本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種非人哺乳動物肥胖癥或其相關(guān)疾病動物模型的建立方法及其用途。

背景技術(shù)：

肥胖癥是一組常見的、古老的代謝癥群。當(dāng)人體進(jìn)食熱量多于消耗熱量時，多余熱量以脂肪形式儲存于體內(nèi)，其量超過正常生理需要量，且達(dá)一定值時遂演變?yōu)榉逝职Y。正常男性成人脂肪組織重量約占體重的15-18％，女性約占20-25％。隨年齡增長，體脂所占比例相應(yīng)增加。因體脂增加使體重超過標(biāo)準(zhǔn)體重20％或體重指數(shù)(BMI＝體重(Kg)/(身高)²(m²))大于24者稱為肥胖癥。如無明顯病因可尋者稱單純性肥胖癥，具有明確病因者稱為繼發(fā)性肥胖癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計它是人類目前面臨的最容易被忽視、但發(fā)病率卻在急劇上升的一種疾病。

目前肥胖癥的致病機(jī)理尚未研究清楚，缺乏安全有效的治療手段，因此深入探討其發(fā)病機(jī)理是治療肥胖癥的重要基礎(chǔ)。小鼠疾病模型在研究人類疾病的致病機(jī)理和藥物篩選中起到了非常重要的作用。在探究人類的認(rèn)知功能、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病、消化系統(tǒng)疾病等方面，小鼠模型具有巨大的優(yōu)勢。

基因敲除是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)，其基于小鼠胚胎干細(xì)胞DNA同源重組原理，也稱為“基因打靶”技術(shù)。其后利用這項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建了數(shù)千種基因突變小鼠，這些基因工程小鼠不僅為生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究帶來了突破，也在新藥研發(fā)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

目前的小鼠肥胖癥模型的建立方法主要有食物性、下丘腦性與內(nèi)分泌性肥胖模型等，但肥胖模型的制作十分費(fèi)時、條件繁瑣、成功率欠高，還難以滿足研究肥胖機(jī)制及不同類型減肥藥的需要。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種可以較好地模擬臨床上的肥胖癥，個體差異較小，其遺傳背景高度一致，可以作為研究肥胖癥的發(fā)病機(jī)理以及新藥篩選的有力工具的動物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可以較好地模擬臨床上的肥胖癥，個體差異較小，其遺傳背景高度一致，可以作為研究肥胖癥的發(fā)病機(jī)理以及新藥篩選的有力工具的動物模型。

本發(fā)明的第一方面提供了一種非人哺乳動物的肥胖癥或其相關(guān)疾病動物模型的制備方法，包括以下步驟：

(a)提供非人哺乳動物的細(xì)胞，將所述細(xì)胞中的Glce基因失活，得到Glce基因失活的非人哺乳動物細(xì)胞；

(b)利用步驟(a)中得到的Glce基因失活的細(xì)胞，制備得到Glce基因失活的肥胖癥或其相關(guān)疾病的動物模型。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，還包括如下步驟：

(a1)利用DNA同源重組技術(shù)，將所述Glce基因中的外顯子3至外顯子5中的一個或多個外顯子剔除或中斷，并用篩選標(biāo)記替換，得到Glce基因失活的非人哺乳動物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，還包括如下步驟：

(b1)利用步驟(a)中得到的Glce基因失活的非人哺乳動物細(xì)胞制備得到嵌合非人哺乳動物；

(b2)將步驟(b1)中得到的嵌合非人哺乳動物和正常野生型非人哺乳動物交配繁育，在后代中篩選獲得Glce基因失活的雜合子非人哺乳動物；

(b3)通過將步驟(b2)中得到的雜合子非人哺乳動物相互交配獲得Glce基因失活的純合子非人哺乳動物，從而得到Glce基因失活的非人哺乳動物的動物模型。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b3)中，還包括步驟(b4)：將Glce基因失活的純合子非人哺乳動物與同一物種的神經(jīng)元特異性敲除工具非人哺乳動物進(jìn)行雜交，從而獲得神經(jīng)元特異性的Glce基因失活的非人哺乳動物的動物模型。

在另一優(yōu)選例中，所述將Glce基因失活包括基因剔除、基因中斷或基因插入。

在另一優(yōu)選例中，所述基因失活包括Glce基因不表達(dá)，或表達(dá)沒有活性的Glce蛋白。

在另一優(yōu)選例中，所述Glce基因失活是通過缺失或敲除Glce的外顯子3而失活。

在另一優(yōu)選例中，所述的Glce基因失活是神經(jīng)元特異性的Glce基因失活。

在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物為嚙齒動物或靈長目動物，較佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴。

在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物是小鼠，并且在步驟(b4)中把Glce Loxp/Loxp小鼠與工具鼠NSE(neuron-specific enolase)-Cre交配，即得到在神經(jīng)元細(xì)胞特異性Glce基因敲除小鼠簡稱cKO小鼠(即神經(jīng)元特異性Glce失活小鼠)。

在另一優(yōu)選例中，所述篩選標(biāo)記選自下組：抗性基因、熒光蛋白基因、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述篩選標(biāo)記包括neo基因。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中得到的Glce基因失活的非人哺乳動物的動物模型中，與野生型對照動物相比，具有選自下組的一個或多個特征：

(t1)形態(tài)的肥胖程度增加；

(t2)肥胖癥狀的發(fā)生率增加；

(t3)脂肪組織濕重增加；

(t4)曠場活動水平降低；

(t5)探索新異環(huán)境的欲望降低；

(t6)抑郁樣行為增加；

(t7)抑郁程度增加；

(t8)焦慮樣行為增加；

(t9)焦慮程度增加；

(t10)恐懼樣行為增加；

(t11)恐懼程度增加；

(t12)認(rèn)知障礙增加；

(t13)中風(fēng)的發(fā)生率增加。

在另一優(yōu)選例中，所述脂肪組織濕重選自下組：內(nèi)臟脂肪組織濕重、皮下脂肪組織濕重、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述內(nèi)臟脂肪組織濕重選自下組：雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重、雙側(cè)腎周脂肪組織濕重、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述皮下脂肪組織濕重包括雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重。

