序列表

本申請含有已以ascii形式提交且特此以引用的方式整體并入的序列表。2014年12月16日創(chuàng)建的所述ascii拷貝命名為igf-110wo1_sl.txt并且大小為9,921字節(jié)。

發(fā)明背景

肉瘤是來自間充質(zhì)起源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的瘤形成，包括骨肉瘤和軟組織肉瘤。軟組織肉瘤是20歲以下兒童中第五最常見的實(shí)體腫瘤，其中橫紋肌肉瘤是最常見的類型。骨肉瘤是青少年中第三最常見的癌癥，其中兩種最常見類型是骨肉瘤和尤文氏肉瘤。肉瘤也影響成人但頻率較低。

肉瘤表現(xiàn)出多種組織學(xué)類型并且可以在身體的任何地方發(fā)生。目前，治療選擇是外科手術(shù)，其中輔助性放射被選擇性用于高分級、不完全切除的病變。已證明化學(xué)療法具有有限的益處，延遲復(fù)發(fā)的時間但不影響總體存活期。

在化學(xué)療法、外科手術(shù)、以及放射的組合使用方面的進(jìn)展改善了患有局部性疾病的橫紋肌肉瘤患者的存活期。在1975與2002年之間，小于15歲兒童的5年存活率從53％增長至65％，并且15至19歲青少年的存活率從30％增長至47％。然而，在橫紋肌肉瘤患者中，轉(zhuǎn)移性疾病仍然是不良結(jié)果的一個主要預(yù)測因素，并且沒有受到聯(lián)合療法的顯著影響。

對于骨肉瘤患者，用于微轉(zhuǎn)移疾病的當(dāng)前治療選擇包括外科手術(shù)和化學(xué)療法，該微轉(zhuǎn)移疾病存在但大多數(shù)患者在診斷時無法檢測到。盡管放射療法是一種用于軟組織肉瘤的重要治療，但骨肉瘤均是抗放射的。雖然局部性骨肉瘤使用聯(lián)合療法的治愈率在60％-70％范圍內(nèi)，但出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或多病灶疾病的患者預(yù)后不良。骨肉瘤的長期存活率小于25％，具有兒科癌癥最低存活率之一。

因此，用于減少肉瘤細(xì)胞的增殖和存活并且用于治療肉瘤的組合物和方法是迫切需要的。

發(fā)明概述

如以下所描述，本發(fā)明特點(diǎn)是用于治療肉瘤，特別是腫瘤細(xì)胞(例如，由igf-1/-2誘導(dǎo)的)在肉瘤中的增殖的組合物和方法。這些組合物包含一種mtor抑制劑和特異性結(jié)合igf-1和igf-2中的至少一個的一種抗體。

在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于治療肉瘤的藥物組合物，該藥物組合物包含有效量的一種mtor抑制劑和有效量的特異性結(jié)合胰島素樣生長因子1(igf-1)和胰島素樣生長因子2(igf-2)中的至少一個的一種抗體。在一些實(shí)施例中，該藥物組合物中的抗體中和igf-1和igf-2中的至少一個。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該藥物組合物中的抗體包含包括在seqidno:1(sertyraspileasn)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(cdr1)；包括在seqidno:2(trpmetasnproasnserglyasnthrglytyralaginlysphegingly)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(cdr2)；包括在seqidno:3(aspprotyrtyrtyrtyrtyrglymetaspval)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(cdr3)；包括在seqidno:4(serglyserserserasnilegluasnasnhisvalser)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(cdr1)；包括在seqidno:5(aspasnasnlysargproser)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(cdr2)；以及包括在seqidno:6(gluthrtrpaspthrserleuseralaglyargval)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(cdr3)。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物中的抗體包含包括一個選自在seqidno:7和seqidno:8中列出的氨基酸序列的氨基酸序列的一個或多個可變區(qū)。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物中的抗體具有由雜交瘤細(xì)胞系7.159.2(atcc登錄號pta-7424)產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物包含一種選自下組的mtor抑制劑，該組由以下各項組成：azd2014、ink128、azd8055、nvp-bez235、bgt226、sf1126、pki-587、雷帕霉素、坦羅莫司、依維莫司、地磷莫司及其組合。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物中的mtor抑制劑包含雷帕霉素。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物中的mtor抑制劑包含azd2014。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物用于治療選自下組的肉瘤，該組由以下各項組成：尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、阿金氏腫瘤、葡萄狀肉瘤、軟骨肉瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、軟組織肉瘤、軟組織腺泡狀肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、葉狀囊肉瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促纖維增生性小圓細(xì)胞腫瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管內(nèi)皮瘤(hemangiosarcoma)、卡波西氏肉瘤、平滑肌內(nèi)瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、滑膜肉瘤、以及未分化多形性肉瘤。

在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于減少肉瘤細(xì)胞的存活或增殖的方法。該方法包括使至少一個肉瘤細(xì)胞與包含一種mtor抑制劑和特異性結(jié)合igf-1和igf-2中的至少一個的一種抗體的一種藥物組合物接觸；測量與該藥物組合物接觸的肉瘤細(xì)胞的存活或增殖以及未與該藥物組合物接觸的肉瘤細(xì)胞的存活或增殖；將與該藥物組合物接觸的肉瘤細(xì)胞的存活或增殖與未與該藥物組合物接觸的肉瘤細(xì)胞的存活或增殖進(jìn)行比較；其中與未由該藥物組合物處理的肉瘤細(xì)胞的存活或增殖相比，由該藥物組合物處理的肉瘤細(xì)胞的存活或增殖減少。

在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者的肉瘤的方法，該方法包括向受試者給予一種藥物組合物，該藥物組合物包含一種mtor抑制劑和特異性結(jié)合igf-1和igf-2中的至少一個的一種抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，特異性結(jié)合igf-1和igf-2中的至少一個的抗體中和igf-1和igf-2中的至少一個。

在具體實(shí)施例中，用于治療肉瘤的方法的抗體包含包括在seqidno:1(sertyraspileasn)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(cdr1)；包括在seqidno:2(trpmetasnproasnserglyasnthrglytyralaginlysphegingly)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(cdr2)；包括在seqidno:3(aspprotyrtyrtyrtyrtyrglymetaspval)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(cdr3)；包括在seqidno:4(serglyserserserasnilegluasnasnhisvalser)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(cdr1)；包括在seqidno:5(aspasnasnlysargproser)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(cdr2)；以及包括在seqidno:6(gluthrtrpaspthrserleuseralaglyargval)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(cdr3)。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，特異性結(jié)合igf-1和igf-2中的至少一個的抗體包含包括選自在seqidno:7和seqidno:8中列出的氨基酸序列的氨基酸序列的一個或多個可變區(qū)。

在具體實(shí)施例中，用于治療肉瘤的方法的mtor抑制劑為azd2014、ink128、azd8055、nvp-bez235、bgt226、sf1126、pki-587、雷帕霉素、坦羅莫司、依維莫司、以及地磷莫司中的至少一種。

在具體實(shí)施例中，由本發(fā)明方法治療的肉瘤為尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、阿金氏腫瘤、葡萄狀肉瘤、軟骨肉瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、軟組織肉瘤、軟組織腺泡狀肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促纖維增生性小圓細(xì)胞腫瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管內(nèi)皮瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌內(nèi)瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、滑膜肉瘤、以及未分化多形性肉瘤中的一種或多種。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該藥物組合物是以10mg/kg、30mg/kg、或60mg/kg給藥的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明治療肉瘤的方法相對于參考物將受試者的腫瘤生長抑制至少約10％、25％、50％、75％或更多。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明治療肉瘤的方法抑制肉瘤細(xì)胞增殖。

在具體實(shí)施例中，通過靜脈注射或口服給藥來給予本發(fā)明藥物組合物。在具體實(shí)施例中，在本發(fā)明治療方法中，在約1小時至約24小時內(nèi)，或在約1天至約3天內(nèi)同時地給予該抗體和該mtor抑制劑。

在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于治療患有尤文氏肉瘤、骨肉瘤、或橫紋肌肉瘤的受試者的方法。在一個具體實(shí)施例中，該方法包括向受試者給予有效量的medi-573和雷帕霉素。在一個具體實(shí)施例中，該方法包括向受試者給予有效量的medi-573和azd2014。

在一個實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于治療肉瘤的試劑盒。該試劑盒包括有效量的一種mtor抑制劑和一種特異性結(jié)合igf-1和/或gf-2的抗體，以及用于使用該試劑盒來治療肉瘤的說明書。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該試劑盒包括medi-573抗體和雷帕霉素。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該試劑盒包括medi-573抗體和azd2014。

附圖簡要說明

圖1a至圖1d–描繪使用由定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)在來自兒科肉瘤的原發(fā)性腫瘤異種移植物中檢測的mrna水平計算的igf-1、igf-2、igf-1r、以及ira:irb比率的計算δct。圖1a描繪igf-1的計算δct；圖1b描繪igf-2的計算δct；圖1c描繪igf-1r的計算δct；圖1d描繪計算的δctir-a:ir-b比率。

圖2a和圖2b–描繪使用由qrt-pcr在肉瘤細(xì)胞系中檢測的mrna水平計算的igf-1、igf-2、igf-1r、以及ira:irb比率的計算δct。圖2a描繪igf-1、igf-1r、igf-2、以及igf2r的計算δct。圖2b描繪ir-a:ir-b比率的計算δct。

圖3a至圖3c–描繪使用elisa在肉瘤細(xì)胞系中檢測的igf-1、igf-2、以及igf-1r蛋白質(zhì)水平的。圖3a描繪igf-1的水平；圖3b描繪igf-2的水平；以及圖3c描繪igf-1r的水平。

圖4a至圖4f-描繪medi-573對于自分泌驅(qū)動肉瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞活力的影響。圖4a描繪rd-es細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖4b描繪tc-71細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖4c描繪sjcrh30細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖4d描繪sk-es-1細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖4e描繪sjs1細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖4f描繪rd細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖5a至圖5f-描繪medi-573治療對于igf誘導(dǎo)的尤文氏肉瘤細(xì)胞系的生長和增殖的影響。圖5a描繪igf-1刺激的rd-es細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖5b描繪igf-2刺激的rd-es細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖5c描繪igf-1刺激的sk-es-1細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖5d描繪igf-2刺激的sk-es-1細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖5e描繪igf-1刺激的tc-71細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖5f描繪igf-2刺激的tc-71細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖6a至圖6d-描繪medi-573治療對于igf誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞系的生長和增殖的影響。圖6a描繪igf-1刺激的saos2細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖6b描繪igf-2刺激的saos2細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖6c描繪igf-1刺激的mg-63細(xì)胞的細(xì)胞活力；圖6d描繪igf-2刺激的mg-63細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖7a至圖7c-描繪medi-573在具有自分泌igf-1和igf-2信號傳導(dǎo)的肉瘤異種移植物模型中的效力。圖7a描繪rd-es細(xì)胞中的腫瘤體積；圖7b描繪sjsa-1細(xì)胞中的腫瘤體積；圖7c描繪khos/np細(xì)胞中的腫瘤體積。

