本發(fā)明涉及一種磁共振成像用的造影劑，具體涉及一種磁共振成像造影用的基于殼聚糖的MRI造影劑及制備方法，屬于醫(yī)學(xué)臨床磁共振成像技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著科技的發(fā)展，磁共振成像已成為臨床檢測固體瘤的一種有效手段。相較于其其它成像技術(shù)，磁共振成像有很多優(yōu)點，如無電離輻射損傷、超高的組織分辨率和三維定位能力。但為了進(jìn)一步提高成像的靈敏度和準(zhǔn)確率，通常需要造影劑來增強成像對比度。目前，臨床用的造影劑一般為小分子的釓螯合物。這類小分子造影劑應(yīng)用于生物體尚存在一些缺點，如血液循環(huán)時間短、弛豫率低、無靶向性，具有一定的毒性，甚至?xí)鹕矬w腎細(xì)胞的纖維化。因此高弛豫率、低毒及具有組織或腫瘤靶向性成為MRI造影劑發(fā)展的焦點。

近年來，將小分子Gd造影劑共價或者非共價的與高分子結(jié)合的研究越來越多。將小分子造影劑與高分子結(jié)合，可以增強體內(nèi)穩(wěn)定性、改變疏水性質(zhì)、降低分子的旋轉(zhuǎn)速率、提高弛豫效率、延長血液循環(huán)時間和在組織中的駐留時間，另外對高分子可進(jìn)行專屬性化學(xué)修飾，增強對組織或器官的靶向性，將配合物修飾為電中性，可以使?jié)B透壓與血漿相近，從而降低毒副作用。但由于大分子在體內(nèi)排泄較慢限制了其在臨床中的應(yīng)用。因此，尋找易降解的大分子作為小分子造影劑的載體尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種具有生物相容性好、易生物降解和高弛豫率等特點的殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑及其制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

在本發(fā)明的一實施案例之中，提供了一種殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑的制備方法， 包括：將二乙烯三胺五乙酸和Gd³⁺偶聯(lián)到炔基修飾的二代聚酰胺胺樹形分子上，形成帶有釓螯合物的二代聚酰胺胺樹形分子，

以及，通過點擊化學(xué)反應(yīng)將帶有釓螯合物的二代聚酰胺胺樹形分子連接至聚乙二醇修飾的殼聚糖主鏈上，獲得所述造影劑。

在一較優(yōu)實施方式中，所述制備方法進(jìn)一步包括：將殼聚糖與端羧基的聚乙二醇在室溫反應(yīng)得到聚乙二醇修飾的殼聚糖，所述殼聚糖的分子量為Mw 40000～50000Da，所述聚乙二醇的投量為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾數(shù)的10～20％。

優(yōu)選的，殼聚糖與端羧基的聚乙二醇在室溫反應(yīng)的時間為8～12h。

在一較優(yōu)實施方式中，所述制備方法進(jìn)一步包括：以濃度為3～6wt％的酸溶液作為反應(yīng)溶劑，將疊氮化合物通過取代反應(yīng)修飾到聚乙二醇修飾的殼聚糖上，反應(yīng)時間為20～26h，獲得修飾有疊氮基團(tuán)和聚乙二醇的殼聚糖。

優(yōu)選的，其中酸溶液為等體積的鹽酸和醋酸的混合液。

優(yōu)選的，疊氮化合物為疊氮酸或疊氮化的環(huán)氧氯丙烷。

一較優(yōu)實施方式中，所述制備方法進(jìn)一步包括：將二乙烯三胺五乙酸的活化酯通過縮合反應(yīng)連接到二代聚酰胺胺樹形分子上，獲得偶聯(lián)有二乙烯三胺五乙酸的樹形分子。

一較優(yōu)實施方式中，所述制備方法進(jìn)一步包括：在pH值為5～7時，將Gd³⁺螯合到二乙烯三胺五乙酸(DTPA)偶聯(lián)的二代聚酰胺胺樹形分子上，獲得偶聯(lián)有二乙烯三胺五乙酸和Gd³⁺的二代聚酰胺胺樹形分子。

