提供廉價(jià)藥物和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的雙重效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種具有止血功效的飛機(jī)草提取物的制備方法。取一定質(zhì)量的飛機(jī)草莖葉，加入一定量的乙醇回流提取，收集提取液，離心后上大孔樹(shù)脂，先以水洗脫除去雜質(zhì)，再以一定濃度的乙醇洗脫，并減壓濃縮后真空干燥，得到飛機(jī)草提取物。本發(fā)明飛機(jī)草提取物的制備方法最好是：取一定質(zhì)量的飛機(jī)草莖葉，加入5～20倍量的乙醇回流提取1～3次，收集合并提取液，上大孔樹(shù)脂，水洗脫除去雜質(zhì)，再以一定濃度乙醇洗脫，減壓濃縮后真空干燥，得到飛機(jī)草提取物。制備飛機(jī)草提取物方法中提取用乙醇濃度優(yōu)選50％～95％，最好是用95％的乙醇；乙醇用量?jī)?yōu)選8～15倍量，最好為10倍量；洗脫劑乙醇濃度優(yōu)選用20～90％。按照最佳提取和純化條件，制備飛機(jī)草提取物。按本發(fā)明所述制備工藝制備的飛機(jī)草提取物經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明具有顯著的止血作用和促進(jìn)傷口愈合作用，在體外對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)菌株具有一定的抗菌活性；經(jīng)家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)和豚鼠皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)，表明該提取物對(duì)皮膚無(wú)明顯刺激性與過(guò)敏性。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下：1、兔耳中動(dòng)脈止血實(shí)驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)用家兔，20％烏拉坦1.0g/kg左耳緣靜脈注射麻醉后右耳部脫毛，輕彈幾下。用手術(shù)刀片在耳外側(cè)中央處劃破耳緣動(dòng)脈，但是不能劃穿耳朵，防止血液從耳內(nèi)側(cè)流出，影響觀察指標(biāo)。待血液充滿(mǎn)創(chuàng)面后立即將相應(yīng)受試物撒到傷口至完全覆蓋創(chuàng)面，陰性對(duì)照組傷口不做任何處理，用紗布覆蓋，用100g砝碼進(jìn)行加壓止血。每隔30s觀察傷口的流血情況，用紗布輕輕蘸吸直至血液不再滲出，即紗布上不再沾有血液為止，記錄所需時(shí)間即出血時(shí)間。表1飛機(jī)草提取物對(duì)家兔耳動(dòng)脈止血時(shí)間的影響(n＝6，)組別劑量出血時(shí)間/s陰性對(duì)照組-256.2±50.4云南白藥組0.2g139.5±21.1***飛機(jī)草提取物0.2g182±29.3**飛機(jī)草提取物0.1g178.0±35.5**飛機(jī)草提取物0.05g171.5±32.3**注：與陰性對(duì)照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥云南白藥能顯著縮短家兔耳緣動(dòng)脈的出血時(shí)間，提示其止血作用顯著；受試藥飛機(jī)草提取物0.2g、0.1g、0.05g劑量組出血時(shí)間亦明顯縮短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示其明顯的止血作用。綜上表明，飛機(jī)草提取物各劑量在本實(shí)驗(yàn)條件下，均具有一定的止血作用。2、傷口愈合實(shí)驗(yàn)：SPF級(jí)SD大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為5組，每組9只。經(jīng)水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，5％硫化鈉背部脫毛，用75％酒精棉球消毒后，在大鼠背部脊柱旁2cm處，用利刀造成直徑1.8cm、面積2.54cm2的圓形全層皮膚切除創(chuàng)面，不要傷及脊柱旁和肌肉上的脂肪和筋膜，止血，用生理鹽水清洗傷口，形成機(jī)械損傷動(dòng)物模型。所有大鼠均單籠喂養(yǎng)，自由充分飲水。飛機(jī)草提取物用0.5％CMC-Na配制成濃度分別為1.0g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL的混懸液，給藥組每次局部涂抹給藥0.2ml，將藥物緩慢侵入傷口，給 藥后對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行反復(fù)輕柔，使藥物充分吸收。陽(yáng)性對(duì)照藥(京萬(wàn)紅軟膏)每次給藥0.2g，膠帶固定，每日換藥1次，觀察傷口是否有出血、滲透液、化膿和結(jié)痂等現(xiàn)象。各組術(shù)后分別于第3、6、9天時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)各抽取3只，水合氯醛300mg/kg麻醉后處死動(dòng)物，切取距離創(chuàng)面外側(cè)各0.3cm，以創(chuàng)面為中心的全層皮膚及皮下組織，10％的甲醛溶液固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡觀察并評(píng)分。