本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物及其組合物的制備方法以及它在制備預(yù)防及治療降血糖、減肥、降血脂、治療糖尿病等方面的醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

地梢瓜Cynanchum the-sioides(Furyn)K.Schum， 多年生草本，高約20厘米，以全草及果實(shí)可入藥。性甘，味平，益氣，通乳。用于體虛乳汁不下；外用治瘊子?？裳a(bǔ)肺氣，清熱降火，生津止渴，消炎止痛。

本發(fā)明通過(guò)大規(guī)模、系統(tǒng)地活性篩選，意外地發(fā)現(xiàn)維吾爾藥地梢瓜提取物及其部分化學(xué)組分，具有顯著地α-糖苷酶抑制活性，該活性提取物及其組合物有望應(yīng)用于降血糖、減肥、降血脂、糖尿病等方面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種地梢瓜提取物。

本發(fā)明還提供了以地梢瓜提取物為主要活性成分的組合物。

本發(fā)明同時(shí)提供了地梢瓜提取物及其組合物的制備和在制備α-糖苷酶抑制活性藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

維吾爾藥地梢瓜經(jīng)甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠（SiO₂）柱分離，上樣后的硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫（石油醚-乙酸乙酯，比例見表1），各石油醚-乙酸乙酯比例混合溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外篩選體系測(cè)試其α-糖苷酶抑制活性，意外地發(fā)現(xiàn)先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫得到的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為α-糖苷酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脫部位，沒(méi)有α-糖苷酶抑制活性的作用。優(yōu)選地，先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫得到的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥即得。本發(fā)明的α-糖苷酶抑制活性的提取物，可以通過(guò)以上方法得到富集，從而與其他雜質(zhì)類成分分離開。該地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物從未見文獻(xiàn)報(bào)道，其薄層譜色譜（TLC）分析表征如圖1。TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

1、地梢瓜經(jīng)甲醇超聲提取物的制備

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，得提取物SN0250A，樣品0.4285g，留樣0.0214g，上樣量0.4071g，拌樣硅膠0.5 g，空白硅膠5 g，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)洗脫。

2、石油醚-乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫方法和結(jié)果

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，得提取物SN0250A， 0.4285 g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15 mL。上硅膠柱色譜，拌樣硅膠0.5 g，空白硅膠5 g，玻璃柱內(nèi)徑1.6 cm，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫（條件見表1），柱體積12.5 mL，每個(gè)梯度洗脫100mL，得到，各個(gè)濃度提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑，即得，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脫提取物，TLC分析結(jié)果見圖2，圖3，TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1），石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1），顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

表1

3、抑制α-糖苷酶活性篩選方法和結(jié)果

1) 實(shí)驗(yàn)條件

a、材料：DMSO(二甲基亞砜) (科密歐公司)；KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O(廣東汕頭市西隴化工廠)；α-glucosidase酶(美國(guó)Sigma公司)；PNPG(美國(guó)Sigma公司)

b、實(shí)驗(yàn)儀器：多功能酶標(biāo)儀Bio-Rad Model 680型(Bio-Rad Laboratories Inc.)

2) 實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程

樣品處理：將1 mg待測(cè)樣品溶于20 μL二甲基亞砜(DMSO)作為母液，取1 μL母液加入99 μL緩沖鹽配成500 μg·mL^-1的樣品溶液。

在96孔板中依次加入α-glucosidase酶PBS溶液20 μL使其終濃度為0.07 u/mL，樣品濃度為500 μg·mL^-1的PBS溶液10 μL。冰浴5分鐘，加入底物PBS溶液20 μL使其終濃度為2.5 mmol/l，用濃度為0.1 M、pH 6.84的PBS溶液補(bǔ)足體積為100 μL。加過(guò)樣的96孔板在37 ℃水浴30分鐘。于405 nm處測(cè)定反應(yīng)物的吸光度，并以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品抑制α-glucosidase酶活性比率用加樣品較空白對(duì)照的OD值的比值來(lái)表示。樣品抑制百分率按以下公式計(jì)算:

酶活性抑制率% = [A_空白- (A_樣品- A_背景)] / A_空白× 100

式中A_空白：不加樣品反應(yīng)后的吸收值；

A_樣品：加入樣品反應(yīng)后的吸收值；

A_背景：只加樣品的吸收值。

3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案為：維吾爾藥地梢瓜經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為該提取物，即為該α-糖苷酶抑制活性提取物。該α-糖苷酶抑制活性提取物從未見文獻(xiàn)報(bào)道，其TLC分析表征如圖1。

4、α-糖苷酶抑制活性有效提取物的提取方法研究

1）提取溶劑的種類研究

分別用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等有機(jī)溶劑提取，并測(cè)試提取物的α-糖苷酶抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

表3

研究結(jié)果表明：提取用有機(jī)溶劑可以為甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑。

2）提取溶劑的用量研究

分別用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/體積比）有機(jī)溶劑提取，并測(cè)試提取物的α-糖苷酶抑制活性，結(jié)果如下：

表4

活性提取物的提取所用有機(jī)溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。

3）干燥方法的研究

分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對(duì)得到的抑制α-糖苷酶活性提取物進(jìn)行干燥，以含水量、TLC、活性測(cè)試為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對(duì)α-糖苷酶抑制活性提取物進(jìn)行干燥，其中，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。

表5

因此，地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物的制備方法為：

維吾爾藥地梢瓜經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為該活性提取物。以上條件最優(yōu)為先用石油醚:乙酸乙酯混合溶劑（石油醚:乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫10倍柱體積，繼用石油醚:乙酸乙酯混合溶劑（石油醚:乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫20倍柱體積。