在一較優(yōu)實施方式中，所述制備方法進(jìn)一步包括：在存在催化劑的條件下，使修飾有疊氮基團(tuán)和聚乙二醇的殼聚糖與偶聯(lián)有二乙烯三胺五乙酸和Gd³⁺的二代聚酰胺胺樹形分子通過點擊化學(xué)反應(yīng)連接，反應(yīng)時間為20～26h，獲得所述造影劑，所述催化劑至少選自五水硫酸銅和抗壞血酸鈉。

本發(fā)明還提供了一種采前述制備方法得到的殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑。

在一實施方案之中，所述殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑包括：

作為造影劑主體的聚乙二醇修飾的殼聚糖，

主要連接于殼聚糖主鏈上的帶有釓螯合物的二代聚酰胺胺樹形分子。

在一較佳實施方案之中，所述造影劑具有下式所示結(jié)構(gòu)：

其中，n為100～300之間的整數(shù)。

該殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑采用殼聚糖作為造影劑主體，殼聚糖具有生物相容性好，生物毒性低和生物可降解的優(yōu)點，殼聚糖的分子量大小可以不限。將釓螯合物連接在二代聚酰胺胺樹形分子上，然后通過點擊化學(xué)修飾到殼聚糖上，能夠增加造影劑分子的尺寸，增加旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間，從而提高弛豫效率，并延長其血液循環(huán)時間。釓螯合物主要位于二代聚酰胺胺樹形分子接枝的殼聚糖的側(cè)鏈上，從而提高單位分子量的釓裝載率。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，該造影劑弛豫率(9.53mM^-1·s^-1)明顯高于小分子造影劑的弛豫率(4.25mM^-1·s^-1)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括：該殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑的生物相容性好，易生物降解，并具備高弛豫率，且其制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，易于控制。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

圖1a是本發(fā)明實施例1中一種造影劑的制備工藝流程圖；

圖1b是本發(fā)明實施例1中一種造影劑的結(jié)構(gòu)式；

圖2是殼聚糖、CS-PEG、CS-PEG-N₃及本發(fā)明造影劑的紅外光譜圖；

圖3是本發(fā)明造影劑與Gd-DTPA弛豫率對比圖；

圖4是本發(fā)明高分子造影劑與Gd-DTPA的T1加權(quán)成像對比圖；

圖5是本發(fā)明高分子造影劑在A549細(xì)胞中的細(xì)胞毒性側(cè)視圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)實際需要而做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。

實施例1殼聚糖衍生物為載體的MRI造影劑的制備方法，參閱圖1a，其具體步驟如下：在一實施案例中，該造影劑的制備方法可包括如下步驟：

(1)將PEG-COOH溶解配成5％(w/w)的溶液，然后將溶液的PH調(diào)節(jié)到6，然后加入NHS，攪拌5min后加入EDC使EDC：NHS：COO的摩爾比為1:1:0.8。在以上溶液攪拌30min將羧基活化后緩慢滴加到溶解在體積分?jǐn)?shù)為1％CH₃COOH中的殼聚糖里，反應(yīng)液在室溫下攪拌10h。將反應(yīng)液透析后凍干，得聚乙二醇修飾的殼聚糖(CS-PEG)。

(2)將CS-PEG溶解在5wt％的冰醋酸和鹽酸的等體積混合液中，加入疊氮化的環(huán)氧氯丙烷。反應(yīng)液用鋁箔避光，25℃反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物用含40％氨的甲醇溶液沉淀，過濾，并將沉淀依次用甲醇、水、丙酮洗滌，將終產(chǎn)物于真空干燥箱中烘干，得修飾有疊氮基團(tuán)和聚乙二醇的殼聚糖(N₃-CS-PEG)。

