本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著生物醫(yī)藥研究的發(fā)展，越來越多的蛋白質(zhì)藥物得到開發(fā)。由于蛋白質(zhì)藥物的不穩(wěn)定性，通常都采用注射的途徑進(jìn)入人體發(fā)揮治療效果。然而，藥物的注射會(huì)帶來許多問題。例如，蛋白類疫苗的注射常施用于低齡兒童，引起的疼痛與反抗會(huì)導(dǎo)致藥物注射劑量不準(zhǔn)、增大感染概率等問題。胰島素等蛋白質(zhì)類激素藥物需要頻繁、長(zhǎng)期注射，增加病人的痛苦、造成表皮局部壞死或增生，并增加感染概率，同時(shí)造成該類藥物在外周血管的分布濃度過高，產(chǎn)生副作用。

為解決上述的這類問題，近年來，許多研究者借鑒納米醫(yī)學(xué)材料的研究成果，將蛋白質(zhì)類藥物裝載于納米材料中，通過口服途徑給藥，既能減少病人的不適，又能模擬蛋白質(zhì)在體內(nèi)的分布情況，最大化的降低因給藥方式造成的副作用?？诜{米給藥體系是應(yīng)用納米輸運(yùn)體系對(duì)藥物的緩釋與控釋的作用，在消化道中保持蛋白質(zhì)藥物的活性，并在相應(yīng)的環(huán)境下釋放藥物。目前在納米材料口服輸運(yùn)蛋白質(zhì)的研究主要致力于增加輸運(yùn)效率這一方面?？梢詫⑦@類研究分為三類，防止消化酶降解，促進(jìn)腸粘膜附著，促進(jìn)穿透腸上皮。其中，促進(jìn)粒子穿過腸上皮細(xì)胞的途徑是許多研究致力攻克的問題，目前的成果主要分為四類，即通過M細(xì)胞進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，靶向通過Goblet細(xì)胞進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，通過胞吞作用進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，打開腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，使粒子穿過細(xì)胞間隙進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)。大量研究表明，殼聚糖(Chitosan，CS)由于帶正電，有助于增加其腸粘膜的附著率，同時(shí)，又具有打開腸上皮細(xì)胞間緊密連接的作用，可以增加輸運(yùn)體系的腸上皮透過性。因此，許多口服蛋白質(zhì)輸運(yùn)體系通過采用殼聚糖制備或通過殼聚糖包裹增加輸運(yùn)體系的輸運(yùn)效率。

但是，目前的口服蛋白質(zhì)輸運(yùn)體系均只考慮了運(yùn)輸效率的提高，并沒有實(shí)現(xiàn)同時(shí)增強(qiáng)治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的缺陷和技術(shù)不足，提供一種完全由天然材料組成的納米體系，經(jīng)口服途徑輸運(yùn)易降解、難吸收的大分子藥物，是一種純天然的納米輸運(yùn)體系。這種以聚半乳糖醛酸為基本材料，以雙重乳化體系為基本結(jié)構(gòu)的、毒性低、可降解的體系，加以殼聚糖的包裹修飾，具備應(yīng)用于胰島素等蛋白質(zhì)藥物口服輸運(yùn)研究與應(yīng)用的潛力，將在糖尿病治療、疫苗服用等領(lǐng)域具有應(yīng)用較高的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的是提供一種基于聚半乳糖醛酸和殼聚糖的納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備方法。

本發(fā)明另一目的是提供所述納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種基于聚半乳糖醛酸的納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備方法，是采用W/O/W雙重乳化法進(jìn)行制備，包括如下步驟：

S1.將聚半乳糖醛酸(PGLA)溶解于4～6w/v％泊洛沙姆188溶液(濃度優(yōu)選為5w/v％)中，再加入牛胰島素進(jìn)行溶解，得到內(nèi)水相；

S2.然后以乙酸乙酯為油相、18～22w/v％泊洛沙姆188溶液(濃度優(yōu)選為20w/v％)為外水相溶液，制備得到載胰島素PGLA納米粒，記為PGLA NP。

具體優(yōu)選地，步驟S1的具體方法為：將聚半乳糖醛酸(PGLA)加入5％(w/v)泊洛沙姆188(Pluronic 188)中，調(diào)節(jié)至pH＝3～5，溫育，晃動(dòng)，溶解20～28h，離心除去不溶沉淀，向得到的溶液中加入牛胰島素進(jìn)行溶解，得到內(nèi)水相。

其中，優(yōu)選地，步驟S1所述PGLA與5％(w/v)泊洛沙姆188的質(zhì)量體積比為：0.005～0.02g/ml。

更優(yōu)選地，步驟S1所述PGLA與5％(w/v)泊洛沙姆188的質(zhì)量體積比為：0.01g/ml。

優(yōu)選地，步驟S1所述調(diào)節(jié)至pH＝3～5。

更優(yōu)選地，步驟S1所述調(diào)節(jié)至pH＝4。

優(yōu)選地，步驟S1所述溫育是40～60℃溫育20～40min。

更優(yōu)選地，步驟S1所述溫育是50℃溫育30min。

優(yōu)選地，步驟S1所述溶解的時(shí)間為20～28h。

更優(yōu)選地，步驟S1所述溶解的時(shí)間為24h。

優(yōu)選地，步驟S1所述牛胰島素的加入量為4～6μg/μl。

更優(yōu)選地，步驟S1所述牛胰島素的加入量為5μg/μl。

優(yōu)選地，步驟S2的具體方法為：

S21.將步驟S1的內(nèi)水相加入乙酸乙酯中，超聲處理形成一重乳化體系，即油包水乳化液結(jié)構(gòu)；

S22.再將一重乳化體系(油包水乳化液)加入外水相溶液，超聲處理形成雙重乳化液，即水包油包水的納米顆粒結(jié)構(gòu)；

S23.后處理：再將雙重乳化液加入分散相1～3w/v泊洛沙姆188水溶液(濃度優(yōu)選為2w/v)，保持磁力攪拌，去除乙酸乙酯后，離心，用18～22mM HEPES(濃度優(yōu)選為20mM)洗滌離心重懸。