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。表2飛機(jī)草提取物對(duì)大鼠皮膚傷口愈合評(píng)分的影響(n＝3，)組別劑量術(shù)后第3天術(shù)后第6天術(shù)后第9天溶劑對(duì)照組-17.70±0.5814.30±1.1512.70±1.53京萬(wàn)紅軟膏0.2g15.00±1.00*11.70±0.58*8.00±2.00*飛機(jī)草提取物0.2g16.70±0.5813.70±0.588.33±1.53*飛機(jī)草提取物0.1g17.00±1.0012.70±1.5311.70±1.53飛機(jī)草提取物0.05g17.70±0.5813.00±1.0012.20±1.61注：與陰性對(duì)照組相比較*P＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)大鼠損傷病變表現(xiàn)為上皮全層壞死形成潰瘍，真皮和皮下組織充血、出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。隨時(shí)間推移潰瘍面積逐漸縮小，真皮出現(xiàn)由新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞組成的肉芽組織，此后肉芽組織內(nèi)血管和炎細(xì)胞逐漸減少，膠原纖維沉積增多，潰瘍周?chē)掀そM織再生，向潰瘍中心移行，說(shuō)明該模型復(fù)制成功。(2)藥物應(yīng)用后潰瘍底部和周?chē)M織炎癥(充血、出血，水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn))程度明顯減輕，局部組織開(kāi)始修復(fù)(肉芽組織增生和纖維化)，其中京萬(wàn)紅軟膏效果最好，其次按效果由高到低依次是飛機(jī)草提取物高劑量組、中劑量組。藥物高劑量在給藥9天時(shí)與溶劑對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。綜上，飛機(jī)草提取物高劑量組有減輕大鼠傷口損傷，促進(jìn)愈合的作用，在用藥9天效果尤好，與溶劑對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。3、體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)采用平板二倍稀釋法，測(cè)定飛機(jī)草提取物的最低抑菌濃度(MIC)。按平板二倍稀釋法配制含飛機(jī)草提取物濃度依次為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL的瓊脂培養(yǎng)基平板，含氧氟沙星濃度依次為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL的瓊脂培養(yǎng)基平板。取試驗(yàn)菌株新鮮斜面菌種，接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2ml，35℃培養(yǎng)8小時(shí)，與0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，適當(dāng)稀釋至濃度約108CFU/mL備用。將試驗(yàn)菌懸液按編號(hào)順序加入96孔板相應(yīng)孔內(nèi)，放置于多點(diǎn)接種儀。取制備的各含藥平板按濃度由低至高順序接種。倒置于35℃培 養(yǎng)16小時(shí)，取出觀察結(jié)果，記錄生長(zhǎng)狀況。陽(yáng)性藥物氧氟沙星對(duì)質(zhì)控菌株的MIC結(jié)果符合CLSI(美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì))允許范圍，實(shí)驗(yàn)方法可信。MIC測(cè)定結(jié)果顯示，飛機(jī)草提取物對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌在體外均有一定的抗菌活性，對(duì)14株革蘭陽(yáng)性菌株(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)中有8株的MIC值為20mg/mL，其余均大于20mg/L；對(duì)革蘭陰性細(xì)菌的體外活性略?xún)?yōu)于革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，7株大腸桿菌臨床株中有4株的MIC值為10mg/mL，對(duì)全部7株肺炎克雷伯桿菌的MIC值均小于或等于20mg/mL，樣品7株綠膿桿菌中有4株的MIC值為20mg/mL。詳見(jiàn)表3。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，飛機(jī)草提取物體外對(duì)臨床菌株具有一定的抗菌活性，14株革蘭陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)菌株中，8株的MIC為20mg/mL；21株革蘭陰性實(shí)驗(yàn)細(xì)菌中，6株的MIC值為10mg/mL，11株的MIC值為20mg/mL，略?xún)?yōu)于革蘭陽(yáng)性菌。