圖8a至圖8c–描繪向具有higf-1或higf-2誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)的肉瘤異種移植物模型添加不同量的medi-573的影響。圖8a描繪rd-es細(xì)胞中的higf-1水平；圖8b描繪sjsa-1細(xì)胞中的higf-2水平；圖8c描繪khos/np細(xì)胞中的higf-2水平。

圖9a至圖9c–描繪添加medi-573對于igf-1r、ir-a、以及akt在rd-es、sk-es-1、tc-71、以及khos細(xì)胞中的自身磷酸化作用的影響。在每個圖中，第一個條表示表示來自未處理對照的結(jié)果；第二個條表示來自向培養(yǎng)物中添加同種型對照的結(jié)果；并且第三個條表示用medi-573處理細(xì)胞的結(jié)果。圖9a描繪pigf-1r的水平；圖9b描繪p1r-a的水平；圖9c描繪pakt的水平。

圖10a至圖10c–描繪體外添加medi-573對于igf-1和/或igf-2誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的影響。圖10a描繪pigf-1r的水平；圖10b描繪p1r-a的水平；圖10c描繪pakt的水平。

圖11–描繪示出從帶有～400mm³rd-es腫瘤的小鼠組織獲得的pakt和磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子4e-結(jié)合蛋白1(p4ebp1)的磷酸化水平的免疫印跡。左邊三個條帶，未添加medi-573；右邊三個條帶，添加了medi-573。

圖12a至圖12d–描繪示出在用medi-573治療之前和之后rd-es腫瘤和血漿中的higf-1和higf-2水平的圖。

圖13-描繪示出在未治療小鼠、用igf-1孵育的小鼠、用igf-2孵育的小鼠、用igf-1孵育并用medi-573治療的小鼠、以及用igf-2孵育并用medi-573治療的小鼠中的pakt、p4ebp1、以及ps6k磷酸化水平的免疫印跡。在每個組中示出來自三種不同小鼠的樣品。

圖14–描繪用medi-573和一種mtor抑制劑(雷帕霉素或azd2014)單獨(dú)或彼此組合處理的rd-es細(xì)胞的生長和增殖。

圖15-描繪示出在未治療細(xì)胞、用medi-573單獨(dú)治療的細(xì)胞、用雷帕霉素單獨(dú)治療的細(xì)胞、用雷帕霉素與medi-573組合治療的細(xì)胞、用azd2014單獨(dú)治療的細(xì)胞、以及用medi-573與azd2014組合治療的細(xì)胞中的pakt、p4ebp1、以及ps6k磷酸化水平的免疫印跡。

圖16a至圖16b-描繪在用azd2014、medi-573、medi-573與azd2014組合、以及對照物治療的rd-es腫瘤異種移植物中的肉瘤細(xì)胞的生長和增殖。圖16a是細(xì)胞的生長和增殖；圖16b是經(jīng)治療小鼠的體重。

圖17a至圖17b-描繪在用雷帕霉素、medi-573、雷帕霉素與medi-573組合、以及對照物治療的rd-es腫瘤異種移植物中的肉瘤細(xì)胞的生長和增殖。圖17a是細(xì)胞的生長和增殖；圖17b是經(jīng)治療小鼠的體重。

序列表簡述

seqidno：1描繪medi-573重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1的氨基酸序列(sertyraspileasn)。

seqidno：2描繪medi-573重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2的氨基酸序列(trpmetasnproasnserglyasnthrglytyralaginlyspheglngly)。

seqidno：3描繪medi-573重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的氨基酸序列(aspprotyrtyrtyrtyrtyrglymetaspval)。

seqidno：4描繪medi-573輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1的氨基酸序列(serglyserserserasnilegluasnasnhisvalser)。

seqidno：5描繪medi-573輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2的氨基酸序列(aspasnasnlysargproser)。

seqidno：6描繪medi-573輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的氨基酸序列(gluthrtrpaspthrserleuseralaglyargval)。

seqidno：7描繪medi-573可變重鏈多肽的氨基酸序列：

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyraspileasntrpvalargglnalathrglyglnglyleuglutrpmetglytrpmetasnproasnserglyasnthrglytyralaglnlyspheglnglyargvalthrmetthrargasnthrserileserthralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargaspprotyrtyrtyrtyrtyrglymetaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserserala

seqidno：8描繪medi-573可變輕鏈多肽的氨基酸序列：

glnservalleuthrglnproproservalseralaalaproglyglnlysvalthrilesercysserglyserserserasnilegluasnasnhisvalsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuiletyraspasnasnlysargproserglyileproaspargpheserglyserlysserglythrseralathrleuglyilethrglyleuglnthrglyaspglualaasptyrtyrcysgluthrtrpaspthrserleuseralaglyargvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

seqidno：9描繪medi-573輕鏈多肽的氨基酸序列：

glnservalleuthrglnproproservalseralaalaproglyglnlysvalthrilesercysserglyserserserasnilegluasnasnhisvalsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuiletyraspasnasnlysargproserglyileproaspargpheserglyserlysserglythrseralathrleuglyilethrglyleuglnthrglyaspglualaasptyrtyrcysgluthrtrpaspthrserleuseralaglyargvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalaprothrglucysser

seqidno：10描繪medi-573重鏈多肽的氨基酸序列：

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyraspileasntrpvalargglnalathrglyglnglyleuglutrpmetglytrpmetasnproasnserglyasnthrglytyralaglnlyspheglnglyargvalthrmetthrargasnthrserileserthralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargaspprotyrtyrtyrtyrtyrglymetaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplysthrvalgluarglyscyscysvalglucysproprocysproalaproprovalalaglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheashserthrpheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproalaproileglulysthrileserlysthrlysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

發(fā)明詳述

本發(fā)明特點(diǎn)是可用于治療和預(yù)防肉瘤的藥物組合物和方法。本發(fā)明用于治療肉瘤的藥物組合物包含有效量的一種mtor抑制劑和有效量的特異性結(jié)合胰島素樣生長因子1(igf-1)和胰島素樣生長因子2(igf-2)中的至少一個的一種抗體。在一些實(shí)施例中，該藥物組合物中的抗體中和igf-1和igf-2中的至少一個。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于監(jiān)測具有肉瘤的患者的組合物和方法。

本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：當(dāng)與mtor抑制劑(例如，azd2014、雷帕霉素)組合時中和igf-1和/或igf-2的抗體可用于減少igf-響應(yīng)性肉瘤細(xì)胞(包括以自分泌方式分泌igf-1和/或igf-2的細(xì)胞)的增殖、存活并且/或者增加細(xì)胞死亡。

medi-573是一種結(jié)合與igf-1有交叉反應(yīng)性的igf-2的完全人類單克隆抗體。medi-573中和igf-1和igf-2并且抑制通過igf-1r和ir-a兩種途徑進(jìn)行的信號傳導(dǎo)。在2006年3月7日將表達(dá)medi-573的雜交瘤細(xì)胞系(7.159.2)保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，并且收到專利保藏命名號pta-7424。此抗體及其制備的描述可在2011年5月10日發(fā)布的美國專利號7,939,637中找到，該專利特此以引用的方式整體并入。

如在別處所述，大多數(shù)肉瘤細(xì)胞系表達(dá)igf-1r和igf-1，但僅骨肉瘤細(xì)胞系和幾種橫紋肌肉瘤細(xì)胞系分泌igf-2。medi-573抑制許多肉瘤細(xì)胞系的體外增殖，其中尤文氏肉瘤細(xì)胞系是最敏感的。這里提供的數(shù)據(jù)表明，肉瘤細(xì)胞響應(yīng)于由分泌的igf-1和igf-2引起的自分泌或旁分泌生長刺激。此外，medi-573抑制igf-1誘導(dǎo)的和igf-2誘導(dǎo)的肉瘤細(xì)胞的生長，并且顯著阻斷igf-1誘導(dǎo)的和igf-2誘導(dǎo)的igf-1r和akt途徑的活化。medi-573對肉瘤異種移植物的生長抑制與igf-1和igf-2配體的中和相關(guān)。

如在此說明的，medi-573還抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的akt活化。medi-573和mtor抑制劑的組合導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性?？偟膩碚f，該數(shù)據(jù)表示，通過medi-573與mtor抑制劑(雷帕霉素或azd2014)組合來抑制igf-1和igf-2導(dǎo)致了針對不同肉瘤的有效抗腫瘤活性。有利地，已發(fā)現(xiàn)靶向igf-1和/或igf-2可用于與mtor抑制劑組合來治療肉瘤，這與具有擾亂胰島素功能的可能性的靶向igf受體相反。因此，本發(fā)明提供可用于治療具有肉瘤、肉瘤的復(fù)發(fā)、和/或轉(zhuǎn)移性肉瘤或具有發(fā)展肉瘤、發(fā)展肉瘤的復(fù)發(fā)、和/或發(fā)展轉(zhuǎn)移性肉瘤傾向的受試者的藥物組合物和方法。具體地說，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療尤文氏肉瘤和一些橫紋肌肉瘤。

胰島素樣生長因子(igf)–igf-1和igf-2

胰島素樣生長因子igf-1和igf-2是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、分化、以及轉(zhuǎn)化的生長因子。兩種配體是普遍表達(dá)的并且充當(dāng)內(nèi)分泌、旁分泌、以及自分泌生長因子(波拉克(pollak),自然癌癥綜述(natrevcancer)2008,8(12):915-28；迪麥斯(demeyts),生物短評(bioessays)2004,26(12):1351–1362,2004；陶(tao)等人，2007,自然臨床實(shí)踐腫瘤學(xué)(natclinpractoncol)4(10):591-602.；賴安(ryan)和戈斯(goss)，腫瘤學(xué)家(oncologist)2008,13(1):16-24)。胰島素樣生長因子igf-i和igf-2通過結(jié)合胰島素樣生長因子1受體(igf-1r)和胰島素受體a同工型(ir-a)，活化包括irs蛋白質(zhì)、akt、以及mapk途徑的多種細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)來發(fā)揮它們的作用(夏卡(sciacca)等人，致癌基因(oncogene.)1999,18(15):2471-9；奇特尼斯(chitnis)等人，臨床癌癥研究(clincancerres.)2008,14(20):6364-70；)貝爾菲奧爾(belfiore)等人，內(nèi)分泌評論(endocr.rev.)2009,30,586–623；巴塞爾加(baserga)，未來腫瘤學(xué)(futureoncol.)2009,5(1):43-50)。用于igf配體的受體包括igf受體類型1和類型2(igf-1r和igf-2r)、胰島素受體a和b(ir-a和ir-b)、以及雜合受體(igf-1r/ir-a和igf-1r/ir-b)。igf-2r優(yōu)先結(jié)合igf-2。然而，igf-2r缺乏一個細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域并且不介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)。不受具體理論的束縛，igf-2r的損失導(dǎo)致增加的致瘤性，據(jù)推測這是通過增加igf-2結(jié)合igf-1r的可用性而引起的。igf-1和igf-2兩者在循環(huán)系統(tǒng)中作為復(fù)合物存在，結(jié)合六種igf結(jié)合蛋白(igfbp-1至igfbp-6)中的一種。igfbp-3，連同第三分子(酸不穩(wěn)定亞基)形成一種占絕大部分循環(huán)igf的復(fù)合物。igfbp具有比它們的同源受體更高的對于igf的親和力，并且可能螯合來自受體的igf。然而，替代的模型表明，結(jié)合蛋白可通過擴(kuò)展它在循環(huán)中的半衰期或通過結(jié)合細(xì)胞表面上的某些分子來增強(qiáng)igf活性，因此提供一個針對細(xì)胞的可用igf的庫。

