背景技術(shù)：
：口蹄疫(fmd)為一種對包括家畜(牛、豬、綿羊、山羊等)和多種野生動物的偶蹄類動物傳染性極強的病毒疾病。在感染fmdv牛中最顯著的疾病癥狀包括口腔、舌頭、乳頭和腳上皮細(xì)胞的囊泡病變。盡管一些國家(其中美國、加拿大、墨西哥、澳大利亞和歐洲的大部分)被認(rèn)為是無fmd，但疾病已經(jīng)遍布全球并且對出口行業(yè)具有極大的經(jīng)濟影響。實際上，在過去十年間幾乎在每一個大陸上都發(fā)生過若干次對經(jīng)濟具有破壞性的爆發(fā)。必需在昂貴的生物控制設(shè)施中通過使大量(數(shù)千升)的經(jīng)調(diào)適以在細(xì)胞中生長的毒性fmdv生長來生產(chǎn)目前殺死的抗原fmdv疫苗，這有時是困難的。此方法已造成毒性病毒從制造設(shè)施中漏出，從而在牲畜中引發(fā)高代價的爆發(fā)(參見cottam等人2008.《公共科學(xué)圖書館病原體(plospathogen)》4:1-8)。在生長之后，然后使用化學(xué)品滅活病毒并且制備抗原濃縮物，之后進(jìn)行除去污染蛋白所需的純化步驟。難以通過血清學(xué)診斷測試區(qū)分受感染的動物與已接種疫苗的動物(diva)。在血清型和亞型上幾乎沒有交叉保護，而是需要疫苗和傳播野外病毒株之間適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)匹配來實現(xiàn)保護。盡管疫苗的這些缺點，但是每年在全世界范圍內(nèi)仍制造數(shù)十億劑量。疫苗的使用已經(jīng)成為從歐洲根除fmdv和在世界的許多地方通過大規(guī)模接種疫苗行動來控制疾病的基礎(chǔ)。產(chǎn)生含有骨架和合適限制位點的經(jīng)基因工程改造的病毒部分地解決滅活疫苗的缺點，因為限制位點為引入不同fmd病毒株的衣殼蛋白提供基因位點。盡管如此，抗原的成本是fmd和大部分其它疫苗的成本的最大貢獻(xiàn)因素。fmd控制問題通過病毒續(xù)留(viruspersistence)現(xiàn)象而進(jìn)一步加劇。簡單來說，歷史上，滅活fmd疫苗已不能夠預(yù)防續(xù)留或攜帶狀態(tài)(被定義為感染和/或暴露后在28天后病毒排出)。排毒的動物，盡管未呈現(xiàn)任何fmd癥狀，但可仍然為其它動物的fmd感染源。因而，通常認(rèn)可的疾病控制操作需要屠宰已接種疫苗的畜群中的所有動物，即使它們沒有疾病的臨床征象。因而，仍期望產(chǎn)生具有較低抗原負(fù)載量而不損害效率和/或降低或消除fmd續(xù)留的疫苗的方法和組合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：在一個方面中，本發(fā)明提供一種包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物，其中佐劑組分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、免疫刺激寡核苷酸以及聚陽離子聚合物；鋁源；并且抗原組分包含量等效于每劑量0.5μg到8μg的fmd病毒的fmd抗原組合物。在某些實施例中，免疫刺激寡核苷酸為含有cpg的寡核苷酸。在某些實施例中，聚陽離子聚合物為deae葡聚糖。在不同實施例中，抗原為fmd病毒組合物，并且以每劑量0.5μg到4μg，或每劑量0.5μg到2μg，或每劑量0.5μg到1μg的量，或以每劑量約0.5μg的量存在。fmd病毒可被滅活或減毒。在某些實施例中，fmd病毒為滅活fmda24cruzeiro病毒株。在所選擇的實施例中，滅活病毒株為經(jīng)基因工程改造的病毒株，其缺失前導(dǎo)編碼區(qū)(ll)并且任選地含有陰性抗原標(biāo)記。在某些實施例中，經(jīng)基因工程改造的病毒含有來自異源病毒株的衣殼蛋白。在另一方面中，本發(fā)明提供一種在有需要的動物中預(yù)防fmd的方法，所述方法包含向所述動物投與根據(jù)先前方面的實施例的免疫原性組合物。在不同實施例中，動物選自牛類、綿羊類、豬類和山羊類。在另一方面中，本發(fā)明提供一種在感染fmd的反芻動物中降低fmd續(xù)留頻率的方法，所述方法包含在感染之前向所述反芻動物投與包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物，其中佐劑組分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原。在又一方面中，本發(fā)明提供一種畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的動物投與包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物，其中佐劑組分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原，其中，在疑似與fmd感染接觸后，不屠宰畜群的已接種疫苗成員。本發(fā)明還提供一種畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的動物投與包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物，其中佐劑組分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原，其中，在疑似與fmd感染接觸后，將畜群的已接種疫苗成員隔離0到62天。本發(fā)明還提供一種畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的動物投與包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物，其中佐劑組分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原，其中，在疑似與fmd感染接觸后，將畜群的已接種疫苗成員移出感染區(qū)。附圖說明圖1示出peg沉淀的抗原與中空纖維濃縮的抗原之間的品質(zhì)差異。具體實施方式定義“約”或“大致”當(dāng)與可測量數(shù)值變量結(jié)合使用時是指所述變量的指示值并且是指在指示值的實驗誤差內(nèi)(例如，在平均值的95％置信區(qū)間內(nèi))或在指示值的10％內(nèi)的變量的所有值，無論哪個更大，除非約參考以周為單位的時間間隔使用，否則其中“3周”為17到25天，并且約2到約4周為10到40天。