在另一優(yōu)選例中，所述曠場活動水平選自下組：曠場活動的路程、活動時間、活動速度、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述抑郁樣行為選自下組：在曠場實(shí)驗(yàn)中探索中央?yún)^(qū)域的時間減少，表現(xiàn)出探索新異環(huán)境的欲望降低、在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時間增加，表現(xiàn)出行為絕望、或其組合。

本發(fā)明第二方面提供了一種本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，將該模型用作研究肥胖癥或其相關(guān)疾病的動物模型。

在另一優(yōu)選例中，所述肥胖癥或其相關(guān)疾病選自下組：肥胖癥、高血脂、高血壓、糖尿病、或其組合。

本發(fā)明第三方面提供了一種本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，用于篩選或鑒定可減輕或治療肥胖癥或其相關(guān)疾病的物質(zhì)(治療劑)。

在另一優(yōu)選例中，所述肥胖癥或其相關(guān)疾病選自下組：肥胖癥、高血脂、高血壓、糖尿病、或其組合。

本發(fā)明第四方面提供了一種篩選或鑒定治療或緩解肥胖癥或其相關(guān)疾病的潛在治療劑的方法，包括以下步驟：

(a)在測試組中，在測試化合物的存在下，將測試化合物施用于本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型，檢測測試組中所述動物模型肥胖癥或其相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度Q1；并且在不施用所述測試化合物且其他條件相同的對照組中，檢測對照組中所述動物模型肥胖癥或其相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度Q2；

(b)將上一步驟所檢測的嚴(yán)重程度Q1和嚴(yán)重程度Q2進(jìn)行比較，從而確定所述測試化合物是否是治療或緩解肥胖癥或其相關(guān)疾病的潛在治療劑；

其中，如果嚴(yán)重程度Q1顯著低于嚴(yán)重程度Q2時，則表示所述測試化合物為治療或緩解肥胖癥或其相關(guān)疾病的潛在治療劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測肥胖癥或其相關(guān)疾病嚴(yán)重程度包括檢測選自下組的一個或多個指標(biāo)的變化：形態(tài)變化、肥胖癥狀的發(fā)生率的變化、脂肪組織濕重的變化。

在另一優(yōu)選例中，所述形態(tài)變化包括形態(tài)肥胖程度增加。

在另一優(yōu)選例中，所述脂肪組織濕重選自下組：內(nèi)臟脂肪組織濕重、皮下脂肪組織濕重、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述內(nèi)臟脂肪組織濕重選自下組：雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重、雙側(cè)腎周脂肪組織濕重、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述皮下脂肪組織濕重包括雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重。

在另一優(yōu)選例中，所述的肥胖癥或其相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度降低表現(xiàn)為：形態(tài)的肥胖程度減輕、肥胖癥狀的發(fā)生率降低、和/或脂肪組織濕重降低。

在另一優(yōu)選例中，所述“顯著低于”指具有生物學(xué)重復(fù)的測試組在施用測試化合物后的嚴(yán)重程度Q1低于具有生物學(xué)重復(fù)的對照組在施用測試化合物后嚴(yán)重程度Q2，且經(jīng)過t檢驗(yàn)其P值小于0.05。

在另一優(yōu)選例中，所述“顯著低于”指嚴(yán)重程度Q1/嚴(yán)重程度Q2之比值≤1/2，較佳地≤1/3，更佳地，≤1/4。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷性和非治療性的。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟(c)，將步驟(b)篩選或鑒定的潛在治療劑施用于本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型，從而測定其對所述動物模型肥胖癥或其相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度的影響。

本發(fā)明第五方面提供了一種細(xì)胞的用途，所述細(xì)胞中的葡萄糖醛酸C5異構(gòu)酶(Glucuronyl C5-epimerase,Glce)基因失活或下調(diào)，用于制備構(gòu)建非人哺乳動物的肥胖癥或其相關(guān)疾病動物模型的生物制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述生物制劑為液態(tài)制劑。

本發(fā)明第六方面提供了一種Glce基因或其蛋白的失活劑的用途，用于制備構(gòu)建非人哺乳動物的肥胖癥或其相關(guān)疾病動物模型的制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述失活劑包括抑制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述失活劑選自下組：抗體、小分子化合物、核酸、或其組合。

本發(fā)明第七方面提供了一種非人哺乳動物模型，用本發(fā)明第一方面所述方法制備。

在另一優(yōu)選例中，對于Glce基因失活而言，所述的非人哺乳動物模型是雜合的或純合的。

在另一優(yōu)選例中，所述的Glce基因失活是神經(jīng)元特異性的Glce基因失活。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了Glce基因突變序列設(shè)計策略。

圖2顯示了Glce基因剔除打靶載體質(zhì)粒圖譜。

圖3顯示了Glce基因剔除打靶載體質(zhì)粒DNA的酶切鑒定結(jié)果。

圖4顯示了ES克隆基因組DNA的5’端PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

圖5顯示了ES克隆基因組DNA的3’端PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

圖6顯示了Glce轉(zhuǎn)基因小鼠(Loxp/+)序列突變位點(diǎn)PCR結(jié)果。

圖7顯示了Glce突變純合子(Loxp/Loxp Cre)、突變雜合子(Loxp/+Cre)和Wild type(+/+Cre)的序列突變位點(diǎn)PCR結(jié)果。

圖8顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的形態(tài)對比。其中，左圖：上為C57雌性小鼠，下為Glce突變純合子雌性小鼠；右圖：上為C57雄性小鼠，下為Glce突變純合子雄性小鼠。

圖9顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的體重對比情況。

圖10顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的體脂濕重對比情況。

圖11顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重對比情況。

圖12顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重對比情況。

圖13顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重對比情況。

圖14顯示了Glce突變純合子小鼠與C57小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重對比情況。

圖15顯示了Glce突變純合子小鼠的自發(fā)活動路程、時間及速度。

圖16顯示了Glce突變純合子小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的活動總路程、時間及速度。

圖17顯示了Glce突變純合子小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域的活動路程、時間及速度。

圖18顯示了Glce突變純合子小鼠在曠場周邊區(qū)域的活動路程、時間及速度。

圖19顯示了Glce突變純合子小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時間。

圖20顯示了中風(fēng)行為學(xué)評價實(shí)驗(yàn)。

圖21顯示了TTC染色檢測中風(fēng)小鼠腦組織梗塞情況。

圖22顯示了Glce突變純合子小鼠的自發(fā)活動路程、時間及速度。

圖23顯示了Glce突變純合子小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域的活動路程、時間及速度。