高水平的循環(huán)igf-1和igf-2與發(fā)展幾種常見癌癥的風(fēng)險增大相關(guān)聯(lián)(勒內(nèi)漢(renehan)等人，柳葉刀(lancet.)2004,363(9418):1346-53)，這幾種常見癌癥包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞性肺癌(nsclc)、肝細(xì)胞癌(hcc)、以及肉瘤。ir-a和igf-2的過量表達(dá)還被建議作為一種可能導(dǎo)致對igf-1r指導(dǎo)療法的抗性的潛在機(jī)制(亨德里克森(hendrickson)和哈努斯卡(haluska)，研究藥物的最新觀點(diǎn)(curropininvestigdrugs.)2009,10(10):1032-40；張(zhang)等人，2007癌癥研究(cancerres.)67:391-397)。許多臨床前研究已報道，下調(diào)igf-1r表達(dá)或阻斷信號傳導(dǎo)導(dǎo)致體內(nèi)和體外抑制腫瘤生長(賴安和戈斯，腫瘤學(xué)家2008,13(1):16-24；薩契戴夫(sachdev)和綺(yee)，分子癌癥治療(molcancerther.)2007,6(1):1-12；巴塞爾加，治療靶標(biāo)專家評論(expertopinthertargets)2005,9(4):753-68)。也已證明igf信號傳導(dǎo)的抑制增加腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)對于化學(xué)治療劑的易感性(陶等人，2007自然臨床實(shí)踐腫瘤學(xué)4:591-602；奇特尼斯等人，2008，臨床癌癥研究14:6364-6370；賴安和戈斯，2008腫瘤學(xué)家13:16-24；袁(yuen)和麥考利(macaulay)，2008治療靶標(biāo)專家評論12:589-603)。ir-a和igf-1r受體的雙重抑制可增強(qiáng)針對igf驅(qū)動癌癥的治療效果(薩契戴夫和綺，分子癌癥治療2007,6(1):1-12)。

肉瘤

肉瘤是來自間充質(zhì)起源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的瘤形成，包括從骨骼發(fā)展而來的骨肉瘤和從像脂肪、肌肉、神經(jīng)、纖維組織、血管、或深皮膚組織的軟組織發(fā)展而來的軟組織肉瘤。肉瘤可基于它們最類似的組織的類型來命名。例如，骨肉瘤類似于骨骼，軟骨肉瘤類似于軟骨，脂肪肉瘤類似于脂肪，并且平滑肌內(nèi)瘤類似于平滑肌。肉瘤包括但不限于尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、阿金氏腫瘤、葡萄狀肉瘤、軟骨肉瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、軟組織肉瘤、軟組織腺泡狀肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促纖維增生性小圓細(xì)胞腫瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管內(nèi)皮瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌內(nèi)瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、滑膜肉瘤、以及未分化多形性肉瘤。

已證明涉及igf-1r和它的兩種配體igf-1和igf-2的自分泌環(huán)是一種驅(qū)動肉瘤細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵機(jī)制(金(kim)等人，2009癌癥報告(bull.cancer)96(7):52-60)。在大部分尤文氏肉瘤、骨肉瘤、以及橫紋肌肉瘤中指示了igf-1r、igf-1、或igf-2的高表達(dá)。尤文氏肉瘤分泌更多的igf-1，而橫紋肌肉瘤分泌更多的igf-2。igf-1是高度表達(dá)的并且刺激骨肉瘤細(xì)胞生長。igf途徑的遺傳變化在許多肉瘤腫瘤中也是普遍的。通常在胚胎rms中檢測到igf-2基因座處的失卻印跡，并且導(dǎo)致嵌合轉(zhuǎn)錄因子(pax3-fkhr或pax7-fkhr)的遺傳變化導(dǎo)致igf-1r在腺泡型橫紋肌肉瘤中的表達(dá)增加。相反地，在具有上調(diào)igf-1信號傳導(dǎo)的阻遏物胰島素生長因子結(jié)合蛋白質(zhì)3(igfbp3)的ews-fli1遺傳變化的尤文氏肉瘤患者中，這些患者具有改善的預(yù)后。鑒于與igf信號傳導(dǎo)途徑的強(qiáng)疾病聯(lián)系，已在幾種類型的肉瘤中探索了使用單克隆抗體(mab)抑制igf-1r受體的靶向治療方法。這些igf-1r靶向的mab抑制通過igf1r和異源二聚體igf-1r/ir進(jìn)行的igf-1和igf-2信號傳導(dǎo)，但是不抑制通過ir-a進(jìn)行的igf-2信號傳導(dǎo)，因此可能是受限制的。

尤文氏肉瘤

尤文氏肉瘤(外周原始神經(jīng)外胚層腫瘤)和阿金氏腫瘤形成一個腫瘤組，統(tǒng)稱為尤文氏肉瘤家族腫瘤(esft)。這些腫瘤的特征為導(dǎo)致rna結(jié)合蛋白ews的n-端有待融合至轉(zhuǎn)錄因子ets家族中一個成員(最常見的是friend白血病整合1轉(zhuǎn)錄因子(fli1))的c-端的特定染色體易位。已發(fā)現(xiàn)融合產(chǎn)物的表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)。

efst細(xì)胞系表達(dá)igf-1r并且在自分泌環(huán)中分泌igf-1。在efst中igf-1r表達(dá)的普遍性是非常高的，其中大部分細(xì)胞系和臨床樣品呈表達(dá)陽性。在鼠類成纖維細(xì)胞中，ews-fli1癌蛋白需要用于轉(zhuǎn)化的igf-1r。一些證據(jù)顯示，無復(fù)發(fā)存活可與血清igfbp-3與igf-1的比率相關(guān)。作為對這一理論的支持，ews-fli1直接減少igfbp-3的表達(dá)和分泌并且外源性igfbp-3抑制esft細(xì)胞的生長。igf-1r下游的途徑(包括pi3k/akt和mapk)被活化并且對esft細(xì)胞存活至關(guān)重要。pi3k和mapk兩者的抑制劑導(dǎo)致esft細(xì)胞的生長停滯。

橫紋肌肉瘤

橫紋肌肉瘤是最常見的兒童軟組織肉瘤，源自于發(fā)育中的形成橫紋肌的細(xì)胞。igf-2參與正常肌肉生長，并且對來自具有橫紋肌肉瘤的患者的腫瘤活組織檢查標(biāo)本的分析展示了高水平的igf-2mrna表達(dá)。不受具體理論的束縛，上調(diào)igf-2潛在地在這些腫瘤的失調(diào)生長中起著作用。另外，已觀察到igf-1r和由橫紋肌肉瘤細(xì)胞系分泌的igf-2的結(jié)合導(dǎo)致了自分泌生長增殖和增加的細(xì)胞運(yùn)動性。

已鑒定出引起igf-2基因座失卻印跡(loi)從而導(dǎo)致igf-2過度表達(dá)的外遺傳改變。此外，表征某些橫紋肌肉瘤的pax3–fkhr易位反式活化igf-1r啟動子，因此進(jìn)一步提供了igf途徑在橫紋肌肉瘤的發(fā)展中起重要作用的證據(jù)。所有橫紋肌肉瘤細(xì)胞系顯示出一定水平的igf-1r表達(dá)，盡管基于定量蛋白質(zhì)分析，它們可能相差多達(dá)30倍。

骨肉瘤

骨肉瘤的發(fā)病率峰值發(fā)生在青春期期間，這與循環(huán)gh和igf-1的生長陡增和峰濃度兩者是對應(yīng)的。高水平的igf-1似乎在骨肉瘤的發(fā)病機(jī)理中起重要作用。臨床前數(shù)據(jù)指示了igf-1在骨肉瘤中的作用。骨肉瘤細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)功能性igf-1r，并且大部分骨肉瘤患者樣品表達(dá)igf配體并且45％表達(dá)igf-1r。外源性igf-1刺激骨肉瘤細(xì)胞的增殖，并且可以使用抵抗igf-1r的單克隆抗體或反義寡核苷酸來抑制igf-1依賴性生長。此外，使用一種人源化抗-igf-1r抗體治療小鼠導(dǎo)致兩種骨肉瘤異種移植物模型中的腫瘤消退。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mtor)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mtor)是一種在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖以及存活中起重要作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mtor整合來自包括胰島素、生長因子(諸如igf-1和igf-2)、以及氨基酸的上游途徑的輸入。mtor還感測細(xì)胞營養(yǎng)、氧氣、以及能量水平。mtor途徑在諸如糖尿病、肥胖癥、抑郁癥、以及某些癌癥的人類疾病中調(diào)節(jié)異常。mtor被鑒定為對抗真菌劑雷帕霉素敏感。雷帕霉素是一種可以通過與它的細(xì)胞內(nèi)受體fkbp12關(guān)聯(lián)來抑制mtor的細(xì)菌產(chǎn)物。fkbp12-雷帕霉素復(fù)合物直接結(jié)合mtor的fkbp12-雷帕霉素結(jié)合(frb)結(jié)構(gòu)域，從而抑制mtor的活化。

mtor的活化導(dǎo)致下游核糖體蛋白s6激酶β-1(s6k)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4e-結(jié)合蛋白1(4e-bp1)的磷酸化作用。mtor信號傳導(dǎo)已成為癌癥療法的一種有吸引力的治療靶標(biāo)。mtor抑制劑坦羅莫司和依維莫司已被批準(zhǔn)分別用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。地磷莫司目前處于肉瘤患者的iii期試驗中。然而，雷帕霉素和它的衍生物通過釋放s6k與irs/pi3k之間的負(fù)反饋并且隨后重新活化igf-1r信號傳導(dǎo)來誘導(dǎo)akt活化。這有助于mtor抑制劑抗性的可能機(jī)制，并且表明將雷帕霉素與靶向igf途徑的試劑組合的潛在益處。幾種igf-1r靶向劑與不同雷帕霉素類似物的的組合處于早期臨床試驗中。第一代mtor抑制劑包括但不限于雷帕霉素、坦羅莫司(cci-779)、依維莫司(rad001)、地磷莫司(ap-23573)。第二代mtor抑制劑被設(shè)計成與atp在mtor的催化部位競爭。此類atp-競爭性mtor激酶抑制劑包括但不限于azd2014、ink128、azd8055、nvp-bez235、bgt226、sf1126、pki-587。以下提供mtor抑制劑azd2014和雷帕霉素的結(jié)構(gòu)。