其中，優(yōu)選地，步驟S21所述內(nèi)水相和乙酸乙酯的體積比為1：4～6。

更優(yōu)選地，步驟S21所述內(nèi)水相和乙酸乙酯的體積比為1：5。

優(yōu)選地，步驟S22所述一重乳化體系和外水相溶液的體積比為0.2～0.4：1。

更優(yōu)選地，步驟S22所述一重乳化體系和外水相溶液的體積比為0.3：1。

優(yōu)選地，步驟S23所述雙重乳化液和分散相的體積比為10～15：100。

更優(yōu)選地，步驟S23所述雙重乳化液和分散相的體積比為13：100。

優(yōu)選地，步驟S23所述分散相2％泊洛沙姆188水溶液的pH為5.2～5.6。

更優(yōu)選地，步驟S23所述分散相2％泊洛沙姆188水溶液的pH為5.4。

優(yōu)選地，步驟S21和S22所述超聲的功率為700～900W。

更優(yōu)選地，步驟S21和S22所述超聲的功率為800W。

優(yōu)選地，步驟S21所述所述超聲的的時(shí)間為50～70s。

更優(yōu)選地，步驟S21所述所述超聲的的時(shí)間為60s。

優(yōu)選地，步驟S22所述所述超聲的的時(shí)間為40～50s。

更優(yōu)選地，步驟S22所述所述超聲的的時(shí)間為45s。

優(yōu)選地，步驟S23所述磁力攪拌的條件為800～12000rpm攪拌0.8～1.2h。

更優(yōu)選地，步驟S23所述磁力攪拌的條件為1000rpm攪拌1h。

優(yōu)選地，步驟S23所述去除乙酸乙酯是35～38℃(優(yōu)選為37℃)真空旋蒸抽去乙酸乙酯。

優(yōu)選地，步驟S23所述20mM HEPES的pH為6.8～7.2。

更優(yōu)選地，步驟S23所述20mM HEPES的pH為7.0。

優(yōu)選地，步驟S23所述離心是10000～14000rpm離心10～20min。

更優(yōu)選地，步驟S23所述離心是12000rpm離心15min。

優(yōu)選地，步驟S23所述洗滌離心的條件為700～900rpm離心8～15min。

更優(yōu)選地，步驟S23所述洗滌離心的條件為800rpm離心10min。

另外，進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供另一種基于聚半乳糖醛酸和殼聚糖的納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備方法，同上述制備PGLA NP的方法，不同之處在于將外水相溶液由泊洛沙姆188溶液替換為溶解有殼聚糖的泊洛沙姆188溶液，制備得到載胰島素的殼聚糖包裹PGLA納米顆粒，記為CS-PGLA NP。

其中，優(yōu)選地，所述殼聚糖和泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.04～0.06g/ml。

更優(yōu)選地，所述殼聚糖和泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.05g/ml。

另外，進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供另一種基于聚半乳糖醛酸和殼聚糖的納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備方法，同上述制備PGLA NP的方法，不同之處在于將外水相溶液由泊洛沙姆188溶液替換為溶解有殼聚糖和京尼平的泊洛沙姆188溶液，制備得到載胰島素的京尼平交聯(lián)的殼聚糖包裹PGLA顆粒，記為Gen-CS-PGLA NP。

其中，優(yōu)選地，所述殼聚糖和泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.04～0.06g/ml。

更優(yōu)選地，所述殼聚糖和泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.05g/ml。

優(yōu)選地，所述京尼平和泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.001～0.002g/ml。

更優(yōu)選地，所述京尼平和泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.001g/ml。

另外，由上述各方法制備得到的納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系，即三種納米體系PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP體系，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

所述納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系在作為或制備蛋白質(zhì)藥物口服輸運(yùn)體系中的應(yīng)用，也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)藥物為胰島素。

構(gòu)建納米輸運(yùn)體系的材料主要分為兩類，分別是天然聚合物和人工合成聚合物。天然聚合物具備毒性低、體內(nèi)易降解、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，而且，本發(fā)明篩選的天然材料除了具有低毒性質(zhì)之外，還具有潛在的醫(yī)療功能，即具有同時(shí)具備輸運(yùn)材料與治療藥物的雙重功能的潛力，使用具有抗病作用的天然聚合物制備輸運(yùn)載體，可以達(dá)到雙重治療的效果。

聚半乳糖醛酸(Polygalacturonic acid，PGLA)是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，是一種可以通過減緩腸道糖吸收的速度來達(dá)到控制血糖的作用的聚合物。此外，京尼平(Genipin,Gen)是一類從植物中提取的交聯(lián)劑，常用于交聯(lián)氨基，其毒性是具有類似功能的戊二醛的萬分之一倍。本發(fā)明將根據(jù)此兩種功能性物質(zhì)構(gòu)建輸運(yùn)體系，口服輸運(yùn)蛋白質(zhì)藥物，最大化的降低輸運(yùn)體系的毒性。同時(shí)，在輸運(yùn)胰島素治療糖尿病的過程中，載體與藥物本身都具有醫(yī)療作用，對(duì)糖尿病的治療可以達(dá)到雙重功效。本發(fā)明合成了基于聚半乳糖醛酸的納米顆粒，并分別使用游離殼聚糖和京尼平交聯(lián)的殼聚糖包裹，探索其功能優(yōu)化性。并以胰島素做為口服蛋白藥物的代表，測(cè)試了輸運(yùn)體系的蛋白質(zhì)輸運(yùn)效能與整體的血糖控制功能。