圖24顯示了Glce突變純合子小鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中分別探究開放臂、中央?yún)^(qū)域和封閉臂的時間。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，建立了一種遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定的肥胖癥模型，它是Glce基因被剔除或失活的小鼠或其他非人哺乳動物。本發(fā)明的動物模型是一種有效的肥胖癥或其相關(guān)疾病動物模型，可用于研究肥胖相關(guān)疾病(如高血脂)，并可以用于特定藥物的篩選和測試試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

此外，本發(fā)明還意外地發(fā)現(xiàn)，剔除或失活Glce基因所得到的動物模型還可以同時用于研究中風(fēng)、抑郁、焦慮等疾病。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

Glce基因

硫酸乙酰肝素是在細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中廣泛存在的一種多糖，作為一個帶負(fù)電的線性大分子，許多細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子和白介素能與之特異性地結(jié)合，進(jìn)而在胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、炎癥反應(yīng)、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移和病毒侵染等生理過程中發(fā)揮作用¹。

葡萄糖醛酸C5異構(gòu)酶(Glce)是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖糖鏈合成過程中的一個關(guān)鍵酶，它能將糖鏈中的D-葡萄糖醛酸異構(gòu)為L-艾杜糖醛酸²，大大提高了硫酸乙酰肝素的復(fù)雜度，并為糖鏈提供了更多的柔性，L-艾杜糖醛酸是硫酸乙酰肝素識別眾多蛋白分子的一個必不可缺的位點(diǎn)³。

在對21例正常乳腺組織和74例乳腺腫瘤組織的研究發(fā)現(xiàn)，82％-84％的人乳腺腫瘤組織中Glce在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)是顯著下調(diào)或者完全喪失的⁴。此外，在乳腺癌和肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)Glce能抑制小細(xì)胞肺癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖，這提示我們Glce可能是一個潛在的抑癌基因^5,6。

Glce基因位于小鼠基因組9號染色體上，全長618(EnsemblGene ID:ENSMUSG00000032252，Genebank登錄號:93683)。Glce基因組序列包括4個內(nèi)含子和5個外顯子，Glce基因表達(dá)蛋白有3個轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本1具有3個外顯子、2個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本2具有5個外顯子、4個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本3具有2個外顯子、1個內(nèi)含子。這些序列信息可參見文獻(xiàn)或EnsemblGene、Genebank等公共數(shù)據(jù)庫。

人類等其他物種的Glce基因也可參見文獻(xiàn)或EnsemblGene、Genebank等公共數(shù)據(jù)庫。

應(yīng)理解，術(shù)語“Glce”還包括各種天然存在的Glce基因的變異形式。代表性的例子包括：因密碼子的簡并性而編碼與野生型相同的Glce蛋白的核苷酸序列，編碼野生型Glce蛋白的保守性變異多肽的核苷酸序列。此外，對于小鼠之外的其他哺乳動物時，該術(shù)語指Glce基因在該哺乳動物中的同系物。例如對于人而言，該術(shù)語指人的Glce(已知小鼠Glce基因與人類Glce基因的cDNA同源度為91.4％，氨基酸序列的同源度為97.4％)。

Glce基因或其蛋白的失活劑

在本發(fā)明中，所述Glce的失活劑包括全部失活或部分失活。

本發(fā)明的Glce蛋白的失活劑包括(a)抑制劑，所述抑制劑的例子包括(但并不限于)：小分子化合物、抗體、反義核酸、miRNA、siRNA、或其組合；(b)Glce基因的敲除劑。

肥胖癥或其相關(guān)疾病

肥胖癥是一組常見的、古老的代謝癥群。當(dāng)人體進(jìn)食熱量多于消耗熱量時，多余熱量以脂肪形式儲存于體內(nèi)，其量超過正常生理需要量，且達(dá)一定值時遂演變?yōu)榉逝职Y。正常男性成人脂肪組織重量約占體重的15-18％，女性約占20-25％。隨年齡增長，體脂所占比例相應(yīng)增加。因體脂增加使體重超過標(biāo)準(zhǔn)體重20％或體重指數(shù)(BMI＝體重(Kg)/(身高)²(m²))大于24者稱為肥胖癥。如無明顯病因可尋者稱單純性肥胖癥，具有明確病因者稱為繼發(fā)性肥胖癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計它是人類目前面臨的最容易被忽視、但發(fā)病率卻在急劇上升的一種疾病。

據(jù)統(tǒng)計肥胖者并發(fā)腦栓塞與心衰的發(fā)病率比正常體重者高1倍，患冠心病比正常體重者多2倍，高血壓發(fā)病率比正常體重者多2-6倍，合并糖尿病者較正常體重者約高4倍，合并膽石癥者較正常體重者高4-6倍，更為嚴(yán)重的是肥胖者的壽命將明顯縮短。據(jù)報道超重10％的45歲男性，其壽命比正常體重者要縮短4年，據(jù)日本統(tǒng)計資料表明標(biāo)準(zhǔn)死亡率為100％，肥胖者死亡率為127.9％。

在本發(fā)明中，肥胖癥或其相關(guān)疾病包括(但不限于)：肥胖癥、高血脂、高血壓和/或糖尿病。

基因失活

對于功能未知基因的研究可采用許多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遺傳修飾的表型變化，進(jìn)而獲得該基因的功能信息。這一研究方法的另一優(yōu)點(diǎn)是可以將基因功能和疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)，從而在獲得基因功能的同時也能獲得該基因作為潛在藥物或者藥物靶點(diǎn)所能治療的疾病信息和疾病動物模型?；蚴Щ畹姆椒赏ㄟ^基因剔除、基因中斷或基因插入的方式來完成。其中，基因剔除技術(shù)是研究人類基因在整體中的功能的非常強(qiáng)有力的手段。

動物模型

在本發(fā)明中，提供了一種非常有效的肥胖癥或其相關(guān)疾病的非人哺乳動物模型。

在本發(fā)明中，非人哺乳動物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。

如本文所用，術(shù)語“Glce基因失活”包括一個或兩個Glce基因被失活的情況，即包括Glce基因雜合地和純合地失活。例如，Glce基因失活的小鼠可以是雜合或純合的小鼠。