抗體

選擇性結(jié)合igf-1/-2并且抑制受體對igf-1/-2的結(jié)合或活化的抗體可用于本發(fā)明方法。在某些實(shí)施例中，針對igf-1/-2的抗體不結(jié)合胰島素或抑制胰島素的生物活性。

在一個實(shí)施例中，該抗體是一種重組單克隆抗體。由包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、或哺乳動物細(xì)胞的宿主細(xì)胞制備該重組單克隆抗體。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是一種哺乳動物細(xì)胞。在另一個實(shí)施例中，重組單克隆抗體是一種人抗體。在又另一個實(shí)施例中，單克隆抗體是一種iga、ige、igd、ige、或igg抗體。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，單克隆抗體是一種igg抗體，包括但不限于一種igg1或igg2抗體。

在另一個實(shí)施例中，抗體包含在該抗體fc區(qū)上的至少一個n-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，和在該抗體fab區(qū)上的至少一個n-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。在另一個實(shí)施例中，抗體具有在該抗體fc區(qū)上的僅一個n-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，和在該抗體fab區(qū)上的僅一個n-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(即，總共3個n-聯(lián)糖基化位點(diǎn))。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來制備抗體。

然后可以從宿主中純化通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備的抗體?？贵w純化方法可包括鹽析沉淀(例如，使用硫酸銨)、離子交換色譜法(例如，在一個陽離子或陰離子交換柱上，優(yōu)選地在中性ph下運(yùn)行并且用增加離子強(qiáng)度的分級梯度洗脫)、凝膠過濾色譜法(包括凝膠過濾hplc)、以及諸如蛋白質(zhì)a、蛋白質(zhì)g、羥磷灰石、以及抗-免疫球蛋白的親和樹脂色譜分析法。

可以由被工程化以表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞方便地產(chǎn)生抗體。制作雜交瘤的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。雜交瘤細(xì)胞可以在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且用過的培養(yǎng)基可以被用作一種抗體來源。反過來可以由產(chǎn)生該抗體的雜交瘤獲得編碼感興趣的抗體的多核苷酸，并且然后可以由這些dna序列合成地或重組地產(chǎn)生該抗體。為了產(chǎn)生大量抗體，總體上更方便的是獲得腹水液。產(chǎn)生腹水的方法通常包括將雜交瘤細(xì)胞注入免疫學(xué)上最初的組織相容性或免疫不容性哺乳動物(尤其是小鼠)中。哺乳動物可通過先前給予適合的組合物(例如，降植烷)來為腹水產(chǎn)生做準(zhǔn)備。

由本發(fā)明方法產(chǎn)生的單克隆抗體(mab)可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行“人源化”?！叭嗽椿笨贵w是其中序列的至少一部分已從它的原始類型改變從而使它更接近人類免疫球蛋白的抗體。當(dāng)產(chǎn)生非人類動物(例如，鼠類)抗體時，用于人源化抗體的技術(shù)是特別有用的。在美國專利號4,816,567、5,530,101、5,225,539、5,585,089、5,693,762、以及5,859,205中提供了用于人源化鼠類抗體的方法的實(shí)例。

人抗體避免了一些與具有小鼠或大鼠可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的問題。這種鼠類或大鼠源性蛋白質(zhì)的存在可以導(dǎo)致抗體的快速清除或可以導(dǎo)致患者產(chǎn)生針對該抗體的免疫應(yīng)答。為了避免小鼠或大鼠衍生的抗體的使用，可以通過將功能性人抗體基因座引入嚙齒類動物、其他哺乳動物或動物而產(chǎn)生全人抗體，使得該嚙齒類動物、其他哺乳動物或動物產(chǎn)生全人抗體。

一種用于產(chǎn)生完全人抗體的方法是通過使用已經(jīng)被工程化為含有高達(dá)但小于1000kb大小的種系的小鼠品系，配置人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的片段。參見門德斯(mendez)等人，自然遺傳學(xué)(naturegenetics)15:146-156(1997)以及格林(green)和雅克博維茨(jakobovits)實(shí)驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)188:483-495(1998)。品系可從abgenix公司商購(弗里蒙特(fremont)，加利福尼亞州(ca))。

小鼠品系的產(chǎn)生在以下進(jìn)一步討論和描繪：1990年1月12日提交的美國專利申請序列號07/466,008、1990年11月8日提交的07/610,515、1992年7月24日提交的07/919,297、1992年7月30日提交的07/922,649、1993年3月15日提交的08/031,801、1993年8月27日提交的08/112,848、1994年4月28日提交的08/234,145、1995年1月20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430,938、1995年6月5日提交的08/464,584、1995年6月5日提交的08/464,582、1995年6月5日提交的08/463,191、1995年6月5日提交的08/462,837、1995年6月5日提交的08/486,853、1995年6月5日提交的08/486,857、1995年6月5日提交的08/486,859、1995年6月5日提交的08/462,513、1996年10月2日提交的08/724,752、1996年12月3日提交的08/759,620、2001年11月30日提交的美國公布2003/0093820、以及美國專利號6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181、和5,939,598，以及日本專利號3068180b2、3068506b2、和3068507b2。還參見1996年6月12日授權(quán)公布的歐洲專利號ep0463151b1、1994年2月3日公布的國際專利申請?zhí)杦o94/02602、1996年10月31日公布的國際專利申請?zhí)杦o96/34096、1998年6月11日公布的wo98/24893、2000年12月21日公布的wo00/76310。上述每個專利、申請和參考資料的披露內(nèi)容通過引用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。

在可替代的方法中，其他人(包括genpharm國際有限公司)使用一種“微基因座”方法。在微基因座方法中，通過包含來自ig基因座的碎片(單獨(dú)的基因)來模擬一個外源性ig基因座。因此，一種或多種vh基因、一種或多種dh基因、一種或多種jh基因、一個mu恒定區(qū)、以及通常一個第二恒定區(qū)(優(yōu)選地是一個γ恒定區(qū))形成在用于插入一個動物中的一個構(gòu)建體之中。此方法在以下進(jìn)行描述：屬于蘇拉尼(surani)等人的美國專利號5,545,807和各自屬于倫貝格(lonberg)和凱(kay)的美國專利號5,545,806、5,625,825、5,625、126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299、以及6,255,458；屬于krimpenfort和伯恩斯(berns)的美國專利號5,591,669和6,023.010；屬于伯恩斯等人的美國專利號5,612,205、5,721,367、以及5,789,215；和屬于崔(choi)和鄧恩(dunn)的美國專利號5,643,763；以及1990年8月29日提交的genpharm國際美國專利申請序列號07/574,748；1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、1992年6月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1004年3月9日提交的08/209,741，這些專利的披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。還參見歐洲專利號0546073b1、國際專利申請?zhí)杦o92/03918、wo92/22645、wo92/22647、wo92/22670、wo93/12227、wo94/00569、wo94/25585、wo96/14436、wo97/13852、和wo98/24884以及美國專利號5,981,175，這些專利的披露內(nèi)容通過引用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。進(jìn)一步參見泰勒(taylor)等人，1992；陳(chen)等人，1993；蒂阿永(tuaillon)等人，1993；崔等人，1993；倫貝格等人，(1994)；泰勒等人，(1994)；以及蒂阿永等人，(1995)；費(fèi)舍維爾德(fishwild)等人，(1996)，這些專利的披露內(nèi)容通過引用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。

kirin也證明了來自小鼠的人抗體的產(chǎn)生，在這些小鼠中通過微細(xì)胞融合，已經(jīng)引入大片的染色體、或整個染色體。參見歐洲專利申請?zhí)?73288和843961，這些專利的披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。另外，已經(jīng)產(chǎn)生km^tm-小鼠，這些小鼠是kirin'stc小鼠與medarex's微基因座(humab)小鼠雜交育種的結(jié)果。這些小鼠具有kirin小鼠的人igh轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)以及genpharm小鼠的κ鏈轉(zhuǎn)基因(石田(ishida)等人，克隆與干細(xì)胞(cloningstemcells),(2002)4:91-102)。

還可以通過體外方法衍生人抗體。適合的實(shí)例包括但不限于噬菌體展示(cat、莫弗西斯生物公司(morphosys)、dyax、biosite/梅達(dá)瑞克斯(medarex)、xoma、symphogen、亞力兄公司(alexion，(以前為proliferon)、affimed)、核糖體展示(cat)、酵母展示等等。

通過使用技術(shù)如下所述地制備如在此描述的抗體。然后，此類小鼠能夠產(chǎn)生人免疫球蛋白分子和抗體，并且在鼠類免疫球蛋白分子和抗體的產(chǎn)生中是缺乏的。用于實(shí)現(xiàn)此目的的技術(shù)披露于在此背景部分中披露的專利、申請以及參考文獻(xiàn)中。然而，具體地說，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生小鼠及來自其的抗體的優(yōu)選實(shí)施例披露于1996年12月3日提交的美國專利申請序列號08/759,620和1998年6月11日公布的國際專利申請?zhí)杦o98/24893以及2000年12月21日公布的wo00/76310，這些專利的披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。還參見門德斯等人，自然遺傳學(xué)15:146-156(1997)，該參考的披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。

通過使用這種技術(shù)，已產(chǎn)生針對各種抗原的完全人類單克隆抗體。基本上，用感興趣的抗原(例如，igf-17ii)免疫小鼠品系，從超免疫小鼠回收淋巴細(xì)胞(諸如b細(xì)胞)，并且將回收的淋巴細(xì)胞與髓系細(xì)胞系(myeloid-typecellline)融合，從而制備永生雜交瘤細(xì)胞系。將這些雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選并且選擇以便鑒定產(chǎn)生對感興趣的抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。在此提供用于產(chǎn)生多個雜交瘤細(xì)胞系的方法，該多個雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生對igf-1/-2具有特定性的抗體。另外，在此提供對于由此類細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的表征，包括此類抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列分析。

可替代地，可以直接測定b細(xì)胞，而不用融合至骨髓瘤細(xì)胞以產(chǎn)生雜交瘤。例如，可以從超免疫小鼠分離出cd19⁺b細(xì)胞，并且允許其增殖并分化成分泌抗體的漿細(xì)胞。然后針對抵抗igf-1/-2免疫原的反應(yīng)性，通過elisa篩選來自細(xì)胞上清液的抗體。還可以針對抵抗igf-1/-2片段的免疫反應(yīng)性來篩選上清液，以便進(jìn)一步關(guān)于結(jié)合igf-17ii上感興趣的功能性結(jié)構(gòu)域而對不同抗體繪圖。還可以針對其他相關(guān)的人類趨化因子并且針對大鼠、小鼠、以及諸如獼猴的非人類靈長動物、最后針對igf-1/-2的直系同源物來篩選抗體，以便確定物種交叉反應(yīng)性。來自含有感興趣抗體的孔的b細(xì)胞可以通過不同方法而永生，這些方法包括融合以便制作來自個體或來自被集中的孔的雜交瘤，或者通過感染ebv，或者通過已知的永生化基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染并且隨后接種到適合的培養(yǎng)基中?？商娲兀缓笫褂胕gf-1/-2-特異性溶血蝕斑試驗將分泌具有所希望的特異性的抗體的單個漿細(xì)胞分離(巴布庫克(babcook)等人，美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)93:7843-48(1996))。用于裂解的細(xì)胞優(yōu)選為涂覆有igf-1/-2抗原的綿羊紅細(xì)胞(srbc)。