具體地，本發(fā)明使用雙重乳化法合成小粒徑的包裹口服蛋白質(zhì)藥物胰島素的PGLA納米顆粒、殼聚糖包裹的PGLA納米顆粒和由京尼平交聯(lián)的殼聚糖包裹的PGLA納米顆粒。在粒子表征測(cè)定方面，使用紅外波譜驗(yàn)證粒子的化學(xué)組成，使用馬爾文粒度儀檢測(cè)粒子平均粒徑分布、電位分布，使用透射電鏡觀察粒子大小、形態(tài)與分散情況，使用熱重分析檢測(cè)粒子熱穩(wěn)定性。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)粒子的載藥量、藥物釋放速率。使用人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞做為口服吸收的模型，分別檢測(cè)三種輸運(yùn)體系的細(xì)胞毒性與其被腸上皮細(xì)胞吸收的能力，比較三種口服輸運(yùn)體系的在輸運(yùn)胰島素過程中的效果及被小腸上皮細(xì)胞吸收的情況。在粒子的體內(nèi)應(yīng)用方面，使用STZ鏈脲佐菌素誘導(dǎo)制備SD大鼠糖尿病模型，結(jié)扎結(jié)腸灌藥孵育，觀察三種輸運(yùn)體系中的胰島素被小腸絨毛吸收的情況。分別口服三種胰島素輸運(yùn)體系，定量的獲得一次服藥后的血糖水平變化。

紅外光譜結(jié)果顯示，三種粒子均成功合成，并裝載了胰島素。PGLA納米顆粒、包裹殼聚糖的PGLA納米顆粒、包裹由京尼平交聯(lián)殼聚糖的PGLA納米顆粒平均粒徑約60nm，帶負(fù)電，透射電鏡觀察其粒徑約為60nm，外觀近似球形。三種粒子在體外緩沖液(pH＝1.1HCl，pH＝7.8PBS)的釋放實(shí)驗(yàn)表明具有突釋的釋放模式。研究使用STZ構(gòu)建大鼠糖尿病模型，成模標(biāo)準(zhǔn)由空腹血糖值確定(大于13mmol/L)，同時(shí)可以看出成模后大鼠的飲水量、進(jìn)食量都高于對(duì)照組，然而其體重卻無增長(zhǎng)趨勢(shì)。體內(nèi)研究表明，使用該體系運(yùn)載胰島素，可以使胰島素通過口服途徑輸運(yùn)至血液循環(huán)，達(dá)到控制血糖的作用。降血糖峰值出現(xiàn)在服藥后3h，藥物可以在9h內(nèi)，起到降低血糖的作用。

本研究成功制備基于天然聚合物PGLA、殼聚糖，以及天然交聯(lián)劑京尼平的口服輸運(yùn)體系，該體系的成分保證了其具備極低毒性，與基于人工合成的聚合物構(gòu)建的輸運(yùn)體系相比，具有極重要的優(yōu)勢(shì)。體系的納米級(jí)粒徑、殼聚糖的包裹都可以促進(jìn)其輸運(yùn)攜帶的藥物穿過小腸上皮，進(jìn)入血液循環(huán)。該體系在輸運(yùn)胰島素的應(yīng)用中效果顯著，也可以延用于其它水溶性蛋白質(zhì)或不穩(wěn)定大分子藥物的口服輸運(yùn)。

在此體系中，創(chuàng)新性的應(yīng)用油相將材料與胰島素的水相溶液分隔成不同的小液滴，保障粒子的小粒徑。同時(shí)，創(chuàng)新性的選擇了具有控制血糖功能的材料做為胰島素輸運(yùn)材料，在開發(fā)新型功能性材料、制備高效能胰島素輸運(yùn)體系方面，有重要的理論與實(shí)踐意義。

本研究使用聚半乳糖醛酸(PGLA)為合成口服蛋白質(zhì)的輸運(yùn)體系的基礎(chǔ)材料，并使用具有促進(jìn)腸吸收的殼聚糖進(jìn)行包裹修飾，提升體系的輸運(yùn)效率，最后使用植物來源的交聯(lián)劑京尼平使殼聚糖在PGLA體系外形成交聯(lián)的包裹層，探索其對(duì)輸運(yùn)體系的影響。

輸運(yùn)體系的選材與設(shè)計(jì)從源頭上保證了其具有極低毒性。本研究設(shè)計(jì)的輸運(yùn)體系是由植物細(xì)胞壁的主要成分聚半乳糖醛酸制備，同時(shí)研究也表明聚半乳糖醛酸具有減緩腸道吸收葡萄糖的功能，這使體系不僅毒性低，而且在治療糖尿病的應(yīng)用中，可以使輸運(yùn)體系本身就具有對(duì)疾病的治療效果。這是在藥物輸運(yùn)領(lǐng)域中的一次創(chuàng)新，即應(yīng)用天然的、具有治療功能的物質(zhì)制備藥物輸運(yùn)體系，使載藥輸運(yùn)體系從多方面達(dá)到治療作用，具備多重的疾病治療效果。