在本發(fā)明中，可基因剔除或轉(zhuǎn)入外源基因(或片段)而使Glce基因失活等方法制備Glce基因失活的非人哺乳動物(如小鼠)。在本領(lǐng)域中，通過基因剔除或轉(zhuǎn)入外源基因而使靶基因失活的技術(shù)是已知的，這些常規(guī)技術(shù)都可用于本發(fā)明。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，Glce基因的失活是通過基因剔除實(shí)現(xiàn)的。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，Glce基因的失活是通過Glce基因中插入外源基因(或片段)而實(shí)現(xiàn)的。

在本發(fā)明的一具體實(shí)例中，可構(gòu)建一含有外源插入片段的構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有與靶基因(Glce)的插入位點(diǎn)的兩側(cè)的側(cè)翼序列同源的同源臂，從而可以通過同源重組高頻地將外源插入片段(或基因)插入至Glce基因組序列(尤其是外顯子區(qū)域)，造成小鼠Glce基因的移碼、提前終止、或敲除，從而導(dǎo)致Glce缺失或失活。

用本發(fā)明方法獲得的純合或雜合的小鼠可育，發(fā)育正常。失活的Glce基因可以孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。

在一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種缺失Glce基因的純合小鼠模型動物。

候選藥物或治療劑

在本發(fā)明中，還提供了一種利用本發(fā)明的動物模型，篩選治療肥胖癥或其相關(guān)疾病的候選藥物或治療劑的方法。

在本發(fā)明中，候選藥物或治療劑是指已知具有某種藥理學(xué)活性或正在被檢測的可能具有某種藥理學(xué)活性的物質(zhì)，包括但不限于核酸、蛋白、化學(xué)合成的小分子或大分子化合物、細(xì)胞等。候選藥物或治療劑的給藥方式可以是口服、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、椎管給藥或直接腦內(nèi)注射。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(1)本發(fā)明可以較好地模擬臨床上原發(fā)性的肥胖癥。

(2)個體之間不存在手術(shù)操作或者藥物劑量導(dǎo)致的差異，其遺傳背景高度一致。

(3)可以作為研究肥胖癥的發(fā)病機(jī)理和新藥篩選的有力工具。

(4)本發(fā)明肥胖癥模型的遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定。

(5)用本發(fā)明方法獲得的純合或雜合的動物模型可育，發(fā)育正常。轉(zhuǎn)基因雜合雄性小鼠具有生殖能力，失活的Glce基因可以孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。

(6)本發(fā)明的肥胖癥或其相關(guān)疾病動物模型表現(xiàn)出肥胖、高血脂、高血壓等癥狀，因此可以廣泛用于肥胖相關(guān)疾病的藥物篩選和測試。

(7)本發(fā)明首次揭示了剔除或失活Glce基因所得到的動物模型還可以同時用于研究中風(fēng)、抑郁、焦慮等疾病。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

如無特別說明，實(shí)施例所用的材料均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1獲得攜帶Cre重組酶的Glce基因突變純合子小鼠

首先構(gòu)建Glce突變基因序列(圖1)。如圖1所示設(shè)計Glce基因剔除打靶載體序列，將Loxp/Loxp等位基因插入到Glce基因3號外顯子兩側(cè)，在3’端插入neo基因，5’端臂3125bp，3’端臂3718bp。圖2為Glce基因剔除打靶載體質(zhì)粒圖譜。1.獲得目的基因(Glce)的同源片段，將此DNA片段克隆到質(zhì)粒載體中；2.從重組質(zhì)粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端；3.將neo基因克隆到帶有目的基因同源順序的線性質(zhì)粒中，使之位于殘留目的基因同源順序的中間；4.在目的基因同源順序的外側(cè)線性化重組質(zhì)粒載體，將hsv－tk基因克隆到此線性載體中。

基因位點(diǎn)如下表所示：

注：基因位置標(biāo)注號根據(jù)“10kb Up and Down of Glce gene”。

圖3為Glce基因剔除打靶載體質(zhì)粒DNA的酶切鑒定，使用1Kb DNA ladder。對打靶載體進(jìn)行線性化：100μg Glce-CKO質(zhì)粒DNA(購自Biovector NTCC)用NotI(酶用量：150U)線性化，酶切體系為150μl，37℃消化過夜，等體積酚氯仿、氯仿處理后，無水乙醇沉淀，100μl無菌PBS重懸備用。ES細(xì)胞打靶：ES細(xì)胞SCR012來源于129S_V/E_V品系雄性小鼠(購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心)的胚胎干細(xì)胞，線性化DNA量：35μg，電轉(zhuǎn)儀型號：Bio－Rad Gene Pulser(Cat.No.165-2105)，電穿孔條件：電壓240v，電容500μF,實(shí)際通電時間10.5ms，實(shí)際電壓256v，克隆篩選條件：300μg/ml G418和2μM GanC篩選8天。挑取抗性克隆和提供DNA樣本共96份。

陽性ES細(xì)胞基因組鑒定方法：

1.5’arm PCR鑒定

P1引物位于5’arm外，P2引物位于neo重組區(qū)域，距離臂外引物8.2kb。

P1和P2引物序列:

P1:GGCATTTGCACTCACATACACAACCCA(gene site:15824-15850)(SEQ ID NO.:1)

P2:GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC(SEQ ID NO.:2)

PCR反應(yīng)體系(ul)：

PCR反應(yīng)條件：

PCR儀：Eppendorf AG 22331Hamburg

試劑：TaKaRa La Taq寶生物工程(大連)有限公司(Cat:DRR002B)

分子量Marker:MBI GeneRuler 1kb DNA Ladder(晶美生物，Cat：SM0311)

2.3’arm PCR鑒定

P4引物位于3’arm外，P3引物位于neo重組區(qū)域，距離臂外引物4.7kb。

P4和P3引物序列:

P4:GAGAGGCTTGGAGGCGGTGCTGATCTT(gene site:29603-29629)(SEQ ID NO.:3)

P3:GATATACTATGCCGATGATTAATTGTC(SEQ ID NO.:4)