其中，

1) 提取物提取用溶劑可以為甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑，最優(yōu)條件為甲醇和95%乙醇?；钚蕴崛∥锾崛∮糜袡C(jī)溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。

2) 提取物干燥方法可以為真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。

5. 地梢瓜抑制α-糖苷酶活性提取物（先用石油醚:乙酸乙酯=100:1洗脫，再用石油醚:乙酸乙酯=100:2洗脫得到的提取物）的醫(yī)藥用途研究

按優(yōu)化的地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物制備方法制備的活性提取物，經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=18.5 μg/mL。

由于α-糖苷酶抑制劑具有降血糖、減肥、降血脂、糖尿病等方面的醫(yī)藥用途。因此，我們發(fā)現(xiàn)的地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物具有廣泛的醫(yī)藥用途。

6、地梢瓜抑制α-糖苷酶活性提取物的組合物及其制備方法研究

1）固體分散體

處方

地梢瓜提取物 20 g

Vc 1 g

聚乙烯吡咯烷酮 79 g

固體分散100g

制備方法：

稱取地梢瓜提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比分別放入燒杯中，加入適量的無(wú)水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至地梢瓜提取物和載體完全溶解，充分混合均勻后轉(zhuǎn)入旋蒸儀中除去有機(jī)溶劑，干燥，粉碎過(guò)80目篩，即得地梢瓜有效提取物PVP包合物。

2）環(huán)糊精包合物

處方：

地梢瓜提取物 20 g

Vc 1 g

β-環(huán)糊精 79 g

包合物100g

制備方法：

將β-環(huán)糊精與 1-5 倍水研勻,加地梢瓜有效提取物( 水難溶性的應(yīng)先溶于少量有機(jī)溶劑中) 繼續(xù)充分研磨至成糊狀物, 低溫干燥即得環(huán)糊精包合物。

3）分散片處方:

地梢瓜提取物 100

十二烷基硫酸鈉 1

Vc 1

預(yù)膠化淀粉 10

可溶性淀粉 100

交聯(lián)聚維酮 10

微晶纖維素 9

微分硅膠 0.3

滑石粉 1

100片

制備方法：

1. 地梢瓜有效提取物分散體的制備，精密稱取地梢瓜提取物、Vc，加入處方量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70℃的溫度下蒸干，粉碎，過(guò)100目篩；

2. 將第一步中的地梢瓜有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用適量的濃度為70%乙醇做濕潤(rùn)劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過(guò)14目篩，室溫下放置15min 后， 60℃烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片即得。

7、地梢瓜抑制α-糖苷酶活性提取物的檢測(cè)方法研究

我們發(fā)現(xiàn)，可以用薄層色譜的方法，很好地檢測(cè)和標(biāo)示地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物的特征。見圖1

具體條件為：GF₂₅₄硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）（3:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

附圖說(shuō)明：

圖1 地梢瓜α-糖苷酶抑制活性提取物的TLC色譜圖；

圖2 地梢瓜溶劑提取物的TLC色譜圖；

圖3 地梢瓜溶劑提取物的TLC色譜圖。

具體實(shí)施方式:

以下實(shí)施例表示本發(fā)明的實(shí)用性，本發(fā)明不受此限制。

實(shí)施例 1：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，真空干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=85.0 μg/mL。

實(shí)施例 2：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL乙醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=89.0 μg/mL。

實(shí)施例 3：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL石油醚超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，旋蒸干燥法，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=80.0 μg/mL。

實(shí)施例 4：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL丙酮超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，鼓風(fēng)干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=82.0 μg/mL。

實(shí)施例 5：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL氯仿超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，離心干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=79.0 μg/mL。

實(shí)施例 6：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL乙酸乙酯超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=69.0 μg/mL。

實(shí)施例 7：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1：1）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=89.0 μg/mL。

實(shí)施例 8：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1：1）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=58.0 μg/mL。

實(shí)施例 9：

取維吾爾藥地梢瓜20 g，經(jīng)100 mL乙醇-水混合溶劑（乙醇：水=90：10）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（1.6 cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:1，體積比）洗脫，洗脫10倍柱體積，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫，洗脫20倍柱體積，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑（石油醚-乙酸乙酯，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測(cè)試，其α-糖苷酶抑制活性為IC₅₀=71.0 μg/mL。

實(shí)施例 10：固體分散體

稱取地梢瓜提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比分別放入燒杯中，加入適量的無(wú)水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至地梢瓜提取物和載體完全溶解，充分混合均勻后轉(zhuǎn)入旋蒸儀中除去有機(jī)溶劑，干燥，粉碎過(guò)80目篩，即得地梢瓜有效提取物PVP包合物。

實(shí)施例 11：環(huán)糊精包合物

將β-環(huán)糊精與 1-5 倍水研勻,加地梢瓜有效提取物( 水難溶性的應(yīng)先溶于少量有機(jī)溶劑中) 繼續(xù)充分研磨至成糊狀物, 低溫干燥即得環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例12：分散片

1. 地梢瓜有效提取物分散體的制備，精密稱取地梢瓜提取物、Vc，加入處方量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70℃的溫度下蒸干，粉碎，過(guò)100目篩；

2. 將第一步中的地梢瓜有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用適量的濃度為70%乙醇做濕潤(rùn)劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過(guò)14目篩，室溫下放置15min 后，60℃烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片即得。