“佐劑”意指提高對抗原的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。佐劑一般用于實現(xiàn)兩個目標(biāo)：抗原從注射部位的控制釋放和免疫系統(tǒng)的刺激?！翱贵w”是指由于對特異性抗原的免疫應(yīng)答可結(jié)合到所述特異性抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”區(qū)和“可變”區(qū)的“輕”和“重”多肽鏈構(gòu)成的血清蛋白，并且基于恒定區(qū)的組成而分類(例如，iga、igd、ige、igg和igm)?！翱乖被颉懊庖咴笔侵副粍游锏拿庖呦到y(tǒng)識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。所述術(shù)語包括經(jīng)殺死、滅活、減毒或修飾的活細(xì)菌、病毒或寄生蟲。術(shù)語“抗原”還單獨地或以其任何組合包括多核苷酸、多肽、重組蛋白、合成肽、蛋白質(zhì)提取物、細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)、組織、多糖或脂質(zhì)或其片段。術(shù)語抗原還包括如抗個體基因型抗體或其片段的抗體，和可模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽模擬表位?！熬彌_液”意指防止另一種化學(xué)物質(zhì)的濃度變化的化學(xué)體系，例如，質(zhì)子供體和受體體系充當(dāng)防止氫離子濃度(ph)顯著變化的緩沖液。緩沖液的另一個實例為含有弱酸和其鹽(共軛堿)或弱堿和其鹽(共軛酸)的混合物的溶液。如應(yīng)用于佐劑制劑的“主要組成”是指不含有以所述藥劑發(fā)揮可測量輔助或免疫調(diào)節(jié)作用量的未列出的附加輔助劑或免疫調(diào)節(jié)劑的制劑?！皠┝俊笔侵附o予受試者的疫苗或免疫原性組合物?！暗谝粍┝俊被颉耙l(fā)疫苗”是指在第0天給予的此類組合物的劑量?！暗诙┝俊被颉暗谌齽┝俊被颉澳陝┝俊笔侵冈诘谝粍┝恐蠼o予的此類組合物的量，其可為或可不為與第一劑量相同的疫苗或免疫原性組合物。術(shù)語“乳化劑”在本發(fā)明中廣泛地使用。其包括公認(rèn)為乳化劑的物質(zhì)，例如，或產(chǎn)品線的不同產(chǎn)品(分別為聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯和經(jīng)脂肪酸取代的脫水山梨糖醇表面活性劑)和不同溶解度增強劑如peg-40蓖麻油或另一種聚乙二醇化氫化油?！绑w液免疫應(yīng)答”是指通過抗體介導(dǎo)的一種免疫應(yīng)答。受試者的“免疫應(yīng)答”是指對抗原的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究。免疫應(yīng)答通?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析和中和分析來測定。抗原的“免疫有效量”或“產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有效量”為在受體中有效誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的量。免疫原性應(yīng)答可足以用于診斷目的或其它測試，或可足以預(yù)防疾病的征象或癥狀，包括由疾病藥劑感染引起的不良健康影響或其并發(fā)癥?？烧T導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)免疫中的一者或兩者。動物對免疫原性組合物的免疫原性應(yīng)答可例如，間接通過測量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖分析，或直接通過監(jiān)測在用野生型病毒株攻擊之后的征象和癥狀來評估，而由疫苗賦予的保護性免疫可通過測量例如如死亡率、發(fā)病率、溫度數(shù)值的臨床征象的降低、受試者的總體生理狀態(tài)和總體健康和表現(xiàn)來評估。免疫應(yīng)答可包含但不限于誘導(dǎo)細(xì)胞和/或體液免疫。“免疫原性”意指誘發(fā)免疫或抗原應(yīng)答。因此，免疫原性組合物將為誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何組合物。“受感染場所”是指其中基于實驗室結(jié)果、相容性臨床征象、fmd病例定義和國際標(biāo)準(zhǔn)存在假定的陽性病例或確認(rèn)的陽性病例的場所。“受感染區(qū)”是指超出假定或確認(rèn)的受感染場所周邊3km內(nèi)的區(qū)域?！爸|(zhì)”是指一組包括脂肪、油、蠟、固醇和甘油三酯的有機化合物中的任一種，其不溶于水但可溶于非極性有機溶劑、觸摸為油性的并且與碳水化合物和蛋白質(zhì)一起構(gòu)成活細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)材料?！搬t(yī)藥學(xué)上可接受的”是指物質(zhì)在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適用于與受試者的組織接觸而無不當(dāng)毒性、刺激、過敏反應(yīng)等，與合理的效益-風(fēng)險比相稱，并且對其預(yù)定用途有效?！皌cid50”是指“組織培養(yǎng)物感染性劑量”并且被定義為感染50％給定批次的接種細(xì)胞培養(yǎng)物所需的病毒稀釋度。多種方法可用于計算tcid50，包括在整個本說明書中利用的斯皮爾曼-卡勃方法(spearman-karbermethod)。對斯皮爾曼-卡勃方法的描述參見b.w.mahy和h.o.kangro,《病毒學(xué)方法指南(virologymethodsmanual)》,第25-46頁(1996)。持續(xù)感染或攜帶者動物為在感染臨床疾病或臨床疾病發(fā)病后在28天后排出fmd病毒的動物。佐劑制劑和制備方法本申請案公開適合于本發(fā)明的若干種佐劑制劑。這些佐劑的常見特征為存在油和一種或多種乳化劑，其中油相占包圍其中公開的佐劑調(diào)配物的疫苗組合物的至少50％。多種油和其組合適用于本發(fā)明。這些油包括但不限于動物油、植物油以及不可代謝的油。適于本發(fā)明的植物油的非限制性實例為玉米油、花生油、大豆油、椰子油和橄欖油。動物油的非限制性實例為角鯊?fù)?。不可代謝的油的合適的非限制性實例包括輕礦物油、直鏈或支鏈飽和油等。