在輸運(yùn)體系的構(gòu)造中，本研究創(chuàng)新性的使用W/O/W的雙重乳化體系的性質(zhì)，使用油相將溶解有輸運(yùn)藥物與材料的水相分割成小水相環(huán)境，以使得材料與蛋白質(zhì)藥物之間能在微小環(huán)境中通過分子間作用力相結(jié)合，成為納米顆粒。這種方法使得合成的納米顆粒與傳統(tǒng)的W/O/W體系的納米顆粒相比，粒徑顯著較小。

對(duì)輸運(yùn)體系的表征研究中，紅外波譜的數(shù)據(jù)表明體系已成功合成，TEM圖像與動(dòng)態(tài)光散射分析都表明粒子具有較小的粒徑，這將幫助粒子通過M細(xì)胞穿過腸上皮，進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)。同時(shí)，粒子帶負(fù)電，其帶電量相對(duì)較大，粒子間靜電斥力幫助小粒徑的粒子分散，避免其團(tuán)聚，這輔助了粒子保持小粒徑，促進(jìn)其被腸上皮吸收，也幫助維持了粒子的穩(wěn)定性。相比與其它研究中的雙重乳化體系，本研究合成的粒子的粒徑較小，更傾向于具備較高吸收率。此外，熱重分析表明，載體的包裹減緩了胰島素的熱分解速率，同時(shí)，京尼平交聯(lián)的殼聚糖外殼也對(duì)增加體系的穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)。

體系對(duì)細(xì)胞活力影響極低，這證明了體系低毒性的特點(diǎn)。同時(shí)，體系可以被上皮細(xì)胞吸收，具有進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的能力，從細(xì)胞層面佐證了載藥體系能夠在腸道中被吸收。

對(duì)輸運(yùn)體系的體內(nèi)作用研究中，結(jié)扎腸段對(duì)三種粒子的吸收情況表明，三種載藥體系都可以成功將熒光胰島素輸運(yùn)入小腸絨毛結(jié)構(gòu)中，進(jìn)入血液循環(huán)，其中Gen-CS-PGLA NP具有最好的輸運(yùn)效果。對(duì)STZ誘導(dǎo)的SD大鼠口服胰島素輸運(yùn)體系后的血糖與血漿胰島素水平的研究表明：三種載胰島素的輸運(yùn)體系均保持了胰島素的活性，具有降血糖的功能，于口服后3h血糖和血漿胰島素水平達(dá)到峰值。其中，CS-PGLA體系的藥效顯著優(yōu)于PGLA體系組，最大降糖效果為初始血糖值的50％。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本研究首先篩選植物來源、具有降血糖活性的聚合物，得到無毒、易降解、具有控制血糖作用的目標(biāo)物質(zhì)聚半乳糖醛酸(PGLA)，并創(chuàng)新性的使用水包油包水體系將溶解于水相的胰島素與PGLA分割成乳液微粒，旋蒸除去有機(jī)溶劑后，PGLA與胰島素之間的氫鍵維持其穩(wěn)定的納米粒形態(tài)。

另外，在此基礎(chǔ)上，又通過包裹殼聚糖外殼、包裹由京尼平交聯(lián)的殼聚糖外殼，制備出可以用于水溶性蛋白質(zhì)、水溶性大分子藥物的口服輸運(yùn)體系，輸運(yùn)效率高、吸收率高，以胰島素作為標(biāo)志蛋白質(zhì)藥物，研究表明三種粒子都能夠進(jìn)行口服胰島素的輸運(yùn)，具有明顯的提高降血糖效果的作用，具有較好的輸運(yùn)與疾病治療效果。

本發(fā)明制備的納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系，具備應(yīng)用于胰島素等蛋白質(zhì)藥物口服輸運(yùn)研究與應(yīng)用的潛力，將在糖尿病治療、疫苗服用等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為W/O/W雙重乳化法制備納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系示意圖。

圖2為三種納米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的紅外光譜(A)與拉曼光譜圖(B)。

圖3為三種納米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的粒徑(A)、電位(B)與TEM圖像(C)。

圖4為三種納米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP與胰島素的熱重分析。

圖5為胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6為三種納米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP在模擬胃腸緩沖液中的胰島素釋放曲線。

圖7為MTT測(cè)定不同濃度的三種納米粒對(duì)細(xì)胞活力的影響。

圖8為Caco-2腸上皮細(xì)胞吸收三種FITC-胰島素輸運(yùn)體系的情況。

圖9為I型糖尿病模型的建立及建模鼠與正常鼠的體型比較。

圖10為SD大鼠建模期間血糖(A)和體重(B)監(jiān)測(cè)結(jié)果；圖A中方形為對(duì)照組，其它形狀為建模組；圖B中黑色線為實(shí)驗(yàn)建模組，灰色線為對(duì)照組。

圖11為SD大鼠建模期間日飲水(A)與進(jìn)食量(B)監(jiān)測(cè)結(jié)果；圖中黑色線為實(shí)驗(yàn)建模組，灰色線為對(duì)照組。

圖12為三種納米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的腸上皮透過性檢測(cè)。

圖13為I型糖尿病大鼠口服三種載胰島素納米體系后血糖變化圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購(gòu)。