PCR反應(yīng)體系(ul)：

PCR反應(yīng)條件：

PCR儀：Eppendorf AG 22331Hamburg

試劑：TaKaRa La Taq寶生物工程(大連)有限公司(Cat:DRR002B)

分子量Marker:MBI GeneRuler 1kb DNA Ladder(晶美生物，Cat：SM0311)

ES細(xì)胞克隆鑒定結(jié)果PCR鑒定藥物抗性ES細(xì)胞克隆96個，其中19個ES克隆發(fā)生雙臂同源重組。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)。圖4顯示了ES克隆基因組DNA的5’端PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖5顯示了ES克隆基因組DNA的3’端PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

陽性ES克隆囊胚注射：

顯微注射用囊胚來源：C57BL/6J小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)超數(shù)排卵,自然受孕體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段。注射60枚胚胎，注射后移植入3只假孕小鼠受體子宮，受體為C57BL/6J(♂)與CBA(♀)(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)的雜交一代。從出生的小鼠中挑選嵌合率大于50％的小鼠飼養(yǎng)至成年，與C57BL/6J雌性小鼠進(jìn)行交配，后代灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(鑒定策略同上)，結(jié)果如圖6所示，獲得雙臂陽性F1代小鼠(Loxp/+)。

將F1代小鼠飼養(yǎng)至成年，與NSE-Cre工具鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)雜交，獲得F2代Loxp/+Cre小鼠。將F2代小鼠飼養(yǎng)至成年，F(xiàn)2代內(nèi)雌雄相互交配，按照孟德爾規(guī)律遺傳，獲得F3代突變純合子(Loxp/Loxp Cre)：突變雜合子(Loxp/+Cre)：Wild type(+/+Cre)的比例約為1：2：1。經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(鑒定策略同上)，結(jié)果如圖7所示。將突變純合子小鼠(Loxp/Loxp Cre)用于后續(xù)動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2Glce突變純合子小鼠的形態(tài)學(xué)分析

Glce突變純合子小鼠的出生比例符合孟德爾定律，通過檢測小鼠的體重，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce神經(jīng)特異敲除小鼠的形態(tài)更加肥胖。

實(shí)施例3Glce突變純合子小鼠的體重分析

將Glce突變純合子小鼠置于電子天平上稱重，研究成年Glce突變純合子小鼠與成年C57BL/6正常小鼠的體重差異。

研究發(fā)現(xiàn)(圖9)，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠肥胖癥狀的發(fā)生率更高，并且體重與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

結(jié)果顯示，以超過成年C57BL/6正常小鼠體重平均值的20％以上的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為是肥胖，雌性成年C57BL/6正常小鼠的體重平均為28.7g，雌性成年Glce突變純合子小鼠的體重平均為34.6g，雌性成年Glce突變純合子小鼠肥胖癥狀的發(fā)生率約為50％，與雌性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；雄性成年C57BL/6正常小鼠的體重平均為32.2g，雄性成年Glce突變純合子小鼠的體重平均為39.5g，雄性成年Glce突變純合子小鼠肥胖癥狀的發(fā)生率約為66％，與雄性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；成年C57BL/6正常小鼠(包含雌雄)的體重平均為30.7g，成年Glce突變純合子小鼠(包含雌雄)的體重平均為37.8g，成年Glce突變純合子小鼠肥胖癥狀的發(fā)生率總計約為60％，與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)。

上述結(jié)果充分表明，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠肥胖癥狀的發(fā)生率更高。

實(shí)施例4Glce突變純合子小鼠的體脂分析

將Glce突變純合子小鼠解剖后取脂肪組織包括雙側(cè)性腺周圍脂肪組織、雙側(cè)腎周脂肪組織、雙側(cè)腹股溝脂肪組織置于電子天平上稱重，研究成年Glce突變純合子小鼠與成年C57BL/6正常小鼠的脂肪組織濕重差異。

研究發(fā)現(xiàn)(圖10)，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的體脂濕重增加，具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

結(jié)果顯示，雌性成年C57BL/6正常小鼠的體脂濕重平均為0.94g，雌性成年Glce突變純合子小鼠的體脂濕重平均為8.50g，與雌性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；雄性成年C57BL/6正常小鼠的體脂濕重平均為2.98g，雄性成年Glce突變純合子小鼠的體脂濕重平均為7.52g，與雄性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；成年C57BL/6正常小鼠(包含雌雄)的體脂濕重平均為2.21g，成年Glce突變純合子小鼠(包含雌雄)的體脂濕重平均為8.01g，與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)。

上述結(jié)果充分表明，成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的體脂濕重增加。

實(shí)施例5Glce突變純合子小鼠的脂肪組織分析

5.1Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織分析

將Glce突變純合子小鼠解剖后取雙側(cè)性腺周圍脂肪組織置于電子天平上稱重，研究成年Glce突變純合子小鼠與成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重差異。

與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重顯著增加(圖11)。

結(jié)果顯示，雌性成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重平均為0.54g，雌性成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重平均為3.10g，與雌性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；雄性成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重平均為1.66g，雄性成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重平均為2.85g，與雄性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；成年C57BL/6正常小鼠(包含雌雄)的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重平均為1.24g，成年Glce突變純合子小鼠(包含雌雄)的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重平均為2.98g，與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)。

上述結(jié)果充分表明，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重顯著增加。

5.2Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織分析

將Glce突變純合子小鼠解剖后取雙側(cè)腎周脂肪組織置于電子天平上稱重，研究成年Glce突變純合子小鼠與成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重差異。

與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重顯著增加(圖12)。

結(jié)果顯示，雌性成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重平均為0.36g，雌性成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重平均為2.06g，與雌性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；雄性成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重平均為1.18g，雄性成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重平均為1.61g，與雄性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；成年C57BL/6正常小鼠(包含雌雄)的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重平均為0.87g，成年Glce突變純合子小鼠(包含雌雄)的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重平均為1.83g，與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)。

上述結(jié)果充分表明，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腎周脂肪組織濕重顯著增加。

5.3Glce突變純合子小鼠的內(nèi)臟脂肪組織分析

將Glce突變純合子小鼠解剖后取雙側(cè)性腺周圍脂肪組織和雙側(cè)腎周脂肪組織置于電子天平上稱重，內(nèi)臟脂肪組織濕重總重為雙側(cè)性腺周圍脂肪組織和雙側(cè)腎周脂肪組織濕重之和，研究成年Glce突變純合子小鼠與成年C57BL/6正常小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重差異。