在一組實施例中，用于本發(fā)明的佐劑制劑中的油為輕礦物油。如本文所用，術(shù)語“礦物油”是指經(jīng)由蒸餾技術(shù)從礦脂獲得的液體烴的混合物。所述術(shù)語與“液化石蠟”、“液體礦脂”和“白色礦物油”同義。所述術(shù)語還旨在包括“輕礦物油”，“即，類似地通過礦脂的蒸餾獲得的油，但其具有比白色礦物油略微低的比重”。參見，例如，《雷明頓的藥物科學(xué)(remington'spharmaceuticalsciences)》,第18版(賓夕法尼亞州伊斯頓(easton,pa.)：馬克出版公司(mackpublishingcompany),1990,第788頁和1323頁)。礦物油可從各種商業(yè)來源獲得，例如j.t.baker(賓夕法尼亞州菲利普斯堡(phillipsburg,pa))、usb公司(俄亥俄州克利夫蘭(cleveland,ohio))。優(yōu)選的礦物油為可以名稱商購的輕礦物油。在特別適合于預(yù)防或消除fmd續(xù)留的某些實施例中，油相以按體積計50％到95％的量；優(yōu)選地，以大于50％到85％的量；更優(yōu)選地，以大于50％到60％的量，并且更優(yōu)選地以大于疫苗組合物的50％v/v到52％v/v的量存在。油相包括油和乳化劑(例如，80、80等)，如果存在任何此類乳化劑的話。油相的體積被計算為油和一種或多種乳化劑的體積的總和。因此，舉例來說，如果油的體積為組合物的40％并且一種或多種乳化劑的體積為組合物的12％，那么油相將以組合物的52％v/v存在。類似地，如果油以約45％的量存在并且一種或多種乳化劑以組合物的約6％的量存在，那么油相以組合物的約51％v/v存在。還應(yīng)理解，由于本發(fā)明的佐劑僅形成本發(fā)明疫苗的一部分，所以油相以按體積計50％到95％的量；優(yōu)選地，以大于50％到85％的量；更優(yōu)選地，以50％到60％的量，并且更優(yōu)選地以本發(fā)明佐劑中的每一種的50％v/v到52％v/v的量存在。在實施例的變換實施例中，油和油溶性乳化劑在一起的體積百分比為按體積計至少50％，例如，50％到95％；優(yōu)選地，以大于50％到85％的量；更優(yōu)選地，以50％到60％的量，并且更優(yōu)選地以疫苗組合物的50％v/v到52％v/v的量。因此，舉例來說但不限于，油可以45％的量存在并且脂溶性乳化劑將以大于5％v/v的量存在。因此，油和油溶性乳化劑在一起的體積百分比將為至少50％。在適用于本發(fā)明的所有疫苗的又一變換實施例中，油的體積百分比為按體積計超過疫苗組合物的40％，例如，40％到90％；40％到85％；43％到60％，44％v/v到50％v/v。適用于本發(fā)明乳液的乳化劑包括天然生物相容性乳化劑和非天然合成表面活性劑。生物相容性乳化劑包括磷脂化合物或磷脂的混合物。優(yōu)選的磷脂為磷脂酰膽堿(卵磷脂)，如大豆卵磷脂或蛋卵磷脂?？赏ㄟ^水洗滌粗植物油并且分離并干燥所得水合膠狀物獲得作為磷脂和甘油三酯的混合物的卵磷脂?？赏ㄟ^分餾在經(jīng)由丙酮洗滌去除甘油三酯和植物油之后殘留的丙酮不可溶磷脂和糖脂的混合物來獲得精煉產(chǎn)物?？商娲兀蚜字蓮母鞣N商業(yè)來源獲得。其它合適的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰環(huán)己六醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰乙醇胺。磷脂可從天然來源中分離或常規(guī)地合成。在附加實施例中，本文所用的乳化劑不包括卵磷脂，或以免疫無效的量使用卵磷脂。適用于本發(fā)明的佐劑制劑的非天然、合成乳化劑包括基于脫水山梨糖醇的非離子表面活性劑，例如經(jīng)脂肪酸取代的脫水山梨糖醇表面活性劑(可以名稱或商購)、聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯來自如蓖麻油來源的脂肪酸的聚乙二醇酯聚乙氧基化脂肪酸(例如，可以名稱m-53獲得的硬脂酸)、聚乙氧基化異辛基苯酚/甲醛聚合物聚氧乙烯脂肪醇醚聚氧乙烯非苯基醚(n)、聚氧乙烯異辛基苯基醚(x)。優(yōu)選的合成表面活性劑為可以名稱和獲得的表面活性劑，如-80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)和-80(脫水山梨糖醇單油酸酯)。一般來說，一種或多種乳化劑可以按體積計0.01％到40％，優(yōu)選地，0.1％到15％，更優(yōu)選地2％到10％的量存在于疫苗組合物中。存在于本發(fā)明佐劑制劑中的附加成分包括陽離子載體、免疫刺激寡核苷酸、單磷脂a和其類似物(mpl-a)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚i:c)、皂苷、季銨、固醇、糖脂、鋁源(例如，或vac濕凝膠)和其組合。合適的陽離子載體包括但不限于葡聚糖、葡聚糖deae(和其衍生物)、peg、瓜爾豆膠、殼聚糖衍生物、聚纖維素衍生物比如羥基乙基纖維素(hec)聚乙烯亞胺、聚氨基酸(比如聚賴氨酸)等。合適的免疫刺激寡核苷酸包括odn(基于dna)、orn(基于rna)寡核苷酸或嵌合odn-orn結(jié)構(gòu)，其可具有經(jīng)修飾的骨架，包括但不限于硫代磷酸酯修飾、鹵化、烷基化(例如，乙基或甲基修飾)和磷酸二酯修飾。在一些實施例中，可使用聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物(聚i:c)。cpg寡核苷酸為近來描述的一類藥物治療劑，其特征在于在特異性堿基-序列背景(cpg基序)中存在未甲基化的cg二核苷酸。(hanseltt,barnespj(編):《用于哮喘、過敏和copd的新藥(newdrugsforasthma,allergyandcopd)》.《呼吸研究進(jìn)展(progrespirres.)》basel,karger,2001,第31卷,第229-232頁，其以引入的方式并入本文中)。這些cpg基序未見于真核dna中，其中cg二核苷酸被抑制并且當(dāng)存在時通常甲基化，但存在于它們賦予免疫刺激特性的細(xì)菌dna中。在所選擇的實施例中，本發(fā)明的佐劑利用所謂的p類免疫刺激寡核苷酸，更優(yōu)選地經(jīng)修飾的p類免疫刺激寡核苷酸，甚至更優(yōu)選地經(jīng)e-修飾的p類寡核苷酸。p類免疫刺激寡核苷酸為cpg寡核苷酸，其特征在于存在回文序列，一般6到20個核苷酸長。p類寡核苷酸具有在活體外和/或活體內(nèi)自發(fā)地自組裝成多聯(lián)體的能力。