(3)取二代的聚酰胺胺樹形分子，加DMF進(jìn)行溶解，溶解完全后，在冰浴條件下滴加至的DTPA-NHS的DMF溶液中，滴加過程通N₂保護(hù)。滴加完成后，撤去冰浴，室溫反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑DMF，最后所得粘稠物加水溶解并透析、凍干，得偶聯(lián)有二乙烯三胺五乙酸的樹形分子(G2-DTPA)。

(4)將G2-DTPA加水溶解，向其中滴加GdCl₃·6H₂O的水溶液，邊滴加邊用NaOH調(diào)節(jié)PH＝6，42℃反應(yīng)10h后，透析并凍干，得偶聯(lián)有二乙烯三胺五乙酸和Gd³⁺的二代聚酰胺胺樹形分子(G2-DTPA-Gd)。

(5)取N₃-CS-PEG溶于1％的醋酸水溶液，取G2-DTPA-Gd溶于水后分別滴加至前述溶液中。反復(fù)凍融兩次除氧后，繼續(xù)通N₂，加入抗壞血酸鈉和五水硫酸銅，40℃反應(yīng)24h。反應(yīng)混合液透析后，凍干，即得所述造影劑PEG-CS-G2-DTPA-Gd(如下亦稱本發(fā)明造影劑，如圖1b所示)。

實施例2測定CS、CS-PEG、CS-PEG-N3和CS-PEG-G2-DTPA-Gd的紅外光譜圖，包括：采用壓片法制樣，分別檢測殼聚糖原料、CS-PEG、CS-PEG-N3和CS-PEG-G2-DTPA-Gd的紅外吸收，如圖2所示。

實施例3在0.5T的MRI測試儀上測試本發(fā)明高分子造影劑與Gd-DTPA弛 豫時間T₁及T₁加權(quán)成像，包括：

分別配制濃度為0.1～1.0mM的上述兩種樣品，測試后，以濃度為橫坐標(biāo)，弛豫時間的倒數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合得到本發(fā)明的造影劑和Gd-DTPA的弛豫率分別為9.53mM^-1·s^-1和4.25mM^-1·s^-1(圖3)。本發(fā)明的造影劑弛豫率明顯高于Gd-DPTA。通過兩者在不同濃度下的T₁加權(quán)成像(圖4)可以看出，隨濃度的增加，兩者均有變亮的趨勢，但本發(fā)明造影劑的造影效果明顯亮于Gd-DTPA。

實施例4造影劑的細(xì)胞毒性檢測

用WST法來測定本發(fā)明造影劑在A549細(xì)胞中的細(xì)胞毒性(圖5)。在96孔板中以每孔5000～8000細(xì)胞的密度種入A549細(xì)胞懸液100μL，將96孔板置于CO₂培養(yǎng)箱中，在37℃中培養(yǎng)24h。將本發(fā)明造影劑溶于完全培養(yǎng)基中，過濾除菌，用完全培養(yǎng)基將聚合物溶液稀釋成0.01～2mM不同的濃度。然后再將不同濃度的聚合物溶液加入到96孔板中，每孔加100μL，對照組加入100μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。最后移出培養(yǎng)基，每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基，然后每孔加入10μL WST，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸收值OD_450nm。每個聚合物濃度及對照組做4個平行樣。根據(jù)吸光值計算細(xì)胞的相對存活率?？瞻捉M即不加細(xì)胞及聚合物溶液，對照組即不加聚合物溶液。

細(xì)胞相對存活率(％)＝100×(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)

如圖5所示，A549細(xì)胞與PEG-CS-G2-DTPA-Gd孵育后的存活率與濃度相關(guān)，在Gd³⁺濃度低于0.1mM時，成活率均接近100％，至0.5mM時成活率在80％以上。表明本發(fā)明造影劑分子濃度在0.1mM以下時無生物毒性，0.5mM左右有較低的生物毒性。

上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。