以下實(shí)施例所用到的材料如下：

實(shí)驗(yàn)試劑：聚半乳糖醛酸(PGLA)，殼聚糖，Pluronic 188，牛胰島素購(gòu)于西格瑪公司，京尼平購(gòu)于上海西寶生物有限公司，乙酸乙酯購(gòu)于廣州博強(qiáng)生物科技有限公司，STZ鏈尿佐菌素，購(gòu)于阿拉丁生化科技有限公司。胰酶、高糖DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸均為Gibco公司產(chǎn)品；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；96/24孔聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板為美國(guó)Corning康寧公司產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)儀器：Sigma32184高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI 7650透射電子顯微鏡，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠78-1磁力攪拌器，Nikon顯微鏡，英國(guó)Malvern ZEN3600，日本Olympus公司光學(xué)倒置顯微鏡，德國(guó)Bruker VERTEX 33傅里葉變換紅外光譜儀，瑞士Mettler,TGA/DSC 1同步熱分析儀，中國(guó)賽默飛世爾Cryotome FSE冰凍切片機(jī)。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：Caco-2人結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞，由廣東藥科大學(xué)提供。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

實(shí)施例1納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備

采用W/O/W雙重乳化法合成納米顆粒(納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系)，如附圖1所示。

具體地，所述納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的制備方法如下：

1、制備載胰島素PGLA納米粒(PGLA NP)

(1)制備內(nèi)水相：

將PGLA加入5％Pluronic 188中，調(diào)節(jié)至pH＝4，50℃溫育30min，晃動(dòng)，溶解24h，離心除去不溶沉淀，得到的溶液取200μl，加入1mg牛胰島素進(jìn)行溶解；所述PGLA與5％(w/v)泊洛沙姆188的質(zhì)量體積比為10mg/ml。

(2)以乙酸乙酯為油相，20％(w/v)Pluronic 188為外水相溶液，制備PGLA NP：

將步驟(1)的內(nèi)水相加入1ml乙酸乙酯中，超聲60s，形成一重乳化體系，即油包水乳化液結(jié)構(gòu)。

再將一重乳化體系(油包水乳化液)加入4ml 20％(w/v)Pluronic 188外水相溶液，超聲45s，形成雙重乳化液，即水包油包水的納米顆粒結(jié)構(gòu)。

(3)后處理：再將雙重乳化液加入分散相40ml 2％Pluronic 188水溶液(pH5.4)，保持磁力攪拌1000rpm 1h。37℃真空旋蒸抽去乙酸乙酯。將納米懸液離心，12000rpm，15min，用1.8ml 20mM HEPES(pH 7.0)洗滌離心(800rpm，10min)重懸。

2、合成載胰島素的殼聚糖包裹PGLA納米顆粒(CS-PGLA NP)

方法同上述制備PGLA NP的方法，不同之處在于將外水相溶液由20％(w/v)泊洛沙姆188溶液替換為溶解有殼聚糖的20％(w/v)泊洛沙姆188溶液

殼聚糖和20％(w/v)泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.05g/ml。

3、合成載胰島素的京尼平交聯(lián)的殼聚糖包裹PGLA顆粒(Gen-CS-PGLA NP)

方法同上述制備PGLA NP的方法，不同之處在于將外水相溶液由20％(w/v)泊洛沙姆188溶液替換為溶解有殼聚糖和京尼平的20％(w/v)泊洛沙姆188溶液。

所述殼聚糖和20％(w/v)泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.05g/ml。

所述京尼平和20％(w/v)泊洛沙姆188溶液的質(zhì)量體積比為0.001g/ml。

實(shí)施例2納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的表征

1、紅外光譜檢測(cè)(FTIR)

(1)將體系合成的原材料PGLA、殼聚糖、胰島素、京尼平與三種體系做紅外光譜檢測(cè)。將PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP冷凍干燥，然后放入研缽中，加入一定量的KBr，研磨均勻使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影響，之后放入干燥機(jī)中進(jìn)行干燥處理。在油壓機(jī)上用10MPa左右的壓力將混合物壓成透明薄片，使用德國(guó)Bruker VERTEX 33傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定。

(2)紅外光譜分析可以在一定程度上說明合成的納米體系的復(fù)合成分(圖2A)。PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的紅外光譜顯示三者在1100cm^-1處(C-O-C振動(dòng))都有峰，這可能是由其中的多糖結(jié)構(gòu)造成的。胰島素的標(biāo)志峰出現(xiàn)在1643cm^-1(伯氨基的C＝O振動(dòng))附近，這說明三種納米顆粒都成功包裹了胰島素。

此外，3446cm^-1處的吸收峰代表著-NH-的振動(dòng)，在PGLA NP中，此峰位于3446cm^-1處，在CS-PGLA NP中，位于3443cm^-1處，在Gen-CS-PGLA NP中，位于3457cm^-1處。同時(shí)，在1000cm^-1至1250cm^-1這一段紅外指紋區(qū)可以看出，三者之間有細(xì)微差別。這說明了CS-PGLA NP中殼聚糖的成功包裹，以及Gen-CS-PGLA NP中京尼平對(duì)殼聚糖中-NH₂基團(tuán)的交聯(lián)(圖2A)。

2、拉曼光譜檢測(cè)

(1)將體系合成的原材料PGLA、殼聚糖、胰島素，以及三種納米體系PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP體系完全干燥，取適當(dāng)樣品置于載樣板的凹槽中，使用蓋玻片壓制，使樣品緊實(shí)并具有平整表面，使用拉曼光譜儀檢測(cè)。

(2)拉曼光譜從另一個(gè)側(cè)面檢測(cè)了粒子的成分(圖2B)。

在PGLA NP，CS-PGLA NP，Gen-CS-PGLA NP中，都具有多糖成分，即-COC-(位于1143cm^-1)和糖環(huán)結(jié)構(gòu)(位于854cm^-1)。