這些寡核苷酸嚴(yán)格說來是單股的，但回文序列的存在允許形成多聯(lián)體或可能地莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。p類免疫刺激寡核苷酸的總長度為19和100個核苷酸之間，例如，19到30個核苷酸、30到40個核苷酸、40到50個核苷酸、50到60個核苷酸、60到70個核苷酸、70到80個核苷酸、80到90個核苷酸、90到100個核苷酸。在本發(fā)明的一個方面中，免疫刺激寡核苷酸含有5'tlr活化域和至少兩個回文區(qū)，一個回文區(qū)為至少6個核苷酸長的5'回文區(qū)并且直接或通過間隔子連接到至少8個核苷酸長的3'回文區(qū)。p類免疫刺激寡核苷酸可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來修飾。舉例來說，j-修飾是指經(jīng)碘修飾的核苷酸。e-修飾是指一種或多種經(jīng)乙基修飾的核苷酸。因此，經(jīng)e-修飾的p類免疫刺激寡核苷酸為其中至少一個核苷酸(優(yōu)選地5'核苷酸)被乙基化的p類免疫刺激寡核苷酸。附加修飾包括6-硝基-苯并咪唑的附接、o-甲基化、用proynyl-du修飾、肌苷修飾、2-溴乙烯基附接(優(yōu)選地附接到尿苷)。p類免疫刺激寡核苷酸還可含有經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，包括但不限于磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵。本發(fā)明的寡核苷酸可被合成或從商業(yè)來源獲得。p類寡核苷酸和經(jīng)修飾的p類寡核苷酸進(jìn)一步公開于公布的pct申請案第wo2008/068638號中，其在2008年6月12日公布。經(jīng)修飾的p類免疫刺激寡核苷酸的合適的非限制性實例在下文提供(“*”是指硫代磷酸酯鍵并且“-”是指磷酸二酯鍵)。seqidno:15't*c-g*t*c-g*a*c-g*a*t*c-g*g*c*g*c-g*c*g*c*c*g3'seqidno:25't*c-g*a*c*g*t*c*g*a*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g3'seqidno:35't*c*g*a*c*g*t*c*g*a*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g*t3'seqidno:45'ju*c-g*a*c*g*t*c*g*a*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g3'seqidno:55'ju*c-g*a*c*g*t*c*g*a*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g*t3'seqidno:65'ju*c*g*a*c*g*t*c*g*a*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g*t3'seqidno:75'eu*c-g*a*c*g*t*c*g*a*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g3'seqidno:85'ju*c-g*t*c*g*a*c*g*a*t*c*g*g*c*g*g*c*c*g*c*c*g*t3'seqidno:95'ju*c*g*t*c*g*a*c*g*a*t*c*g*g*c*g*g*c*c*g*c*c*g*t3'seqidno:105't*c-g*t*c-g*a*c-g*a*t*c-g*g*c*g*c-g*c*g*c*c*g3'seqidno:115'-uuguuguuguuguuguuguu-3'seqidno:125'-uuauuauuauuauuauuauu-3'seqidno:135'-aaacgcucagccaaagcag-3'seqidno:14dtdcdgdtdcdgdtdtdtdtrgrururgrurgrudtdtdtdt-3'用于佐劑組合物的p類免疫刺激寡核苷酸的量取決于所用的p類免疫刺激寡核苷酸和預(yù)期物質(zhì)的性質(zhì)。除了油和一種或多種乳化劑以外，佐劑制劑還包含(或主要由以下組成，或由以下組成)免疫刺激寡核苷酸和聚陽離子載體的組合。這些佐劑被稱作“txo”。在一組實施例中，txo佐劑還可包括鋁源，如al(oh)3凝膠。具有鋁的txo佐劑被稱作“txo-a”。在一組實施例中，佐劑txo和txo-a可任選地含有固醇，如例如，膽固醇、羊毛固醇、豆甾醇等。含有固醇的txo和txo-a佐劑分別被稱作tcxo和tcxo-a。任選存在的固醇可以每劑量高達(dá)約1000μg(例如，100μg到1000μg、200μg到1000μg、250μg到700μg或約400μg到500μg)的量存在。在一組實施例中，在txo佐劑中，免疫刺激寡核苷酸，優(yōu)選地odn，其優(yōu)選地含有回文序列并且任選地具有經(jīng)修飾的骨架，可以每劑量5μg到400μg的量存在，并且聚陽離子載體可以每劑量5mg到400mg的量存在。舉例來說，在某些實施例中，一劑量的txo將包含每劑量約5μg和400μg之間(例如，每劑量6.25μg到200μg或6.25μg到100μg或6.25μg到50μg或6.25μg到25μg或6.25μg到10μg或10μg到200μg或25μg到200μg或25μg到100μg或25μg到50μg或25μg到100μg或50μg到100μg)的免疫刺激寡核苷酸，并且聚陽離子載體可以每劑量約5mg和約500mg之間(例如，每劑量6.25mg到200mg或6.25mg到100mg或6.25mg到50mg或6.25mg到25mg或6.25mg到10mg或10mg到200mg或25mg到200mg或25mg到100mg或25mg到50mg或25mg到100mg或50mg到100mg)的量存在。在某些實施例中，txo佐劑制備如下：a)將脫水山梨糖醇單油酸酯溶解于輕礦物油中。所得油溶液經(jīng)無菌過濾；b)將免疫刺激寡核苷酸、葡聚糖deae和聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯溶解于水相中，因此形成水溶液；和c)在連續(xù)均勻化下將水溶液添加到油溶液中，因此形成佐劑制劑txo。在一組實施例中，在txo-a佐劑中，免疫刺激寡核苷酸作為存在于txo佐劑中，鋁源以高達(dá)40％v/v(例如，35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％)的量存在。