在一種含有分泌感興趣的免疫球蛋白的漿細(xì)胞和補(bǔ)足物的b細(xì)胞培養(yǎng)物的存在下，斑塊的形成表明綿羊紅血細(xì)胞在感興趣的漿細(xì)胞周圍的特異性igf-1/-2-介導(dǎo)的裂解?？梢苑蛛x該斑塊中央的單個抗原特異性漿細(xì)胞，并且可以從單個漿細(xì)胞分離編碼該抗體特異性的遺傳信息。使用逆轉(zhuǎn)錄隨后通過pcr(rt-pcr)，可以克隆編碼該抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的dna。然后可以將此類克隆dna進(jìn)一步插入一個適合的表達(dá)載體中，優(yōu)選為一種諸如pcdna的載體盒，更優(yōu)選地，這樣的pcdna載體含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。然后可以將產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(例如，hek293細(xì)胞、cho細(xì)胞)中，并且在被修改為適合用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴(kuò)增編碼所希望的序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

通常，由融合雜交瘤產(chǎn)生的抗體是具有完全人κ輕鏈或λ輕鏈的人igg2重鏈。在此描述的抗體具有人igg4重鏈以及igg2重鏈?？贵w還可以屬于包括igg1的其他人同種型。這些抗體具有高親和性，當(dāng)通過固相和液相技術(shù)測量時，典型地具有從約10⁶至約10¹²m或以下的kd。具有至少10¹¹m的kd的抗體是抑制igf-1/-2的活性所希望的。

如應(yīng)當(dāng)了解的，抗-igf-1/-2抗體可以在除了雜交瘤細(xì)胞系之外的細(xì)胞系中表達(dá)。編碼具體抗體的序列可以用于轉(zhuǎn)化適合的哺乳動物宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以通過用于將多核苷酸引入一個宿主細(xì)胞的任何已知方法進(jìn)行，包括例如將多核苷酸包裹在一個病毒(或一個病毒載體中)并且用該病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或通過本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染程序，如美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461、以及4,959,455(這些專利通過引用結(jié)合在此)所例示。所使用的轉(zhuǎn)化過程取決于有待轉(zhuǎn)化的宿主。用于將異源多核苷酸引入哺乳動物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、一個或多個多核苷酸在脂質(zhì)體中的包裹、以及dna到核中的直接顯微注射。

作為用于表達(dá)的宿主可獲得的哺乳動物細(xì)胞系是在本領(lǐng)域中已知的，并且包括許多可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)獲得的永生化細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉鼠腎(bhk)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(cos)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，hepg2)、人上皮腎293細(xì)胞、以及多種其他細(xì)胞系。特別優(yōu)選的細(xì)胞系是通過確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平并且產(chǎn)生具有組成性igf-1/-2結(jié)合特性的抗體來選擇。

在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供“非常規(guī)抗體”。非常規(guī)抗體包括但不限于納米抗體、線性抗體(薩帕塔(zapata)等人，蛋白質(zhì)工程設(shè)計選擇(proteineng.)8(10):1057-1062,1995)、單結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈抗體、以及具有多化合價的抗體(例如，雙抗體、三體抗體、四體抗體、以及五體抗體)。納米抗體是已發(fā)展為在沒有輕鏈的情況下為全功能的天然發(fā)生重鏈抗體的最小片段。納米抗體具有常規(guī)抗體的親和性和特異性，盡管它們僅為單鏈fv片段大小的一半。這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)結(jié)合它們的極端穩(wěn)定性以及與人類抗體框架的高度同源性的后果為，納米抗體可以結(jié)合常規(guī)抗體不可及的治療靶標(biāo)。具有多化合價的重組抗體片段提供對癌細(xì)胞的高結(jié)合親合力和獨(dú)特的靶向特異性。因為具有約60-100kda大小的小分子提供更快的血液清除和快速組織吸收，因此這些多聚體scfv(例如，雙抗體、四體抗體)提供超過親本抗體的改進(jìn)，參見鮑爾(power)等人，(用于腫瘤診斷和治療的重組多聚抗體片段的產(chǎn)生(generationofrecombinantmultimericantibodyfragmentsfortumordiagnosisandtherapy)，分子生物學(xué)方法(methodsmolbiol)，207,335-50,2003)；以及吳(wu)等人(用于快速腫瘤靶向和成像的抗癌胚抗原(cea)雙抗體(anti-carcinoembryonicantigen(cea)diabodyforrapidtumortargetingandimaging)，腫瘤靶向(tumortargeting)，4,47-58,1999)。

已描述用于制作非常規(guī)抗體的不同技術(shù)。使用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生的雙特異性抗體由科斯特尼(kostelny)等人描述(免疫學(xué)雜志(j.immunol.)148(5):1547-1553,1992)。雙抗體技術(shù)由霍林格(hollinger)等人描述(美國國家科學(xué)院院刊90:6444-6448,1993)。通過使用單鏈fv(sfv)二聚體制作雙特異性抗體片段的另一個策略由格魯伯(gruber)等人描述(免疫學(xué)雜志152:5368,1994)。三特異性抗體由塔特(tutt)等人描述(免疫學(xué)雜志147:60,1991)。單鏈fv多肽抗體包括可以從一種核酸表達(dá)的一種共價連接的vh::vl異源二聚體，該核酸包括直接接合或通過如休斯頓(huston)等人(美國國家科學(xué)院院刊，85:5879-5883,1988)所描述的肽-編碼接頭接合的vh-編碼和vl-編碼序列。還參見美國專利號5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美國專利公布號20050196754和20050196754。

在一個實(shí)施例中，抗體結(jié)合與胰島素樣生長因子1(igf-1)有交叉反應(yīng)性的胰島素樣生長因子2(igf-2)，諸如在美國專利號7,939,637中披露的那些抗體，該專利通過引用以其全文結(jié)合于此。在某些實(shí)施例中，抗體結(jié)合與igf-1有交叉反應(yīng)性的igf-2，并且是一種選自下組的單克隆人抗體，該組由以下各項組成：mab7.251.3(atcc登錄號pta-7422)、mab7.34.1(atcc登錄號pta-7423)、以及mab7.159.2/medi-573(atcc登錄號pta-7424)。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該藥物組合物中的抗體包含包括在seqidno:1(sertyraspileasn)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(cdr1)；包括在seqidno:2(trpmetasnproasnserglyasnthrglytyralaginlysphegingly)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(cdr2)；包括在seqidno:3(aspprotyrtyrtyrtyrtyrglymetaspval)中列出的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(cdr3)；包括在seqidno:4(serglyserserserasnilegluasnasnhisvalser)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(cdr1)；包括在seqidno:5(aspasnasnlysargproser)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(cdr2)；以及包括在seqidno:6(gluthrtrpaspthrserleuseralaglyargval)中列出的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(cdr3)。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物中的抗體包含包括一個選自在seqidno:7和seqidno:8中列出的氨基酸序列的氨基酸序列的一個或多個可變區(qū)。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明藥物組合物中的抗體具有由雜交瘤細(xì)胞系7.159.2(atcc登錄號pta-7424)產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列。

medi-573是一種用技術(shù)產(chǎn)生并且在中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞中制造的完全人免疫球蛋白g2λ(igg2)抗體。medi-573選擇性地結(jié)合人胰島素樣生長因子higf-1和higf-2，并且抑制腫瘤細(xì)胞中的胰島素樣生長因子igf-1和igf-2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，由此抑制腫瘤生長。如專利號7,939,637所描述，將抗體從用可溶性重組人higf-1和higf-2偶聯(lián)鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(klh)交替免疫的小鼠中分離出來，該專利通過引用以其全文結(jié)合在此。medi-573由2個輕鏈和2個重鏈組成，具有大約151千道爾頓的總體分子量。

medi573選擇性地結(jié)合人胰島素樣生長因子(higf)-i和higf-2，并且抑制人腫瘤細(xì)胞中的igf-1介導(dǎo)和igf-2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和增殖。medi-573靶向igf-1和igf-2配體并且由此抑制igf介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。人癌細(xì)胞的非臨床研究表明，medi573由于抑制igf-1r和ir-a兩種途徑的能力而具有實(shí)現(xiàn)廣泛的抗腫瘤功效的潛力。此外，medi-573具有實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)而不干擾葡萄糖穩(wěn)態(tài)的潛力，該干擾一直是在靶向igf1r的研究藥物中觀察到的一種不良作用。體外研究的結(jié)果已顯示，在被轉(zhuǎn)染以表達(dá)人igf-1r和人igf-1/-2的多個工程化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞nih-3t3細(xì)胞系中，medi-573抑制igf-1和igf-2刺激的igf1r和下游信號傳導(dǎo)蛋白(包括akt和mapk)的磷酸化作用。此外，medi-573抑制這些信號傳導(dǎo)分子的自分泌磷酸化作用。功能上，medi-573在體外有效地抑制多種工程化nih3t3和人腫瘤細(xì)胞系的生長。在體內(nèi)，用medi-573治療荷瘤小鼠顯著地抑制分別過量表達(dá)higfii和人胰島素樣生長因子1受體(higf-1r)以及higf-1和higf-1r的植入克隆32(c32)和克隆p12(p12)腫瘤的生長。

療法

可以在能進(jìn)行癌癥療法的任何地方提供療法：在家、醫(yī)生的辦公室、診所、醫(yī)院門診部、或醫(yī)院。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供使用一種抗-igf-1/-2抗體(例如，medi-573)與一種mtor抑制劑組合作為療法。

一般在醫(yī)院開始治療，使得醫(yī)生可以接近地觀察療法的效果并且做出任何需要的調(diào)整。療法的持續(xù)時間取決于要治療的癌癥種類、患者的年齡和病況、患者的疾病的階段和類型、以及患者的身體響應(yīng)治療?？梢园床煌拈g隔(例如每天、每周、或每月)進(jìn)行給藥?？梢园窗ㄐ菹r段的斷續(xù)周期給予療法，使得患者的身體具有構(gòu)建健康新細(xì)胞并且重新獲得力量的機(jī)會。

取決于癌癥的類型及其發(fā)展階段，可以使用療法減緩癌癥擴(kuò)散，減緩癌癥的增長，殺死或停止可能從原始腫瘤擴(kuò)散至身體其他部分的癌細(xì)胞，減輕由癌癥引起的癥狀，或者防止原位的癌癥。癌癥生長是不受控制的并且是進(jìn)行性的，并且在不引發(fā)正常細(xì)胞的擴(kuò)增或?qū)⒁鹫＜?xì)胞的擴(kuò)增停止的條件下發(fā)生。