與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重顯著增加(圖13)。

結(jié)果顯示，雌性成年C57BL/6正常小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重平均為0.90g，雌性成年Glce突變純合子小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重平均為5.16g，與雌性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；雄性成年C57BL/6正常小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重平均為2.84g，雄性成年Glce突變純合子小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重平均為4.45g，與雄性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；成年C57BL/6正常小鼠(包含雌雄)的內(nèi)臟脂肪組織濕重平均為2.11g，成年Glce突變純合子小鼠(包含雌雄)的內(nèi)臟脂肪組織濕重平均為4.81g，與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)。

上述結(jié)果充分表明，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的內(nèi)臟脂肪組織濕重顯著增加。

5.4Glce突變純合子小鼠的內(nèi)皮下脂肪組織(如雙側(cè)腹股溝脂肪組織)分析

將Glce突變純合子小鼠解剖后取雙側(cè)腹股溝脂肪組織置于電子天平上稱重，皮下脂肪組織濕重為雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重之和，研究成年Glce突變純合子小鼠與成年C57BL/6正常小鼠的皮下脂肪組織濕重差異。

與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織(代表皮下脂肪組織)濕重顯著增加(圖14)。

結(jié)果顯示，雌性成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重平均為0.04g，雌性成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重平均為3.34g，與雌性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；雄性成年C57BL/6正常小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重平均為0.13g，雄性成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重平均為3.07g，與雄性成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)；成年C57BL/6正常小鼠(包含雌雄)的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重平均為0.10g，成年Glce突變純合子小鼠(包含雌雄)的雙側(cè)腹股溝脂肪組織濕重平均為3.20g，與成年C57BL/6正常小鼠相比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.01)。

上述結(jié)果充分表明，與成年C57BL/6正常小鼠相比較，成年Glce突變純合子小鼠的雙側(cè)腹股溝脂肪組織(代表皮下脂肪組織)濕重顯著增加。

實(shí)施例6Glce突變純合子小鼠的抑郁行為學(xué)分析

6.1自主活動

將攜帶Cre重組酶的Glce基因突變純合子小鼠放置于黑暗實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)(110mm X 110mm X 330mm)，測試小鼠的自發(fā)活動5min。通過紅外攝像拍攝小鼠的活動情況。使用上海吉量軟件科技有限公司的視頻跟蹤軟件和分析軟件對小鼠活動軌跡以及活動時間進(jìn)行分析。

研究顯示，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠的自發(fā)活動的總路程、活動時間以及活動速度并沒有顯著差異(圖15)。

結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠天生的習(xí)性與C57BL/6正常小鼠相比較并沒有顯著差異。

6.2曠場實(shí)驗(yàn)

將小鼠放置于明亮空曠實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)(500mm X 500mm X 590mm)，測試小鼠的探索活動5min。通過紅外攝像拍攝小鼠的活動情況。使用上海吉量軟件科技有限公司的視頻跟蹤軟件和分析軟件對小鼠活動軌跡以及活動時間進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中活動的總路程、活動時間以及活動速度均顯著減小(圖16)。結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠與C57BL/6正常小鼠相比較活動顯著減少。

與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域活動的路程、活動時間以及活動速度均顯著減小(圖17)，結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠與C57BL/6正常小鼠相比較探索新異環(huán)境的活動顯著減少。

與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠在曠場周邊區(qū)域活動的路程、活動時間以及活動速度均顯著減小(圖18)，結(jié)果表明青年期Glce突變純合子小鼠與C57BL/6正常小鼠相比較活動顯著減少。

總的來說，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠的活動顯著減少，并且探索新異環(huán)境的活動顯著減少，表明青年期Glce突變純合子小鼠有一定程度的抑郁。

6.3強(qiáng)迫游泳

將小鼠放置于直徑12cm、高度25cm的水缸中(水溫21-22℃)，小鼠被強(qiáng)迫在水溫較低的水中游泳，測試小鼠的活動6min，記錄小鼠在后4min中的不動時間。通過攝像拍攝小鼠的活動情況。對小鼠活動時間進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時間顯著增加(圖19)。

結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠與C57BL/6正常小鼠相比較有一定程度的抑郁。

實(shí)施例7Glce突變純合子小鼠的中風(fēng)行為學(xué)分析

將帶Cre重組酶的Glce基因突變純合子小鼠置于清潔飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)。該小鼠動物模型在進(jìn)入老年期(約1.5年)發(fā)生中風(fēng)樣癥狀。通過一系列中風(fēng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評價小鼠動物模型的中風(fēng)樣癥狀及嚴(yán)重程度，實(shí)驗(yàn)方法參考2001年發(fā)表于Stroke上的評價大鼠中風(fēng)癥狀嚴(yán)重程度的一系列系統(tǒng)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(Chen J,et al.Stroke.2001)，包括運(yùn)動測試、感覺測試、平衡能力測試、本體的反射測試、異常的活動能力測試等，具體為平放測試、提尾測試、視覺觸覺測試、本體覺測試、平衡木測試、耳廓反射、瞼閉反射、驚跳反射、抽搐、痙攣、肌張力障礙等行為測試，對小鼠的行為進(jìn)行評分。

Glce基因突變純合子小鼠組40只有10只在老年時期發(fā)生中風(fēng)，中風(fēng)發(fā)生率為25％；對照組C57BL/6小鼠組40只小鼠有2只在老年時期發(fā)生中風(fēng)，中風(fēng)發(fā)生率為5％，結(jié)果表明，Glce基因突變純合子小鼠與C57BL/6小鼠相比較更易發(fā)生中風(fēng)。

7.1運(yùn)動測試。

(1)平放測試：將小鼠放置于平地上，觀察小鼠是否能夠正常行走，正常行走得分0分；是否能夠直行，不能直行得分1分，否則得分0分；是否圍繞損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈，圍繞損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈得分1分，否則得分0分；是否向損傷側(cè)傾倒，向損傷側(cè)傾倒得分1分，否則得分0分。