在一組實施例中，鋁源以疫苗組合物的2％v/v到20％v/v，更優(yōu)選地以約5％v/v和約17％v/v之間存在。在某些實施例中，txo-a佐劑以類似于txo佐劑制備，并且將鋁源添加到水溶液中。在制備tcxo和tcxo-a佐劑中，將膽固醇溶解于油溶液中，并且制備tcxo和tcxo-a的其它步驟分別類似于制備txo和txo-a中使用的步驟?？乖景l(fā)明人已出人意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的佐劑甚至當(dāng)抗原的劑量從10μg的fmd病毒降低到0.5μg時還能夠足夠的預(yù)防口蹄疫疾病。因此，在本發(fā)明的不同實施例中，fmd病毒的量可為0.5μg、約1μg、約2μg、約3μg、約4μg、約5μg、約6μg、約7μg、約8μg、約9μg或約10μg?？乖牧靠蔀樵?.5μg和1μg之間、在1μg和2μg之間、在2μg和3μg之間、在3μg和4μg之間、在4μg和5μg之間、在5μg和6μg之間、在6μg和8μg之間、在8μg和10μg之間的fmd病毒(140s顆粒)。當(dāng)前，已分離出七種血清型的fmd。在此病毒的七種血清型中，a、c、o、asia1和sat3似乎為不同的譜系；sat1和sat2為未解析的進(jìn)化枝。在每種血清變型內(nèi)，存在多種病毒株。舉例來說，a24cruzeiro屬于血清型a，并且o1campos屬于血清型o。任何血清型的fmd病毒可用作本發(fā)明中的抗原，其條件是此類病毒不是致病性的。致病性可通過滅活病毒例如，用甲醛或bei處理來降低。在某些實施例中，病毒可通過培養(yǎng)物傳代或經(jīng)由重組方式來減毒。先前已證實，舉例來說，在牛和豬中前導(dǎo)蛋白lpro編碼區(qū)的缺失產(chǎn)生減毒的fmd病毒。參見，例如，us5,824,316、us8,765,141，《病毒學(xué)(virology)》1997227(1):96-102,j.virol201286:11675-11685。在l蛋白的sap域內(nèi)的位置55和58處的點突變還產(chǎn)生活的病毒，所述病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中呈現(xiàn)輕度減毒的表現(xiàn)型并且在豬fmd模型中為保護性的。參見美國專利第8,846,057號。在某些實施例中，病毒還含有允許diva(區(qū)分受感染的動物與已接種疫苗的動物)分析的陰性抗原標(biāo)記。在某些實施例中，將陰性抗原標(biāo)記引入到3d和/或3b蛋白。參見，例如，seqidno19、seqidno20、seqidno21、seqidno22。如同其它病毒，fmd病毒不斷地進(jìn)化和突變，因此接種抵抗其的困難之一為血清型之間和甚至血清型內(nèi)的巨大變化。在血清型之間不存在交叉保護(用于一種血清型的疫苗將不必針對任何其它疫苗進(jìn)行保護)并且此外，在給定血清型內(nèi)的兩種病毒株對于給定基因可具有不同多達(dá)30％的核苷酸序列。這意味著fmd疫苗必須對所涉及的病毒株具有高度特異性。因此，在某些實施例中，將核酸內(nèi)切酶限制位點引入到病毒的基因組中，從而允許引入來自異源fmd病毒株的蛋白(例如，形成外衣殼的蛋白)。在某些實施例中，抗原組分包含fmd病毒株a24cruzeiro，其可任選地通過在3b和/或3d蛋白中缺失前導(dǎo)蛋白、陰性標(biāo)記突變體和通過引入限制性核酸內(nèi)切酶位點以便更容易引入來自異源病毒株的抗原(例如，衣殼蛋白)的序列來修飾。抗原的合適的非限制性實例描述于us8,765,141中。對應(yīng)于遺傳修飾fmdv的rna基因組的dna序列還提供于seqidno:15(a24ll3dyr)和seqidno:17(a24ll3bpvkv3dyr)中。因此，與闡述于例如seqidno:15中的dna序列互補的dna序列為fmdv病毒的rna基因組(即，編碼fmdv的rna)的模板，即與fmdv病毒的rna基因組互補或“編碼”fmdv病毒的rna基因組。在某些實施例中，病毒包含異源fmd病毒株(即，除a24cruzeiro以外的fmd的病毒株，包括但不限于譜系c、o、asia1、sat3、sat1和sat2、turkey06的病毒株和譜系a的其它病毒株)的一種或多種衣殼蛋白。此類異源抗原的非限制性實例示出在seqidno:23(asia1-a24ll3bpvkv3dyr)和seqidno:24(a/turkey/06-a24ll3bpvkv3dyr)中。另外，o1campos-a24ll3bpvkv3dyr(全基因組，也被稱作o1campos)、c3indaial-a24ll3bpvkv3dyr(全基因組)和衣殼argentina2001iso93(衣殼和2a部分序列)分別提供于seqidno25、seqidno26和seqidno27中。還設(shè)想了此類抗原的變體。運用使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)描述的比對程序中的一種，變體與參考序列至少80％相同(例如，85％相同、90％相同、95％相同、96％相同、97％相同、98％相同或99％相同)。多個比對工具可用于確定序列一致性，包括但不限于blast、clustal或philip。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，這些值可適當(dāng)?shù)卣{(diào)整，以便通過考慮密碼簡并、氨基酸類似性、閱讀框定位等，確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)一致性。在某些實施例中，變體涵蓋不止特異性示例性核苷酸或氨基酸序列并且包括其功能等效物。引起在給定位點處產(chǎn)生化學(xué)等效氨基酸但不影響編碼的多肽的功能特性的核酸片段的改變在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因此，用于氨基酸丙氨酸、疏水性氨基酸的密碼子可由編碼另一種疏水性較差的殘基(如甘氨酸)或疏水性較強的殘基(如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，引起一種帶負(fù)電殘基取代另一種殘基(如天冬氨酸取代谷氨酸)或一種帶正電荷殘基取代另一種殘基(如賴氨酸取代精氨酸)的變化還可預(yù)期產(chǎn)生功能上等效的產(chǎn)物。引起多肽分子的n端和c端部分改變的核苷酸變化還將預(yù)期不改變多肽的活性。