如上所述，如果希望，用本發(fā)明的組合物進(jìn)行治療可以聯(lián)合用于治療增生性疾病的療法(例如放射療法、外科手術(shù)、或化學(xué)療法)。

藥物組合物的配制

本發(fā)明的用于治療肉瘤的組合(例如，一種結(jié)合igf-1/-2的抗體與一種mtor抑制劑)可以通過任何適合的手段給藥，該給藥導(dǎo)致治療劑的與其他組分聯(lián)合而有效預(yù)防、緩解、或減小肉瘤的濃度。該化合物可以任何合適量地包含于任何合適的載體物質(zhì)中，并且總體上以該組合物總重的1-95％(按重量計)存在。該組合物可以是以一種適合于腸胃外(例如，皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或腹膜內(nèi))給藥途徑的劑型來提供。這些藥物組合物可以根據(jù)常規(guī)藥物慣例進(jìn)行配制(參見，例如，雷明頓：藥學(xué)技術(shù)與實(shí)踐(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)，編輯，a.r.真納羅(gennaro)，利平科特威廉姆斯(lippincottwilliams)&威爾金斯(wilkins)，2000，和制藥工藝學(xué)百科全書(encyclopediaofpharmaceuticaltechnology)，編輯，j.斯沃布里克(swarbrick)和j.c.博伊蘭(boylan)，1988-1999，馬塞爾·德克爾(marceldekker)，紐約)。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以配制成在給藥時基本上立刻釋放出該活性化合物或者在給藥后任何一個預(yù)定的時刻或時間段釋放出該活性化合物。后一種類型的組合物通常稱為控釋配制品，包括(i)在延長的一段時間內(nèi)建立藥物在體內(nèi)的基本上恒定濃度的配制品；(ii)在預(yù)定的滯后時間后，在延長的一段時間內(nèi)建立藥物在體內(nèi)的基本上恒定濃度的配制品；(iii)在預(yù)定時間段期間，通過在體內(nèi)保持相對恒定的有效水平且同時伴隨著與活性物質(zhì)血漿水平波動相關(guān)的不良副作用最小化(鋸齒動力學(xué)模式)來持續(xù)作用的配制品；(iv)通過例如一種控釋組合物鄰近一個肉瘤或在一個肉瘤中的空間布置來使作用局部化的配制品；(v)允許方便地給藥，使得例如每一周或每兩周一次給予劑量的配制品；以及(vi)通過使用載體或化學(xué)衍生物來靶向增殖的贅生性細(xì)胞以便將治療劑遞送至肉瘤細(xì)胞的配制品。對于某些應(yīng)用而言，控釋配制品排除了對在白天頻繁給藥以維持血漿水平于治療水平的需要。

可以遵循許多策略中的任何一個，以便獲得其中釋放速率大于所談?wù)摰幕衔锏拇x速率的控釋。在一個實(shí)例中，控釋通過對各種配制參數(shù)和成分的合適選擇來獲得，包括，例如，不同的控釋組合物和包衣類型。因此，將該治療劑與合適的賦形劑配制為一種給藥時以受控方式釋放該治療劑的藥物組合物。實(shí)例包括單或多單位片劑或膠囊組合物、油溶液、懸浮液、乳劑、微膠囊、微球、分子復(fù)合物、納米顆粒、膏藥、以及脂質(zhì)體。

本發(fā)明的組合物可以在藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、或賦形劑內(nèi)，以單位劑型來給予。可以使用常規(guī)藥物慣例來提供適合的配制品或組合物，來向患有由細(xì)胞增殖過度引起的疾病的患者給予化合物。給予可以在患者有癥狀之前開始。

可以使用任何適合的給予途徑，例如，給予可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、顱內(nèi)、眼眶內(nèi)、眼睛、心室內(nèi)、肝內(nèi)、囊內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、噴霧、栓劑、或口服給予。例如，治療配制品可以為液態(tài)溶液或懸浮液的形式；對于口服給藥，配制品可以為片劑或膠囊劑的形式；以及對于鼻內(nèi)給藥，配制品為粉末、滴鼻劑或氣溶膠的形式。針對以上所述申請的任何方法，本發(fā)明的組合物優(yōu)選靜脈內(nèi)給予或施加到所需的細(xì)胞凋亡事件的位點(diǎn)(例如，通過注射)。

本領(lǐng)域中熟知的用于制備配制品的方法發(fā)現(xiàn)于，例如，“雷明頓：藥學(xué)技術(shù)與實(shí)踐(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)”編輯，a.r.真納羅(gennaro)，利平科特威廉姆斯(lippincottwilliams)&威爾金斯(wilkins)，費(fèi)城，賓夕法尼亞州，2000。針對腸胃外給予的配制品可以，例如，包含賦形劑、無菌水、或鹽水、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、植物來源的油、或氫化萘。可以使用生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧化乙烯-聚氧丙烯共聚物來控制化合物的釋放。用于遞送試劑的其他潛在有用的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統(tǒng)、以及脂質(zhì)體。用于吸入的配制品可以包括賦形劑，例如，乳糖，或者可以是包含如下的水溶液，例如，聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘氨膽酸酯和脫氧膽酸酯，或者可以是用于以滴鼻劑的形式或作為凝膠給予的油溶液。

可以將配制品以治療有效量向人類患者給予(例如，預(yù)防、消除、或減輕病理狀態(tài)的量)，以提供針對疾病或病癥的療法。本發(fā)明組合物的優(yōu)選劑量可能取決于變量如障礙的類型和程度，具體患者的整體健康狀態(tài)，化合物賦形劑的配制品，以及其給予途徑。

針對在此所述的任何療法的人類劑量最初可以通過從小鼠中使用的化合物的量進(jìn)行推斷來確定，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到的，與動物模型相比來修改對人類的劑量是本領(lǐng)域中的慣例。在某些實(shí)施例中，設(shè)想該劑量可在從約1mg化合物/kg體重至約5000mg化合物/kg體重；或從約5mg/kg體重至約4000mg/kg體重或從約10mg/kg體重至約3000mg/kg體重；或從約50mg/kg體重至約2000mg/kg體重；或從約100mg/kg體重至約1000mg/kg體重；或從約150mg/kg體重至約500mg/kg體重之間變化。在其他實(shí)施例中，此劑量可以是約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000mg/kg體重。在其他實(shí)施例中，設(shè)想可以使用更高的劑量，此類劑量可以在約5mg化合物/kg體重至約20mg化合物/kg體重范圍內(nèi)。在其他實(shí)施例中，這些劑量可以是約8、10、12、14、16或18mg/kg體重。當(dāng)然，同在此類的治療方案中常規(guī)做的一樣，這個劑量可以往上或往下調(diào)節(jié)，這個調(diào)節(jié)取決于最初的臨床試驗和具體患者的需要。

在某些實(shí)施例中，劑量包括結(jié)合igf-1和/或igf-2的一種抗體的至少兩個劑量。劑量間隔約一周、或約三周，并且每個劑量包含大于約0.5mgkg患者體重并且小于約50mg/kg患者體重的量的抗體。關(guān)于medi-573的劑量，例如在wo2012068148中所描述，該專利以其全文結(jié)合在此。

試劑盒

本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防肉瘤的試劑盒。在一個實(shí)施例中，該試劑盒包括含有有效量的抗體和一種或多種mtor抑制劑的治療性或預(yù)防性組合物。該抗體可特異性結(jié)合igf-1和/或igf-2并且可抑制它們的活性。在一個實(shí)施例中，該抗體可以是medi-573。在一個實(shí)施例中，該mtor抑制劑可以是azd2014、ink128、azd8055、nvp-bez235、bgt226、sf1126、pki-587、雷帕霉素、坦羅莫司、依維莫司、地磷莫司中的一種或多種，及其組合。在一個具體實(shí)施例中，該mtor抑制劑是雷帕霉素。在一個具體實(shí)施例中，該mtor抑制劑是azd2014。在一個具體實(shí)施例中，該試劑盒包括單位劑型的、包含有效量的medi-573和雷帕霉素的治療性或預(yù)防性組合物。在一個具體實(shí)施例中，該試劑盒包括單位劑型的、包含有效量的medi-573和azd2014的治療性或預(yù)防性組合物。

在一些實(shí)施例中，該試劑盒包括一個容納治療性或預(yù)防性組合物的無菌容器；此類容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、試管、袋子、小袋、泡罩包裝、或本領(lǐng)域已知的其他適合的容器形式。此類容器可以是由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔、或其他適用于容納藥物的材料制成的。

可將本發(fā)明的抗體與用于向受試者給予抗體和mtor抑制劑的說明書一起提供，該受試者患有或處于發(fā)展肉瘤的風(fēng)險。說明書可一般包括關(guān)于使用組合物用于治療或預(yù)防肉瘤的信息。在其他實(shí)施例中，說明書包括以下各項中的至少一項：治療劑的描述；用于治療或預(yù)防肉瘤或它的癥狀的劑量時間表和給藥；預(yù)防措施；警告；適應(yīng)癥；禁忌癥；過量用藥信息；不良反應(yīng)；動物藥理學(xué)；臨床研究；和/或參考文件。這些說明書可以直接打印在容器(當(dāng)存在時)上，或作為標(biāo)簽應(yīng)用于容器，或作為單獨(dú)的頁、小冊子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夾。

給出以下的實(shí)例是為了給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何準(zhǔn)備和使用測試、篩選和本發(fā)明的治療方法的一個完整的公開和說明，而不是旨在限定諸位發(fā)明人認(rèn)為是自己的發(fā)明的范圍。

實(shí)例

實(shí)例1.肉瘤異種移植物和細(xì)胞中的igf-1、igf-2和igf-1r水平以及ir-a:ir-b比率

通過qrt-pcr確定在來自兒科肉瘤(年齡：6個月至25歲)的23個異種移植物中的胰島素樣生長因子1(igf-1)、胰島素樣生長因子2(igf-2)、以及胰島素樣生長因子1受體(igf-1r)的mrna水平。在圖1a至圖1d中示出這些分析的結(jié)果。如圖1a所示，發(fā)現(xiàn)與骨肉瘤(p＝0.029)和橫紋肌肉瘤(p＝0.0024)相比，尤文氏肉瘤中的igf-1的mrna水平明顯較高。相比之下，如圖1b所示，發(fā)現(xiàn)與尤文氏肉瘤(p＝0.0005)和骨肉瘤(p＝0.0066)相比，橫紋肌肉瘤中的igf-2的mrna水平明顯較高。如圖1c所示，肉瘤的全部3個亞型均表達(dá)了高的igf-1r的mrna水平。所測定的大部分肉瘤異種移植物樣品具有胰島素受體a同工型與胰島素受體b同工型的比率(ir-a:ir-b)的高循環(huán)閾值(δct)微分(δct<-4)，其中橫紋肌肉瘤是最高的(圖1d)。