同時(shí)，三者中都具有位于1300cm^-1處的仲酰胺鍵，即肽鍵，說明三種納米粒子中都包裹有胰島素。

在Gen-CS-PGLA NP中，位于1429cm^-1酰胺鍵的位置形成了新的峰，這表明京尼平與殼聚糖發(fā)生了反應(yīng)，形成了新的酰胺鍵。

3、粒徑、Zeta電位檢測(cè)與透射電鏡下的形態(tài)

(1)納米顆粒粒徑和Zeta電位檢測(cè)使用Zetasizer納米分析儀使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)方法分析測(cè)量。粒徑測(cè)定中，樣本分散于超純水中，平衡120s。儀器將自動(dòng)測(cè)量30次，并將結(jié)果依據(jù)累積分析得到流體力學(xué)粒徑。Zeta電位測(cè)定中，樣本溶于超純水中，測(cè)量30次。所有的測(cè)量重復(fù)3次。

(2)將粒子的懸液滴在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置5min，用濾紙吸干多余水分，靜置30min，待其完全干透。使用HITACHI 7650透射電鏡，電子加速電壓為300kV，分別于1x10⁴倍、2x10⁴倍的放大倍數(shù)下，觀察粒子形態(tài)。

(3)由動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定的PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP載胰島素納米顆粒的平均粒徑分別為60±4nm，67±5nm，58±3nm(圖3A)；Zeta電位分別為-15.15±0.63mV，-14.52±1.15mV，-16.53±1.68mV(圖3B)。在透射電鏡下，粒子為直徑為60nm左右、大小均勻的圓球狀顆粒(圖3C)。

小粒徑是促進(jìn)納米粒子吸收的重要特征，在穿過細(xì)胞間隙、被腸上皮細(xì)胞攝取時(shí)，小粒徑都有較大的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，三種粒子都帶負(fù)電，這又保證了粒子之間的相互排斥，使粒子能夠相互獨(dú)立不團(tuán)聚。殼聚糖的包裹使CS-PGLA NP的電性較PGLA NP稍向正電偏移。

4、熱重分析

(1)將PGLA NP，CS-PGLA NP，Gen-CS-PGLA NP冷凍干燥處理，使用瑞士Mettler TGA/DSC 1同步熱分析儀，在N₂氛圍下，測(cè)量范圍為30℃至900℃，升溫速度為10℃/min。

(2)熱重分析可以揭示納米體系的熱量交換與質(zhì)量分解的特征模式。位于TG曲線30℃至100℃的質(zhì)量損失是由于結(jié)合水的蒸發(fā)引起的。比較PGLA納米粒子與CS-PGLA、Gen-CS-PGLA納米體系，可見在100℃之前，兩種包裹了殼聚糖的粒子的失水較PGLA體系多10％?？芍?dú)ぞ厶堑?NH₂基團(tuán)與水分子之間形成氫鍵，可以使粒子結(jié)合更多的水份。

有關(guān)于殼聚糖的研究表明其在240℃的質(zhì)量損失對(duì)應(yīng)的是其分子間氫鍵斷裂相關(guān)。三類載胰島素的納米體系具有豐富的-NH₂，-OH，-COOH功能基團(tuán)，其間存在較強(qiáng)的分子間氫鍵。與此同時(shí)，在300℃-500℃之間，三種載胰島素的納米體系的質(zhì)量損失顯著少于胰島素組(10％-20％)，這也從另一個(gè)側(cè)面印證了納米粒子的裝載保護(hù)了部分胰島素的推斷。

比較包裹游離殼聚糖與交聯(lián)的殼聚糖的兩種體系，可見在500℃之后，Gen-CS-PGLA體系較穩(wěn)定，其失重曲線較平緩，在600℃-800℃之間避免了10％的質(zhì)量損失。此溫度對(duì)應(yīng)的是C-C骨架或C-N骨架的斷裂，證明了京尼平的交聯(lián)使輸運(yùn)體系的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定(圖4)。

5、藥物包封率測(cè)定

(1)首先繪制胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別配置不同濃度的胰島素溶液(0.1mg/ml,0.01mg/ml,0.005mg/ml,0.001mg/ml,0.000 5mg/ml,0.000 1mg/ml)，使用德國(guó)Perkin Elmer Lambda 25紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在200nm–300nm之間的紫外吸收光譜。并依據(jù)其吸收峰繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算曲線的線性擬合方程與擬合度。

使用高速離心機(jī)將最終合成的包裹胰島素的粒子懸液使用高速離心機(jī)離心，11000rpm/min，10℃，30min。取上清真空懸蒸濃縮后，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其胰島素吸收光譜，并依據(jù)其在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的波長(zhǎng)處的吸光值換算胰島素含量。胰島素的包封率與載藥率根據(jù)以下公式計(jì)算：

(2)胰島素在稀HCl溶液中的紫外吸收光譜顯示，在205nm與275nm分別具有吸收峰，并且位于205nm處的吸收峰高于275nm處10倍以上。許多研究也提出，胰島素在205nm處的吸收峰更適宜于低濃度的樣本檢測(cè)。從10^-4mg/ml至1mg/ml的范圍內(nèi)，胰島素在205nm處的紫外吸收值呈半拋物線型。

由于本研究涉及的樣本胰島素濃度較低，選取10^-4mg/ml與10^-2mg/ml之間的紫外吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可見其具有線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝18.641x+0.0019，其相關(guān)性指數(shù)R²＝0.9967(圖5)。