所提出的修飾中的每一種修飾在本領(lǐng)域的常規(guī)技能內(nèi)都是良好的，正如確定所編碼產(chǎn)物生物活性的保持力。本發(fā)明的多肽可以不同方式改變，包括氨基酸取代、缺失、截斷和插入?？赏ㄟ^合并本發(fā)明的蛋白質(zhì)的單元和片段以及其它蛋白質(zhì)來形成具有所關(guān)注特性的新穎蛋白質(zhì)。用于此類操控的方法一般在本領(lǐng)域中是已知的。因此，本發(fā)明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突變體形式兩者。同樣地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)涵蓋天然存在的蛋白質(zhì)以及其變異體和經(jīng)修飾形式。此類變體將繼續(xù)具有父代fmd病毒的所需經(jīng)修飾的活性。將在編碼變體的dna中作出的突變不得將序列放置在閱讀框之外并且優(yōu)選地將不形成可產(chǎn)生二級mrna結(jié)構(gòu)的互補區(qū)。生長和純化適合于本發(fā)明的抗原的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且包括但不限于中空纖維過濾和peg沉淀。這些方法在某種程度上產(chǎn)生不同的抗原組合物。舉例來說，在peg沉淀中，抗原組合物耗盡非結(jié)構(gòu)蛋白。在其它方法如例如中空纖維過濾中，抗原組合物含有結(jié)構(gòu)fmd蛋白和非結(jié)構(gòu)fmd蛋白兩者。因此，在一些實施例中，fmd抗原包含結(jié)構(gòu)蛋白。在如例如其中fmd抗原通過中空纖維過濾制備的其它實施例中，fmd抗原包含結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩者，特別是3d蛋白。使用不含區(qū)分已接種疫苗動物與受感染動物的內(nèi)部抗原標(biāo)記，去除非結(jié)構(gòu)蛋白的目前疫苗平臺為期望的，因為由于非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在可識別受感染動物的事實，所以這仍是期望的。然而，在fmdll3b3d平臺的情況下，在抗原制備中非結(jié)構(gòu)蛋白的存在不妨礙區(qū)分已接種疫苗動物與受感染動物。在這種背景下，包括非結(jié)構(gòu)蛋白和佐劑的本發(fā)明抗原制劑以比經(jīng)純化抗原制劑低的劑量提供兩種針對臨床疾病的保護并且在反芻動物中還更有效地防止持續(xù)感染的建立。組合物本發(fā)明的組合物可遵循公認(rèn)慣例來調(diào)配以包括用于動物(包括人類)的可接受載體，例如標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑和/或增溶劑，并且也可經(jīng)調(diào)配以促進(jìn)持續(xù)釋放。稀釋劑包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等滲性的添加劑尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白。其它合適的媒劑和添加劑，包括尤其適用于調(diào)配經(jīng)修飾的活疫苗的那些，對本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是已知的或?qū)⑹乔宄摹⒁?，例如，《雷明頓的藥物科學(xué)(remington'spharmaceuticalscience)》,第18版,1990,馬克出版(mackpublishing)，其以引用的方式并入本文中。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步尤其包含一種或多種附加免疫調(diào)節(jié)組分如(例如)附加佐劑或細(xì)胞因子?？捎糜诒景l(fā)明疫苗的此類附加佐劑的非限制性實例包括ribi佐劑體系(蒙大拿州漢密爾頓的瑞比公司(ribiinc.,hamilton,mont.))、弗氏(freund's)完全和不完全佐劑、嵌段共聚物(佐治亞州亞特蘭大的cytrx(cytrx,atlantaga.))、qs-21(馬薩諸塞州劍橋的劍橋生物技術(shù)公司(cambridgebiotechinc.,cambridgemass.))、saf-m(加利福尼亞州愛莫利維爾的凱龍(chiron,emeryvillecalif.))、佐劑、皂苷、quila或其它皂苷級分、單磷酰脂質(zhì)a和阿夫立定(avridine)脂質(zhì)-胺佐劑?？砂ㄔ谝呙缰械钠渌庖哒{(diào)節(jié)劑包括例如一種或多種介白素、干擾素或其它已知的細(xì)胞因子。佐劑組合物的投與途徑包括不經(jīng)腸、口服、口鼻、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、體表、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)和舌投與。任何合適的裝置可用于投與組合物，包括針筒、滴管、無針注射裝置、貼片等。所選擇供使用的途徑和裝置將取決于佐劑的組成、抗原和受試者，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。鑒于fmd的高傳染性，需要采取遏制和/或消除fmd爆發(fā)的測量受監(jiān)管機構(gòu)如例如國家農(nóng)業(yè)部(nationalministriesofagriculture)控制，并且由國際組織如oie(國際獸疫局(internationalofficeofepizootics))批準(zhǔn)。需要結(jié)合爆發(fā)進(jìn)行的測量可包括但不限于動物運動的停止、對包括奶、肉、獸皮等動物產(chǎn)品的運動的有效控制、消滅(stamping-out)策略(屠宰受感染畜群中的動物，以及在適當(dāng)情況下，已通過動物間直接接觸或通過間接接觸病原體而暴露于感染的其它畜群中的那些動物)。通常，鄰近畜群中的動物接種疫苗，隨后被屠宰。本發(fā)明人已出人意料地發(fā)現(xiàn)，本文所述的某些免疫原性組合物預(yù)防續(xù)留，所述續(xù)留被定義為在感染之后存在或排出fmd持續(xù)長于28天。在某些實施例中，此類免疫原性組合物包含抗原組分和佐劑組分，其中佐劑組分包含(或主要由以下組成或由以下組成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量至少6μg的fmd病毒的fmd抗原。