還使用qrt-pcr，在包括尤文氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、以及骨肉瘤的多個肉瘤細(xì)胞系中測量igf配體和受體的mrna水平。結(jié)果顯示在以下表1中。與異種移植物樣品的結(jié)果一致，尤文氏肉瘤細(xì)胞具有最高的igf-1水平，而橫紋肌肉瘤細(xì)胞表達(dá)最高的igf-2水平。在圖2a中描繪示出igf-1、igf-1r、igf-2、以及igf2r的計算δct的圖。在圖2b中描繪ir-a:ir-b比率的計算δct。

表1

igf配體和受體的mrna水平

通過elisa在相同肉瘤細(xì)胞系中確定igf-1、igf-2、以及igf-1r的蛋白質(zhì)水平。這些結(jié)果在圖3a至圖3c中描繪。這些結(jié)果顯示，大多數(shù)肉瘤細(xì)胞系表達(dá)igf-1r和igf-1蛋白質(zhì)(圖3a和圖3c)。僅骨肉瘤細(xì)胞系和少量橫紋肌肉瘤細(xì)胞系分泌igf-2(圖3b)。沒有尤文氏肉瘤細(xì)胞系表達(dá)可檢測量的igf-2。

實(shí)例2.medi-573抑制由自分泌或旁分泌igf配體驅(qū)動的肉瘤細(xì)胞生長和增殖

為了確定用medi-573抗體的治療對于腫瘤細(xì)胞生長的影響，用medi-573(一種抗-igf抗體)在缺乏外源性igf-1或igf-2的情況下治療三個橫紋肌肉瘤細(xì)胞系(rd、sjcrh30、以及hs729)；三個尤文氏肉瘤細(xì)胞系(rd-es、tc-71、以及sk-es-1)；以及四個骨肉瘤細(xì)胞系(sjsa-1、khos、mg-63、以及saos2)。

在缺乏外源性igf-1或igf-2的情況下，全部三個尤文氏肉瘤細(xì)胞系(rd-es、tc-71、以及sk-es-1)和一個橫紋肌肉瘤細(xì)胞系(sjcrh30)的生長被medi-573抗體抑制。不受具體理論的束縛，此結(jié)果表明，這些細(xì)胞系分泌內(nèi)源性igf-1或igf-2以驅(qū)動它們的生長(自分泌驅(qū)動)。在rd和sjsa-1細(xì)胞中存在適度的生長抑制(在測試的最高劑量下為～30％)。這些結(jié)果描繪在以下表2中以及圖4a至圖4f中，其中圖4a描繪用medi-573治療的rd-es細(xì)胞的細(xì)胞活力的圖；圖4b描繪用medi-573治療的tc-71細(xì)胞的細(xì)胞活力的圖；圖4c描繪用medi-573治療的sjcrh30細(xì)胞的細(xì)胞活力的圖；圖4d描繪用medi-573治療的sk-es-1細(xì)胞的細(xì)胞活力的圖；圖4e描繪用medi-573治療的sjsa-1細(xì)胞的細(xì)胞活力的圖；以及圖4f描繪用medi-573治療的rd細(xì)胞的細(xì)胞活力的圖。

表2

添加medi-573對于不同細(xì)胞系的影響

為了確定添加igf對于medi-573的抗增殖活性是否有影響，在用外源性添加的igf刺激的多個肉瘤細(xì)胞系中重復(fù)該測定。這些測定的結(jié)果顯示在以下表3中。

表3

添加medi-573對于用igf刺激的細(xì)胞的影響

來自表3的數(shù)據(jù)顯示在圖5a至圖5f和圖6a至圖6d中。這些表和圖顯示，添加igf-1誘導(dǎo)尤文氏肉瘤細(xì)胞系rd-es(圖5a)、tc-71(圖5e)、以及sk-es-1(圖5c)中的細(xì)胞增殖約2倍。類似地，添加igf-2誘導(dǎo)尤文氏肉瘤細(xì)胞系rd-es(圖5b)、tc-71(圖5e)、以及sk-es-1(圖5d)中的細(xì)胞增殖約2倍。添加igf-1誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系mg-63(圖6c)和saos-2(圖6a)中的細(xì)胞增殖。medi-573有效地抑制igf-1和igf-2刺激的細(xì)胞生長。在一個相對比較中，與igf-1刺激的增殖相比(ic50范圍是從20至223μm)，針對igf-2刺激的增殖，medi-573展現(xiàn)更好的效果(ic50范圍是從2至20μm)。一些細(xì)胞系(諸如khos和rd細(xì)胞)不響應(yīng)于igf-1或igf-2刺激。medi-573未能對調(diào)節(jié)有或無igf刺激的khos和rd細(xì)胞的生長起到任何顯著的效果。不受具體理論的束縛，這表明igf信號傳導(dǎo)不驅(qū)動這些無反應(yīng)細(xì)胞系的生長或存活。

為了評估m(xù)edi-573對于rd-es、tc-71、sjsa-1、以及khos細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)的基本原理，用增大濃度的medi-573將細(xì)胞處理48小時并且通過測量半胱天冬蛋白酶-3和半胱天冬蛋白酶-7的活化進(jìn)行分析。在rd-es、tc-71、以及sjsa-1細(xì)胞中，相比于同種型對照，用medi-573治療以劑量依賴性的方式增大了半胱天冬蛋白酶-3/-7活性。在khos細(xì)胞中未檢測出半胱天冬蛋白酶-3/-7的活化。(數(shù)據(jù)未示出。)

實(shí)例3.medi-573抑制肉瘤異種移植物模型中的腫瘤生長

每周兩次用medi-573治療具有rd-es(尤文氏肉瘤)異種移植物的小鼠導(dǎo)致10mg/kg下25％、30mg/kg下44％、以及60mg/kg下52％的腫瘤生長抑制(圖7a)。當(dāng)以相同方式治療具有tc-71異種移植物(另一種尤文氏肉瘤模型)的小鼠時，看到了類似效果。當(dāng)用medi-573治療具有sjsa-1(一種骨肉瘤模型)異種移植物的小鼠時獲得可比較的結(jié)果(圖7b)。盡管在缺乏外源性igf的情況下，sk-es-1和sjcrh30細(xì)胞的增殖被medi-573體外抑制，但是這兩種模型的體內(nèi)生長不受medi-573治療的影響。與該體外發(fā)現(xiàn)一致的是，khos細(xì)胞在體內(nèi)也不響應(yīng)于medi-573(圖7c)。由于沒有觀察到體重減輕，因此medi-573治療在小鼠中是耐受良好的。

測量未治療小鼠和用不同量的medi-573治療的小鼠的異種移植物腫瘤中的游離igf配體。在rd-es腫瘤中，存在igf-1的medi-573劑量依賴性抑制(圖8a)，并且igf-2的水平太低而無法檢測。相比之下，sjsa-1腫瘤顯示可檢測水平的igf-2(圖8b)，但是沒有igf-1(數(shù)據(jù)未示出)。sjsa-1腫瘤中的游離igf-2幾乎完全被medi-573中和，即使在10mg/kg的最低劑量下。這可能反映了與igf-1相比(kd＝294pmol/l)，medi-573對于igf-2的較高結(jié)合親和力(kd＝2pmol/l)。盡管khos細(xì)胞對igf-1和/或igf-2刺激無反應(yīng)，仍在khos/np模型中檢查igf-2水平。在khos/np模型中觀察到人igf-2水平的劑量依賴性抑制，但是一些水平的游離igf-2即使在最高60mg/kg劑量下也是可檢測的，這比得上sjsa-1腫瘤中的基線igf-2水平(圖8c)。

實(shí)例4.medi-573抑制肉瘤細(xì)胞中的igf信號傳導(dǎo)

medi-573抑制igf-1r、ir-a、以及蛋白激酶b(akt)在rd-es、tc-71、sk-es-1、以及sjsa-1細(xì)胞中的自身磷酸化作用，但不抑制在khos細(xì)胞中的自身磷酸化作用(圖9a–圖9c)。

當(dāng)將外源性igf-1或igf-2添加到細(xì)胞時，在所檢查的所有細(xì)胞中存在對于igf-1r和ir-a的磷酸化作用的誘導(dǎo)。如圖10至圖10c中所見，用medi-573預(yù)處理抑制igf-1/-2誘導(dǎo)的igf-1r和ir-a的活化。igf-1和igf-2還刺激akt在rd-es、tc-71、sk-es-1、以及sjsa-1細(xì)胞中的磷酸化作用。medi-573阻斷這一作用。然而，在khos細(xì)胞中，盡管在igf-1/-2刺激中觀察到受體磷酸化作用，但沒有akt的誘導(dǎo)。

還在肉瘤異種移植物中檢查medi-573對于igf信號傳導(dǎo)的體內(nèi)效應(yīng)。為了與體外實(shí)驗一致，以兩種方式進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)研究。首先，檢查medi-573對于由igf配體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的作用，這些igf配體由腫瘤以自分泌方式分泌。將單次劑量的medi-573給予具有～400mm³rd-es、sjsa-1、或khos/np腫瘤的小鼠。給予medi-573抑制在rd-es腫瘤但不抑制在khos/np腫瘤中的pakt和磷酸化p4ebp1的自身磷酸化作用。在圖11中示出來自具有rd-es腫瘤的小鼠的樣品的免疫印跡圖像。

成年小鼠不產(chǎn)生鼠igf-2，并且medi-573具有針對鼠igf-1的低結(jié)合親和力。因此，將人igf-1和igf-2(igf-1/-2)注入小鼠，以便理解igf配體在由內(nèi)分泌或旁分泌遞送時在驅(qū)動腫瘤生長中的作用，以及medi-573在抑制此功能中的作用。在注射igf-1或igf-2十五分鐘后，在rd-es腫瘤和血漿兩者中均檢測出高水平的igf-1或igf-2。用腹膜內(nèi)medi-573預(yù)處理6小時將腫瘤裂解物和血漿中的igf-1水平降低了大約50％(參見圖12a和圖12b)，并且?guī)缀跬耆档土薸gf-2水平(參見圖12c和圖12d)。

類似地，相比于未接受igf-1/-2的小鼠，akt和核糖體蛋白s6激酶β-1(s6k)的磷酸化作用增強(qiáng)了(圖13)。用medi-573預(yù)處理導(dǎo)致大幅減少igf-誘導(dǎo)的pakt和ps6k，特別是針對igf-2注射。igf-1/-2注射不改變p4ebp-1的基線水平。medi-573治療抑制即使是低于基線水平的p4ebp-1。

實(shí)例5.medi-573與mtori組合體外抑制肉瘤細(xì)胞生長

在細(xì)胞毒性測試中評估m(xù)edi-573與mtor抑制劑雷帕霉素和azd2014組合的作用。用medi-573和雷帕霉素、或者medi-573和azd2014來處理rd-es細(xì)胞。如圖14所示，單獨(dú)用medi-573處理導(dǎo)致細(xì)胞活力減少56％，并且單獨(dú)用雷帕霉素處理導(dǎo)致細(xì)胞活力減少34％。medi-573與雷帕霉素的組合導(dǎo)致活力減少80％(p<0.01)。單獨(dú)用mtor抑制劑azd2014處理使細(xì)胞活力減少55％，并且用azd2014與medi-573的組合導(dǎo)致細(xì)胞活力減少85％(p<0.01)。與上述表明medi-573對于khos細(xì)胞增殖沒有影響(表3)的結(jié)果一致，medi-573與mtori的組合也不顯示在khos細(xì)胞中的任何增強(qiáng)的活性。