三種納米輸運(yùn)體系的載藥效率與載藥量如表1所示。

表1三種納米輸運(yùn)體系的載藥效率與載藥量

6、藥物釋放率測(cè)定

(1)配置0.1M HCl和pH＝6.8的PBS緩沖液，在10ml緩沖液中分別加入200μl粒子溶液，冰浴，置于搖床上，以50r/min輕輕晃動(dòng)。分別于0.5h，1h，2h，4h，6h取樣700μl，離心，取上清用于胰島素含量檢測(cè)，即使用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定其吸光度，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)換算。每個(gè)釋放體系重復(fù)3次，收集數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

(2)圖6表明了PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP分別在0.1M HCl和PBS(pH 6.8)中的釋放情況?？梢娙N粒子在兩種不同pH值的體系中都存在顯著的突釋，即在0.5h時(shí)，藥物釋放達(dá)到接近90％，此后，1h，2h，4h，6h的胰島素釋放量未見顯著的增加。

體外釋放的結(jié)果表明，三種體系在酸性環(huán)境中的藥物釋放速率稍慢于中性環(huán)境，但并不具有顯著的pH感應(yīng)性。

實(shí)施例3納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞系由廣東藥學(xué)院提供。細(xì)胞在在培養(yǎng)瓶中增殖培養(yǎng)至80％后，以5000/孔的密度接種至96孔板上，培養(yǎng)1、2天，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含20％新生牛血清、非必需氨基酸的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃恒溫，5.0％CO₂。

2、輸運(yùn)體系的細(xì)胞毒性測(cè)試

(1)分別取不同劑量的輸運(yùn)體系加入正在培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞中，24h后，使用MTT法測(cè)量細(xì)胞存活率。即在96孔培養(yǎng)板上接種Caco-2細(xì)胞，5000個(gè)/孔，培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，及不同濃度的胰島素輸運(yùn)體系，培養(yǎng)24h后，加入5mg/ml的MTT溶液20ul/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)基，加入DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)形成的甲瓚。在搖床上低速振蕩10min，于酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長(zhǎng)510nm。

(2)胰島素輸運(yùn)體系在細(xì)胞層面的生物毒性將由MTT法得到評(píng)估。在人腸上皮細(xì)胞Caco-2培養(yǎng)基內(nèi)加入較高濃度的胰島素輸運(yùn)體系，可見細(xì)胞活力并未受到太大影響，細(xì)胞比活力都保持在90％以上。其中，PGLA NP，CS-PGLA NP體系對(duì)細(xì)胞活力有促進(jìn)作用，PGLA NP組的細(xì)胞比活力均在130％以上，CS-PGLA NP組的細(xì)胞活力隨著體系的濃度有所上升，整體細(xì)胞比活力值均在120％以上。Gen-CS-PGLA NP組的細(xì)胞活力都在100％上下，對(duì)細(xì)胞活力并無明顯的促進(jìn)或抑制作用(圖7)。

3、細(xì)胞對(duì)輸運(yùn)體系的吸收攝取

Caco-2腸上皮細(xì)胞對(duì)輸運(yùn)體系的吸收

(1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，以5×10⁴個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。加入載有FITC-胰島素的三種輸運(yùn)體系的新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4h。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次；每孔中加入4％多聚甲醛，室溫下固定30min；用PBS洗3次，向每孔中加入0.2％Triton X-100透化30min；再用PBS洗3次；避光向每孔中加入DAPI(5μg/ml)，染色1min，再用PBS洗3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)藍(lán)色的細(xì)胞核、呈現(xiàn)綠色的FITC胰島素，觀察其相對(duì)位置及熒光亮度。

(2)通過使用荷載FITC-胰島素的粒子孵育Caco-2細(xì)胞，可以研究細(xì)胞對(duì)粒子的攝取。粒子是否被細(xì)胞攝取可以通過細(xì)胞內(nèi)是否有FITC的綠色熒光來判斷，熒光的強(qiáng)度可以作為粒子攝取率的輔助判斷標(biāo)準(zhǔn)。

PGLA NP，CS-PGLA NP，Gen-CS-PGLA NP均協(xié)助了FITC-胰島素進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光(圖8)。從圖中可以看出，明場(chǎng)光照下，Caco-2成片生長(zhǎng)，細(xì)胞間形成緊密連接。使用340nm激光激發(fā)后，可見DAPI對(duì)細(xì)胞核的染色，使細(xì)胞核顯現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞核為相互獨(dú)立的、大小均勻的圓球?？梢娏Ｗ訉?duì)細(xì)胞核的完整性并無影響。使用495nm激光激發(fā)后，可見FITC的綠色熒光，做為胰島素的示蹤劑。圖中可見綠色細(xì)胞形態(tài)的中空?qǐng)A球。DAPI與FITC的融合圖片可以看出，綠色熒光分布在藍(lán)色熒光周圍，可以認(rèn)為細(xì)胞對(duì)三種粒子均有吸收，并且隨著修飾的增加，吸收量增多，即細(xì)胞對(duì)CS-PGLA NP的吸收量大于PGLANP的量，細(xì)胞對(duì)Gen-CS-PGLA NP的吸收量最多。

實(shí)施例4納米口服蛋白質(zhì)藥物輸運(yùn)體系的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1、I型糖尿病鼠模型構(gòu)建

(1)購(gòu)買6周齡SD大鼠，適應(yīng)環(huán)境一周，取3只做對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組。大鼠禁食一夜，測(cè)量血糖，使用pH＝4.4的檸檬酸緩沖液在注射前冰浴避光配制STZ溶液，濃度為50mg/ml。對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠按50mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射。

自建模當(dāng)天起，每日測(cè)量大鼠體重、進(jìn)食與飲水量。第3、6、9天分別禁食一夜后，使用羅氏活力型血糖儀監(jiān)測(cè)空腹血糖。第6、9天空腹血糖值都大于13mmol/L的，認(rèn)定為I型糖尿病模型大鼠。