在某些實施例中，抗原可以等效于每劑量6μg到20μg的fmd病毒，例如，每劑量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的fmd病毒的量存在。免疫刺激寡核苷酸的量可為例如每劑量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg。聚陽離子聚合物可以例如每劑量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。因此，本發(fā)明還提供一種在感染fmd的反芻動物中降低fmd續(xù)留頻率的方法，其包含在感染之前向所述反芻動物投與包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物，其中佐劑組分包含(或主要由以下組成或由以下組成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量至少6μg的fmd病毒的口蹄疫(fmd)抗原。在不同實施例中，抗原的量可等效于每劑量6μg到20μg的fmd病毒，例如，每劑量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的fmd病毒。免疫刺激寡核苷酸的量可為例如每劑量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg。聚陽離子聚合物可以例如每劑量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。向反芻動物(例如，牛、綿羊、駱駝等)投與這些免疫原性組合物允許改變畜群管理操作。在某些實施例中，在疑似與fmd病毒接觸之后，不屠宰畜群的已接種疫苗成員。在替代(或附加)實施例中，將已接種疫苗動物隔離一段較短時間。因此，在某些實施例中，可將疑似與fmd接觸的動物隔離少于30天，例如，28天或29天。此外，指定一個區(qū)域為封鎖區(qū)意指對來自封鎖區(qū)的動物或動物產(chǎn)品禁止運動的嚴(yán)格限制，一般來說，30天或更長。因此，在某些實施例中，可將疑似與fmd接觸的動物在距離疑似與fdm接觸的少于30天內(nèi)例如28天或29天從封鎖區(qū)中移出。在其中抗原組分需要經(jīng)基因工程改造的fmd抗原的實施例中，例如如上所述，有可能區(qū)分已接種疫苗的動物與受感染的動物。因此，在附加實施例中，畜群管理方法(或在感染fmd的反芻動物中降低fmd續(xù)留頻率的方法)。換句話說，在某些實施例中，包含抗原組分和佐劑組分的免疫原性組合物可用于畜群管理，其中佐劑組分包含(或主要由以下組成或由以下組成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性組合物的至少50％v/v)、量為每劑量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量為每劑量75mg到200mg的聚陽離子聚合物；并且抗原組分包含量等效于每劑量6μg的fmd病毒的fmd抗原，其中在疑似與fmd感染接觸后，不屠宰所述畜群的已接種疫苗成員；和/或在疑似接觸之后隔離0到30天和/或在疑似接觸的30天內(nèi)被移出感染場所。在不同實施例中，抗原的量可等效于每劑量6μg到20μg的fmd病毒，例如，每劑量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的fmd病毒。免疫刺激寡核苷酸的量可為例如每劑量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg聚陽離子聚合物可以例如每劑量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在?，F(xiàn)將在以下非限制性實例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。實例實例1.制備抗原兩種方法用于制備抗原：中空纖維過濾和peg沉淀。peg(聚乙二醇)沉淀方法已在本領(lǐng)域中已知。簡單來說，用fmd病毒感染bhk-21細(xì)胞。然后(24到36h后)，細(xì)胞通過冷凍-解凍裂解，并且通過低速離心(500xg)細(xì)胞碎片使細(xì)胞裂解物澄清。將peg添加(8％w/v)到含有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩者的上清液中。將混合物在4℃下培育12到18hr。在此培育期間，fmdv顆粒與peg締合。通過以16,000xg離心和收集含有peg和病毒的沉淀離心塊來回收抗原。丟棄含有細(xì)胞非結(jié)構(gòu)蛋白和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的上清液。然后用小體積的緩沖液洗滌結(jié)合病毒顆粒的離心塊以從peg洗脫fmdv顆粒。本文所述的附加方法是基于fmdv培養(yǎng)物上清液的中空-纖維濃度。此方法的步驟由連續(xù)過濾布置以首先從培養(yǎng)物(用fmd病毒感染并且通過冷凍-解凍裂解的bhk-21細(xì)胞)中去除細(xì)胞碎片和大的材料組成。將培養(yǎng)物材料連續(xù)地泵送通過10μm膠囊過濾器、4.5μm膠囊過濾器，然后最后通過0.8μm/0.2μm過濾器。然后使用允許小于0.01μm的顆粒流過膜的中空纖維超過濾濾芯來濃縮此濾液。fmdv顆粒和許多非結(jié)構(gòu)蛋白仍然在柱回路中而液體和較小的蛋白通過膜變成廢物。運行柱回路，直到濃縮物達(dá)到所需體積，通常十倍濃度。圖1為示出peg沉淀和中空纖維濃縮的抗原之間品質(zhì)差異的蛋白質(zhì)印跡(westernblot)。中空纖維濃縮的抗原含有大量結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，如在此圖中通過使用對蛋白3d(最大fmdv非結(jié)構(gòu)蛋白)具有特異性的抗體和對衣殼蛋白(結(jié)構(gòu)蛋白)具有特異性的抗體染色的蛋白質(zhì)印跡所示。相比之下，peg沉淀的抗原(泳道9)含有結(jié)構(gòu)蛋白但不含有可檢測水平的3d蛋白。實例2.用txo輔助的fmd疫苗的作用動物和樣品收集重180kg到230kg的六到八個月大的霍斯坦閹牛(holsteinsteers)用于本研究中。如稍后從第0天取的血清樣品確定，在接種之前，所述動物無fmdv反應(yīng)性抗體，如通過3delisa測試確定。