(2)提尾測試：提起小鼠的尾巴，觀察小鼠肢體活動的情況，是否前肢向內(nèi)彎曲、爪子抓緊，若小鼠前肢向內(nèi)彎曲、爪子抓緊得分1分，否則得分0分；是否后肢向內(nèi)彎曲、爪子抓緊，若小鼠后肢向內(nèi)彎曲、爪子抓緊得分1分，否則得分0分；是否30秒內(nèi)頭部抬起、與垂直軸角度大于10度，若小鼠30秒內(nèi)頭部抬起、與垂直軸角度大于10度得分1分，否則得分0分。

7.2感覺測試。

(1)視覺觸覺測試：把握住小鼠身體，讓小鼠前肢能夠自由活動，使小鼠面向臺子邊緣或者籠子邊緣，將小鼠快速靠近臺子邊緣或者籠子邊緣，觀察小鼠前肢是否能夠快速向前伸、并且及時張開爪子準(zhǔn)確抓住臺子邊緣或者籠子邊緣。若小鼠前肢不能快速向前伸、并且及時張開爪子準(zhǔn)確抓住臺子邊緣或者籠子邊緣得分1分，否則得分0分。

(2)本體覺測試：把握住小鼠身體，讓小鼠后肢能夠自由活動，將小鼠前肢放置于臺子邊緣或者籠子邊緣、后肢懸空，使用鑷子夾小鼠后肢大腿肌肉，觀察小鼠后肢是否能夠快速回縮。若小鼠后肢不能快速回縮得分1分，否則得分0分。

7.3平衡能力測試。

將小鼠放置于平衡木一端，觀察小鼠在平衡木上自由活動的情況，主要包括以下7種情況：(1)是否能夠保持身體平衡、在平衡木上自由行走，若小鼠能夠保持身體平衡、在平衡木上自由行走得分0分。

(2)是否抓住平衡木邊緣，若小鼠抓住平衡木邊緣得分1分。

(3)抱住平衡木，但是有一后肢掉落，若小鼠抱住平衡木，但是有一后肢掉落得分2分。

(4)抱住平衡木，但是有兩后肢掉落，或者在平衡木上旋轉(zhuǎn)，并且在平衡木上的時間大于60秒，若小鼠抱住平衡木，但是有兩后肢掉落，或者在平衡木上旋轉(zhuǎn)，并且在平衡木上的時間大于60秒得分3分。

(5)嘗試在平衡木上保持平衡但是最終掉落，在平衡木上的時間大于40秒，若小鼠嘗試在平衡木上保持平衡但是最終掉落，在平衡木上的時間大于40秒得分4分。

(6)嘗試在平衡木上保持平衡但是最終掉落，在平衡木上的時間大于20秒，若小鼠嘗試在平衡木上保持平衡但是最終掉落，在平衡木上的時間大于20秒得分5分。

(7)沒有嘗試在平衡木上保持平衡或者抱緊平衡木的欲望，在平衡木上的時間小于20秒掉落，若小鼠沒有嘗試在平衡木上保持平衡或者抱緊平衡木的欲望，在平衡木上的時間小于20秒掉落得分6分。

7.4本體的反射測試及異常的活動能力測試。

(1)耳廓反射：使用棉簽刺激小鼠耳道，觀察小鼠是否有甩頭反應(yīng)，若有說明小鼠具有耳廓反射，若無說明小鼠沒有耳廓反射、得分1分。

(2)瞼閉反射：使用棉簽刺激小鼠虹膜，觀察小鼠是否有閉上眼瞼的反應(yīng)，若有說明小鼠具有瞼閉反射，若無說明小鼠沒有瞼閉反射、得分1分。

(3)驚跳反射：制造一個大的噪聲，比如水瓶掉落，觀察小鼠是否有受驚嚇跳起來的反應(yīng)，若有說明小鼠具有驚跳反射，若無說明小鼠沒有驚跳反射、得分1分。

(4)觀察小鼠是否出現(xiàn)抽搐、痙攣、肌張力障礙等現(xiàn)象。若小鼠出現(xiàn)抽搐、痙攣、肌張力障礙等現(xiàn)象，得分1分。

計算每一項(xiàng)相加的總得分，總得分1-6分為輕度損傷，總得分7-12分為中度損傷，總得分13-18分為重度損傷。

例如，圖20中的小鼠在平放測試中不能直行得分1分，圍繞損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈得分1分，向損傷側(cè)傾倒得分1分；在提尾測試中前肢向內(nèi)彎曲、爪子抓緊得分1分，后肢向內(nèi)彎曲、爪子抓緊得分1分，30秒內(nèi)頭部抬起、與垂直軸角度大于10度得分1分；在視覺觸覺測試中前肢能快速向前伸、并且及時張開爪子準(zhǔn)確抓住臺子邊緣或者籠子邊緣得分0分；在本體覺測試中后肢能快速回縮得分0分；在平衡木測試中小鼠嘗試在平衡木上保持平衡但是最終掉落，在平衡木上的時間大于40秒得分4分；小鼠具有耳廓反射得分0分；具有瞼閉反射得分0分；具有驚跳反射得分0分；小鼠出現(xiàn)抽搐得分1分。該小鼠的總得分為：1+1+1+1+1+1+0+0+4+0+0+0+1＝11分，評價為中度中風(fēng)。

實(shí)施例8Glce突變純合子小鼠的腦組織梗塞分析

通過TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)染色方法檢測中風(fēng)小鼠腦組織的梗塞情況。操作步驟是：麻醉后直接取腦，-20度冰箱中速凍5-10分鐘左右，便于切片。切片：每隔1mm切一片。將切片置于TTC中，常規(guī)濃度為2％。用錫箔紙蓋住后，放入37度溫箱15-30min，不時翻動腦片，使腦片均勻接觸到染色液。然后使用4％多聚甲醛固定30min。拍照。

TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，可用來染色檢測哺乳動物組織的缺血梗塞。它是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白。

結(jié)果如圖21所示，結(jié)果顯示，經(jīng)過TTC染色之后，中風(fēng)小鼠的正常腦組織呈紅色，而梗塞的腦組織呈蒼白。觀察到嗅球、前額葉、胼胝體、海馬組織、紋狀體、杏仁核、下丘腦、顳葉、小腦、腦橋、延髓等均有梗塞現(xiàn)象。