為了檢查medi-573、mtori、以及兩者的組合對于igf信號傳導(dǎo)的作用，用這些試劑將rd-es、sjsa-1、以及khos細(xì)胞處理4小時。在利用凝膠電泳法分離細(xì)胞裂解物后，通過免疫印跡檢測蛋白質(zhì)。圖15顯示，medi-573抑制rd-es和sjsa-1細(xì)胞中但不抑制khos細(xì)胞中的s6k的磷酸化作用。單獨(dú)的雷帕霉素以及與medi-573組合的雷帕霉素在全部3個細(xì)胞系中完全抑制ps6k。單獨(dú)medi-573或單獨(dú)雷帕霉素對于4ebp1的磷酸化作用沒有影響。用兩者的聯(lián)合治療導(dǎo)致兩個有反應(yīng)細(xì)胞系(rd-es和tc-71)中p4ebp1的減少，但在無反應(yīng)細(xì)胞系(khos)中沒有任何影響。雷帕霉素治療誘導(dǎo)全部3個細(xì)胞系中的akt的磷酸化作用。在rd-es和tc-71細(xì)胞中但不在khos細(xì)胞中，在medi-573的存在下，雷帕霉素誘導(dǎo)的akt活化被顯著抑制到未處理對照中觀察到的水平(圖15)。

雖然用azd2014處理抑制rd-es中的ps6k磷酸化作用，但是azd2014不抑制sjsa-1或khos細(xì)胞中的ps6k磷酸化作用。medi-573與azd2014的組合抑制sjsa-1細(xì)胞中的ps6k磷酸化作用。當(dāng)medi-573與azd2014組合時對于pakt磷酸化作用的影響似乎比當(dāng)medi-573與雷帕霉素組合時更加明顯(圖15)。

實(shí)例6.medi-573與mtori組合抑制rd-es腫瘤異種移植物中的肉瘤細(xì)胞生長

單獨(dú)用medi-573治療rd-es異種移植物模型導(dǎo)致52％腫瘤生長抑制。單獨(dú)用azd2014治療rd-es異種移植物模型導(dǎo)致51％腫瘤生長抑制。用medi-573和azd2014的組合治療rd-es異種移植物模型導(dǎo)致明顯好于單獨(dú)試劑的96％腫瘤生長抑制(p<0.001)(圖16a)。治療對于體重的影響在圖16b中示出。在sjsa-1異種移植物模型中觀察到一種對于腫瘤生長抑制的類似影響。與用單獨(dú)試劑治療相比，用medi-573和azd2014的組合治療khos異種移植物模型不導(dǎo)致增加的腫瘤生長抑制。

還在rd-es異種移植物模型中測試了medi-573與雷帕霉素的組合，并且結(jié)果在圖17a中示出。盡管medi-573與雷帕霉素組合的影響略小于medi-573與azd2014的組合，但與任何單獨(dú)試劑相比(medi-573為59％，并且雷帕霉素為44％)，聯(lián)合治療增強(qiáng)了抗腫瘤活性(79％腫瘤生長抑制)(圖17a)。由于沒有觀察到明顯的體重減輕，因此聯(lián)合治療是耐受的。

使用下面的材料和方法獲得了在此描述的這些結(jié)果。

細(xì)胞和試劑

肉瘤細(xì)胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(馬納薩斯(manassas)，弗吉尼亞州(va))購買。celltiter-glo試劑得自(威斯康星州麥迪遜的promega公司(promega,madison,wi))。用于pigf-1r、pir-a、以及pakt的全細(xì)胞裂解物試劑盒從mesoscalediscovery公司(msd；馬里蘭州羅克維爾市(msd；rockville,md))購買。用于總igf-1和igf-1r的elisa試劑盒從r&d系統(tǒng)(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯市(minneapolis,mn))購買。用于總igf-2的elisa試劑盒從insightgenomics公司(維吉尼亞州福爾斯徹奇市(fallschurch,va))購買。一種用于檢測游離igf-1和igf-2的elisa試劑盒是在內(nèi)部開發(fā)的。人igf-1和igf-2得自r&d系統(tǒng)(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯市)。用于檢測磷酸-akt、磷酸-4ebp1、磷酸-s6k、以及gapdh的抗體是來自cellsignalingtechnology公司(馬薩諸塞州貝弗利(beverly,ma))。

用于測量igf-1/-2、igf-1r、ir-a、ir-bmrna水平的rt-pcr測定

使用zrrnamicroprep試劑盒(zymoresearch公司，加利福尼亞州歐文市(irvine,ca))根據(jù)制造商的方案來純化總rna。

使用iiifirst-strandsynthesissupermix(生命科技公司(lifetechnologies)，加利福尼亞州卡爾斯巴德市)由總rna產(chǎn)生單鏈cdna。使用taqman預(yù)擴(kuò)增主要混合物(pre-ampmastermix)，根據(jù)制造商的說明將cdna樣品預(yù)擴(kuò)增。反應(yīng)含有5μlcdna、10μl預(yù)擴(kuò)增主要混合物以及5μl0.2×基因表達(dá)測定混合物(包含有待測定的所有引物/探針)，最終反應(yīng)體積是20μl。用推薦的14周期程序?qū)⒎磻?yīng)循環(huán)并且然后用te緩沖液進(jìn)行1:5稀釋。立即使用預(yù)擴(kuò)增cdna或在-20c下儲存直到進(jìn)行處理。

將用于制備樣品的反應(yīng)混合物加載到48×48動態(tài)陣列芯片中并且含有2.5μl2×通用主要混合物(universalmastermix)、0.25μl樣品上樣緩沖液(sampleloadingbuffer)、以及2.25μl預(yù)擴(kuò)增cdna。用于引物/探針的反應(yīng)混合物含有2.5μl20×taqman基因表達(dá)測定混合物(geneexpressionassay)和2.5μl測定上樣緩沖液。在將樣品和測定試劑加載到入口之前，在ifc控制器中引發(fā)(primed)芯片。將樣品(5μl)加載到動態(tài)陣列芯片的每個樣品入口中，并且將5μl10×基因表達(dá)測定混合物(geneexpressionassaymix)加載到每個檢測器入口中。將芯片放置在用于加載和混合的ifc控制器上。一旦完成ifc引發(fā)步驟，就將芯片加載到用于熱循環(huán)的biomarkrt-pcr系統(tǒng)上(95c持續(xù)10分鐘，在95c下的40個循環(huán)持續(xù)15秒，60c持續(xù)一分鐘)。樣品的復(fù)制品數(shù)目和組成根據(jù)具體實(shí)驗而改變但不少于一式三份測定。將平均循環(huán)閾值(ct)用于量化所設(shè)計的探針。將一個樣品中的所有可用參考基因測定的平均ct值用于計算δct。

測試igf-1、igf-2、igf-1r、ir-a以及ir-b的水平。ir-a和ir-b的taqman基因表達(dá)測定已在黃(huang)等人，2011(科學(xué)公共圖書館(plosone.)2011；6(10):e26177)中描述。此方法允許ir-a和ir-b各自獨(dú)立地進(jìn)行特異性擴(kuò)增。其他taqman基因表達(dá)測定混合物從appliedbiosystems公司購買。

體外細(xì)胞增殖測定

將肉瘤細(xì)胞系在常規(guī)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，添加含有0.1％木炭剝離胎牛血清(fbs)的培養(yǎng)基并且將細(xì)胞孵育過夜。次日，用不同量的medi-573處理細(xì)胞，并且將培養(yǎng)物孵育3天。使用celltiter-glo(ctg)試劑(威斯康星州麥迪遜的promega公司)來量化增殖。

為了獲取medi-573對于igf誘導(dǎo)的增殖的影響，在37c下將medi-573或同種型對照添加到細(xì)胞達(dá)30分鐘。然后將igf-1或igf-2添加到適當(dāng)?shù)目撞⑶曳跤?天。使用ctg試劑來量化增殖。

用于pigf-1r、pir-a、以及pakt的測定

將肉瘤細(xì)胞系在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，將含有0.1％木炭剝離胎牛血清(fbs)的培養(yǎng)基添加到培養(yǎng)物并且將培養(yǎng)物孵育過夜。次日，用不同治療處理細(xì)胞5分鐘。去除培養(yǎng)基；將細(xì)胞洗滌并且用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的1.0％tritonx裂解緩沖液裂解。將大約8-20μg總蛋白加載到msd96孔multi-spot板上，并且使用胰島素信號傳導(dǎo)布板(insulinsignalingpanel)(總蛋白)和胰島素信號傳導(dǎo)布板(磷蛋白)全細(xì)胞裂解物試劑盒根據(jù)制造商的方案來確定總的和磷酸化igf-1r、ir-a以及irs-1蛋白的水平。使用磷酸(ser473)/總akt測定全細(xì)胞裂解物試劑盒根據(jù)制造商的方案來確定總的和磷酸化akt的水平。

小鼠的異種移植物研究

對于體內(nèi)療效研究，將在50％基質(zhì)膠中的五百萬個肉瘤細(xì)胞皮下接種到每個雌性無胸腺裸鼠中。當(dāng)腫瘤達(dá)到接近150-200mm³時，將小鼠隨機(jī)分組(每組10只小鼠)。以指定的劑量每周兩次腹膜內(nèi)給予medi-573。azd2014的給藥方案為每天口服一次，雷帕霉素的給藥方案為每3天進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。每周兩次用卡尺測量腫瘤體積。在研究的最后一天，相對于對照組的初始和最終平均腫瘤體積來計算腫瘤生長抑制。

對于作用(moa)研究的體內(nèi)機(jī)制，當(dāng)腫瘤達(dá)到接近大約400mm³時，給予一個單次劑量的medi-573。在給藥4h后，收集腫瘤和血漿樣品以評估m(xù)edi-573對于自分泌igf信號傳導(dǎo)的影響。在另一個組的小鼠中，在medi-573給藥6h后，通過尾靜脈注射人igf-1或igf-2。在igf注射15min后，收集腫瘤和血漿樣品以評估m(xù)edi-573對于igf-1/-2誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的影響。

其他實(shí)施例

從前述說明中，將顯而易見的是，可以對本文所述的發(fā)明作出變更和修改以使其適應(yīng)于各種用途和狀況。這樣的實(shí)施例也在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

在變量的任何定義中對要素清單的引用在本文中包括將所述變量定義為任何單個要素或所列要素的組合(或次組合)。在此的實(shí)施例的詳述包括作為任何單個實(shí)施例或與任何其他實(shí)施例或其部分結(jié)合的實(shí)施例。

本說明書中提及的全部專利、出版物、cas、及登錄號通過引用方式以相同的程度結(jié)合在此，如同專門且個別地指出通過引用的方式結(jié)合每份單獨(dú)的專利、出版物、及登錄號。