將I型糖尿病成模大鼠按空腹血糖均值分組，保持每組大鼠的血糖均值無顯著差異。

(2)使用雄性SD大鼠，腹腔注射STZ，劑量為50mg/kg。STZ注射組與對(duì)照組大鼠的體型有明顯的差別(圖9)。

注射STZ后第3天，大鼠禁食一夜后，STZ注射組的血糖就已顯著高于對(duì)照組。1只血糖值為12.6mmol/L，其余STZ注射組血糖值都在20mmol/L以上，第6、9天，趨勢(shì)未變化，可以認(rèn)定除血糖值為12.6mmol/L的這只大鼠外，都建模成功，建模成功率達(dá)到92％(圖10A)。

從注射STZ前1天至注射STZ后第9天的大鼠體重、飲水、進(jìn)食量的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明(圖10B、圖11)，STZ注射組與對(duì)照組的體重、飲水、進(jìn)食量在注射STZ前1天的數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)差異，注射前1天至注射當(dāng)天的變化趨勢(shì)也完全重合。至注射STZ當(dāng)天起，體重、飲水、進(jìn)食量出現(xiàn)差異，即對(duì)照組體重不斷增長(zhǎng)，飲水與進(jìn)食量無顯著變化；STZ注射組體重?zé)o增長(zhǎng)趨勢(shì)，飲水量激增至注射前的7倍左右，進(jìn)食量增加約50％。

2、小腸絨毛吸收粒子的熒光顯微觀察

(1)取5只患1型糖尿病的SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食一夜，不禁水。使用戊巴比妥鈉(0.05mg/kg)麻醉，腹部裸露后，結(jié)扎出5cm回腸，使用生理鹽水清洗。在每只實(shí)驗(yàn)鼠的結(jié)扎腸斷中分別注入0.5ml生理鹽水、0.5ml游離FITC-胰島素、0.5ml PGLA載FITC-胰島素，0.5ml CS-PGLA載FITC-胰島素，0.5ml GEN-CS-PGLA載FITC-胰島素。結(jié)扎腸段，孵育2h后，處死鼠，取出每個(gè)結(jié)扎的腸斷，用PBS清洗，然后，使用4％多聚甲醛固定2h，在30％蔗糖溶液中浸一夜。樣本埋藏并置于-20℃冷凍。使用冰凍切片機(jī)(Cryotome FSE，賽默飛世爾科技，中國(guó))將冰凍回腸斷切出20μm薄片，使用DAPI染色，再使用熒光顯微鏡觀察。

(2)通過結(jié)扎回腸段，使用藥物孵育，可以比較小腸絨毛對(duì)藥物及輸運(yùn)體系的吸收情況。本研究設(shè)置了生理鹽水組為陰性對(duì)照，其冰凍切片的顯微照片中僅呈現(xiàn)細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，游離FITC-胰島素組為陽性對(duì)照，其冰凍切片的顯微照片中顯現(xiàn)了細(xì)胞核的藍(lán)色熒光和FITC-胰島素的綠色熒光。3組輸運(yùn)體系組腸段冰凍切片中均可見處于小腸絨毛上半部的FITC-胰島素的綠色熒光。Gen-CS-PGLA載FITC胰島素組中，還可見腸絨毛基部的血管中有綠色熒光。由熒光強(qiáng)度可知，PGLA、CS-PGLA、Gen-CS-PGLA輸運(yùn)體系的輸運(yùn)效果有逐漸優(yōu)化的趨勢(shì)(圖12)。

3、藥物體內(nèi)藥效監(jiān)測(cè)

(1)取對(duì)照組大鼠和4組I型糖尿病大鼠，給患1型糖尿病SD大鼠斷糧4h后，分別設(shè)置生理鹽水組和3組治療組，每組鼠不少于3只。服用對(duì)應(yīng)的藥物后(口服胰島素量為50IU/kg)，于0h，1h，3h，5h，9h取尾尖血，使用羅氏活力型血糖儀測(cè)定血糖。

(2)圖13表明了I型糖尿病模型大鼠口服三種載胰島素納米體系(50IU/kg)的效果?？诜葝u素溶液組沒有降低血糖水平，也沒有升高血清胰島素水平。

然而，口服載胰島素的輸運(yùn)體系均保持了胰島素的活性，具有降血糖的功能，于口服后2.5h降糖效果達(dá)到峰值。

其中，CS-PGLA NP體系的藥效顯著高于PGLA NP體系組，于口服后2.5h達(dá)到最大降糖效果，即使血糖降低50％。而Gen-CS-PGLA NP體系組具有一定的控制血糖能力，但效果要稍低于其它兩組輸運(yùn)體系。但是上述研究結(jié)果顯示，Gen-CS-PGLA NP具有最好的輸運(yùn)效果。

綜上研究結(jié)果顯示，本發(fā)明成功制備了一種由植物來源的物質(zhì)聚半乳糖醛酸的口服藥物輸運(yùn)體系，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用天然聚合物殼聚糖與天然交聯(lián)劑京尼平進(jìn)行修飾，該體系可以用于水溶性蛋白質(zhì)、水溶性大分子藥物的口服輸運(yùn)。

在以胰島素為例的口服輸運(yùn)研究中，本研究制備的PGLA、CS-PGLA、Gen-CS-PGLA納米體系能夠具備較高的載藥率、具有較強(qiáng)的小腸吸收率，在體內(nèi)研究中，也能夠發(fā)揮胰島素的效應(yīng)，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)控制血糖水平。