表3飛機(jī)草提取物MIC測(cè)定結(jié)果4、對(duì)家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)給家兔正常皮膚和破損皮膚連續(xù)涂抹飛機(jī)草提取物粉末7天，每天2次，每次0.2g/0.2mL，用0.5％CMC-Na溶液調(diào)配成糊狀皮膚涂抹，以0.5％CMC-Na溶液作為陰性對(duì)照，以觀 察飛機(jī)草提取物對(duì)家兔皮膚局部的毒性刺激作用(皮膚紅斑按輕重程度不同按0～4分計(jì)分，水腫按輕重程度不同按0～4分計(jì)分)。結(jié)果顯示，正常皮膚的供試品組和溶劑對(duì)照組皮膚未查見(jiàn)與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的明顯的組織病理學(xué)改變，破損皮膚供試品組和破損皮膚溶劑對(duì)照組，兩組病變例數(shù)與病變程度相近，提示可能因皮膚破損后修復(fù)過(guò)程中引起的程度較輕的病理改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)論為飛機(jī)草提取物在該試驗(yàn)條件下，對(duì)家兔給藥局部皮膚無(wú)明顯刺激性。表4飛機(jī)草提取物對(duì)家兔皮膚刺激性肉眼評(píng)分結(jié)果注：反應(yīng)平均分值＝(紅斑形成總分+水腫形成總分)/動(dòng)物數(shù)5、豚鼠皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)給豚鼠背部皮膚重復(fù)接觸飛機(jī)草提取物，每次0.2g/0.2mL，用0.5％CMC-Na溶液調(diào)配成糊狀皮膚涂抹。以2，4-二硝基氟苯作為陽(yáng)性對(duì)照，0.5％CMC-Na溶液作為陰性對(duì)照，觀察供試品組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠皮膚有無(wú)過(guò)敏現(xiàn)象發(fā)生(皮膚紅斑按輕重程度不同按0～4分計(jì)分，水腫按輕重程度不同按0～3分計(jì)分)。結(jié)果顯示，供試品組和陰性對(duì)照組豚鼠皮膚無(wú)過(guò)敏現(xiàn)象發(fā)生，每次重復(fù)給藥后均未見(jiàn)異常反應(yīng)，而陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物則出現(xiàn)典型的皮膚過(guò)敏性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論為飛機(jī)草提取物在該試驗(yàn)條件下，對(duì)豚鼠皮膚未出現(xiàn)明顯的過(guò)敏反應(yīng)。表5豚鼠皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果(n＝10)注：紅斑和水腫反應(yīng)以“分值×動(dòng)物數(shù)”表示具體實(shí)施方式下文將通過(guò)具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明飛機(jī)草提取物的特征、制備進(jìn)一步說(shuō)明，但所述實(shí)例并非用于限制本發(fā)明。本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書(shū)限定。實(shí)施例1：取飛機(jī)草莖葉300g，加入70％乙醇3000mL，加熱回流提取2次，每次1小時(shí)，合并2次濾液，減壓回收乙醇，濃縮液離心后(3000r/min，10min)上D101型大孔樹(shù)脂，先以3000mL水洗脫，除去雜質(zhì)，繼續(xù)以30％乙醇洗脫，收集30％乙醇洗脫液，減壓回收后，60℃以下真空干燥，得飛機(jī)草提取物。實(shí)施例2：取飛機(jī)草莖葉300g，加入90％乙醇3600mL，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮液離心后(3000r/min，10min)上AB-8型大孔樹(shù)脂，先以3000mL水洗脫，除去雜質(zhì)，繼續(xù)以60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇后，60℃以下真空干燥，得飛機(jī)草提取物。實(shí)施例3：取飛機(jī)草莖葉300g，加入50％乙醇4500ml，加熱回流提取2次，每次3小時(shí)，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮液離心后(3000r/min，10min)上HP-20型大孔樹(shù)脂，先以70％乙醇3000mL洗脫，除去雜質(zhì)，繼續(xù)以90％乙醇洗脫，95％乙醇洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后，60℃以下真空干燥，得飛機(jī)草提取物。實(shí)施例4：取飛機(jī)草莖葉300g，加入60％乙醇6000mL，加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并濾液；減壓回收乙醇，濃縮液離心后(3000r/min，10min)上D-101型大孔樹(shù)脂，先以3000mL水洗脫，除去雜質(zhì)，繼續(xù)以70％乙醇洗脫，70％乙醇洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后，60℃以下真空干燥，得飛機(jī)草提取物。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3