實(shí)施例9Glce突變純合子小鼠的焦慮行為學(xué)分析

將攜帶Cre重組酶的Glce基因突變純合子小鼠(以下簡稱Glce突變純合子小鼠)置于清潔飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)。在小鼠青年期(>3月齡)通過一系列動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括自主活動、曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮等實(shí)驗(yàn)評價小鼠動物模型的焦慮癥樣癥狀。

9.1自主活動

將小鼠放置于黑暗實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)(110mm X 110mm X 330mm)，測試小鼠的自發(fā)活動5min。通過紅外攝像拍攝小鼠的活動情況。使用上海吉量軟件科技有限公司的視頻跟蹤軟件和分析軟件對小鼠活動軌跡以及活動時間進(jìn)行分析。

研究發(fā)現(xiàn)，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠的自發(fā)活動的總路程、活動時間以及活動速度并沒有顯著差異(圖22)。

結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠天生的習(xí)性與C57BL/6正常小鼠相比較并沒有顯著差異。

9.2曠場實(shí)驗(yàn)

將小鼠放置于明亮空曠實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)(500mm X 500mm X 590mm)，測試小鼠的探索活動5min。通過紅外攝像拍攝小鼠的活動情況。使用上海吉量軟件科技有限公司的視頻跟蹤軟件和分析軟件對小鼠活動軌跡以及活動時間進(jìn)行分析。

研究發(fā)現(xiàn)，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域活動的路程、活動時間以及活動速度均顯著減小(圖23)。

結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠與C57BL/6正常小鼠相比較探索新異環(huán)境的活動顯著減少，并產(chǎn)生更強(qiáng)烈的焦慮情緒。

9.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

將小鼠放置于開放臂單臂長30cm、寬6cm、封閉臂單臂長30cm、寬6cm、高14.5cm的高架十字迷宮中，離地面高度約50cm，通過攝像拍攝小鼠5min內(nèi)在高架十字迷宮中的活動情況。對小鼠的活動進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與青年期C57BL/6正常小鼠相比較，青年期Glce突變純合子小鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中探究開放臂的時間顯著減少，停留在封閉臂的時間顯著增加，在中央?yún)^(qū)域停留的時間沒有顯著差異(圖24)。

結(jié)果表明，青年期Glce突變純合子小鼠與C57BL/6正常小鼠相比較，焦慮程度明顯增加。雄性青年期Glce突變純合子小鼠與雌性青年期Glce突變純合子小鼠相比較焦慮情緒更明顯。除此之外，產(chǎn)生一定程度焦慮的青年期Glce突變純合子小鼠同時也產(chǎn)生一定程度的抑郁。

實(shí)施例10用治療肥胖或其相關(guān)疾病(如高血脂)的藥物驗(yàn)證藥物篩選平臺

在本實(shí)施例中，給實(shí)施例1構(gòu)建的模型動物小鼠注射當(dāng)前臨床治療肥胖癥或其相關(guān)疾病的藥物西布曲明或山藥多糖，隨即對模型動物小鼠的肥胖嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。

結(jié)果表明，藥物西布曲明或山藥多糖可顯著降低模型動物小鼠的肥胖嚴(yán)重程度，具體地，可顯著降低模型動物小鼠的肥胖癥狀的發(fā)生率、和/或脂肪組織濕重(如雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重、雙側(cè)腎周脂肪組織濕重、內(nèi)臟脂肪組織濕重、和/或皮下脂肪組織濕重)。

實(shí)施例11利用治療肥胖癥或其相關(guān)疾病(如高血脂)藥物篩選平臺篩選候選藥物

在本實(shí)施例中，計劃通過給實(shí)施例1構(gòu)建的模型動物小鼠注射肥胖癥或其相關(guān)疾病的治療藥物，隨即對模型動物小鼠的肥胖嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。

通過與給安慰劑的模型動物小鼠比較肥胖嚴(yán)重程度的差異，能夠顯著降低肥胖癥狀的發(fā)生率、和/或脂肪組織濕重(如雙側(cè)性腺周圍脂肪組織濕重、雙側(cè)腎周脂肪組織濕重、內(nèi)臟脂肪組織濕重、和/或皮下脂肪組織濕重)的候選藥物，即為該肥胖或其相關(guān)疾病的潛在治療藥物。

其它肥胖癥或其相關(guān)疾病也可以參照上述方法，對模型動物小鼠的肥胖嚴(yán)重程度進(jìn)行評估，從而篩選候選藥物。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

參考文獻(xiàn)：

1.Kreuger J,Spillmann D,Li JP,Lindahl U.Interactions between heparan sulfate and proteins:the concept of specificity.The Journal of cell biology2006；174:323-7.

2.Li JP,Gong F,Hagner-McWhirter A,Forsberg E,Abrink M,Kisilevsky R,Zhang X,Lindahl U.Targeted disruption of a murine glucuronyl C5-epimerase gene results in heparan sulfate lacking L-iduronic acid and in neonatal lethality.The Journal of biological chemistry 2003；278:28363-6.

3.Jia J,Maccarana M,Zhang X,Bespalov M,Lindahl U,Li JP.Lack of L-iduronic acid in heparan sulfate affects interaction with growth factors and cell signaling.The Journal of biological chemistry 2009；284:15942-50.

4.Grigorieva E,Eshchenko T,Rykova VI,Chernakov A,Zabarovsky E,Sidorov SV.Decreased expression of human D-glucuronyl C5-epimerase in breast cancer.International Journal of cancer 2008；122:1172-6.

5.Prudnikova TY,Mostovich LA,Domanitskaya NV,Pavlova TV,Kashuba VI,Zabarovsky ER,Grigorieva EV.Antiproliferative effect of D-glucuronyl C5-epimerase in human breast cancer cells.Cancer Cell international 2010；10:27.

6.Grigorieva EV,Prudnikova TY,Domanitskaya NV,Mostovich LA,Pavlova TV,Kashuba VI,Zabarovsky ER.D-glucuronyl C5-epimerase suppresses small-cell lung cancer cell proliferation in vitro and tumour growth in vivo.British Journal of cancer 2011；105:74-82.