所有28只動物共混在bsl-3-ag動物測試設(shè)施中的一個房間中。喂食動物完全日糧球?；蜍俎Ａ⒎綁K，水和鹽塊可隨意獲得。在第0天之前，使動物適應(yīng)設(shè)施五天。動物事先用bovi-shield5、300、和處理。具有連續(xù)耳標(biāo)簽數(shù)字的動物組(每組n＝4)被指派到處理組。在接種后未記錄到不良事件。在第0天(在接種之前)、第4天、第7天、第14天、第21天(在攻擊之前)、第24天、第28天、第31天和第42天從所有動物收集血清分離器血液試管以獲得血清樣品。使血清樣品保持冷凍直到在血清中和分析中測試抵抗fmdv的中和抗體的存在(報告為在50％的凹孔中中和100tcid50的同源fmdv的最終血清稀釋度的倒數(shù))或以研究抗3dpol應(yīng)答(借助于競爭酶聯(lián)免疫吸附分析(competitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay))。如oie(“陸地動物的診斷測試和疫苗手冊(manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals)”)所推薦，出于疫苗功效，通過針接種經(jīng)由皮內(nèi)經(jīng)舌(idl)途徑攻擊已接種疫苗的牛。在接種后21天，所有已接種疫苗的動物和未經(jīng)處理的動物經(jīng)idl接種10,000btid50(50％牛類動物舌部感染劑量)的同源fmdva24cruzeiro，其被分為4次接種，每次0.1ml，2,500btid50/0.1ml。在攻擊后跟蹤所有動物10天以分析如通過發(fā)熱、鼻分泌物、分泌唾液、食欲不振和/或跛行表現(xiàn)的臨床疾病的發(fā)展。在鎮(zhèn)靜(以0.22mg/kgim給予甲苯噻嗪從而在程序期間維持胸骨側(cè)臥)情況下在第21天(在接種之前)和第24天、第28天和第31天進(jìn)行臨床評估蹄囊泡的存在。用妥拉蘇林(tolazoline)，iv，以2mg/kg的劑量復(fù)原鎮(zhèn)靜劑。疫苗如實例1中所述制備抗原?？乖瓋淙芤汉?.51μg/ml通過中空纖維過濾(prepa)制備的抗原或10.26μg/ml通過peg沉淀(prepb)制備的抗原。向動物投與免疫原性組合物的細(xì)節(jié)在表1中提供。每組含有四只動物。表1.研究設(shè)計t02組到t06組的免疫原性組合物在接種的當(dāng)天均勻化并且在第0天投與到動物。續(xù)留被測量為使用病毒分離和定量rrt-pcr兩者確定的病毒(fmdv病毒rna和/或感染性fmdv)的存在或不存在。用于定量rrt-pcr的引物為如下：forward正向(seqidno:28)：gacaaaggttttgttcttggtcareverse反向(seqidno:29)：tgcgagtcctgccacggataqman探針：(fam報導(dǎo)子，tamra淬滅劑，seqidno:30)tcctttgcacgccgtgggac對fmdv的血清中和滴度匯總于表2中。表2-血清中和滴度a,b,c在α＝0.05時，在每天內(nèi)具有相同字母的處理組并非顯著不同將fmdv的征象評分為蹄囊泡的存在(1)或不存在(0)，即，在單個蹄上囊泡的存在產(chǎn)生得分1，在僅2個蹄上囊泡的存在產(chǎn)生得分2并且在4個蹄上的囊泡產(chǎn)生得分4。一旦動物得到得分4，就認(rèn)為在研究期間其具有4分。針對每個蹄和每天檢查的來自各個動物的得分在表3中示出。在表4中，呈現(xiàn)了根據(jù)任一個蹄是否為陽性的每個動物的得分的匯總。表3-fmdv囊泡評分各個動物列表*自動評分為‘1’，因為此動物的所有蹄先前在所有四個蹄上具有囊泡。表4-fmdv囊泡評分-任一蹄位置陽性*自動評分為‘是(yes)’，因為此動物的所有蹄先前在所有四個蹄上具有囊泡。在t01(陰性對照)中的所有動物都在第24天開始表現(xiàn)出蹄囊泡。在第28天和第31天，在所有t01動物中的所有蹄都發(fā)現(xiàn)具有囊泡。相比之下，除t03(用peg沉淀的2μg劑量的fmdv)外，對于每一組都觀察到全保護(即，無蹄囊泡)，其中一只動物(r14-77)在第24天、第28天和第31天得到得分1。所測試的免疫原性組合物對續(xù)留感染的作用在表5和表6中示出。續(xù)留被定義為在攻擊后28天之后在食道-咽部流體(使用“食道探管(probang)”杯獲得)中存在感染病毒或病毒rna(在接種之后第49天，如表5和表6中所示)。在表5中，示出了針對各個動物和處理組的反轉(zhuǎn)化的來自食道探管樣品的每mlfmdvrna拷貝數(shù)的最小平方均值的定量rrt-pcr結(jié)果。在表6中，食道探管樣品病毒分離測試的結(jié)果報告為陽性或陰性。由于分析的檢測限，表5中低于1.87的值被評分為‘陰性’。表5-食道探管rrt-pcr各個動物列表和反轉(zhuǎn)化的最小平方均值/處理組表6-食道探管樣品病毒分離-各個動物列表對于第1組(鹽水對照)，通過rrt-pcr對于fmdv，三只動物至少一次為陽性的，并且對于病毒分離兩只動物一直為陽性的。在t02組中，通過rrt-pcr未曾發(fā)現(xiàn)動物攜帶fmdv，但通過病毒分離發(fā)現(xiàn)一只動物(r14-74)僅在單個時間點(第42天：攻擊后第21天)為陽性，但其后為陰性(第49天：和第52天，指示不存在持續(xù)感染。在第38天和超出第38天，在t02中的其它動物并未攜帶可通過rrt-pcr或通過病毒分離分析檢測的fmdv。在t03組中，一只動物(r14-79)得到完全保護而免遭fmdv感染，兩只動物證實在測試天數(shù)中的三天或四天存在fmdv(通過rrt-pcr或通過病毒分離分析)，并且一只動物(r14-77)通過在第38天和第42天的兩個測試證實fmdv存在，但其后不存在fmdv。在t04組中，通過第52天的一個或兩個測試，所有四只動物都表現(xiàn)出fmdv續(xù)留。在t05組中，一只動物(r14-62)通過rrt-pcr僅在第38天證實存在病毒，但通過病毒分離證實不存在病毒，并且其后通過任一測試都未檢測到病毒。對于t05組中的其它三只動物在任何時間通過rrt-pcr或通過病毒分離分析都未檢測到fmdv。在t06組中，兩只動物得到完全保護而免遭續(xù)留，而其它兩在檢測的每一時間點都為rrt-pcr或病毒分離陽性。在t07組中，四只動物中的三只得到完全保護，而一只動物(r14-71)對于rrt-pcr和病毒分離兩者在每一時間點都為陽性的。表7概括續(xù)留實驗的結(jié)果。如果在第49天(攻擊后28天)和第52天(攻擊后第31天)rrt-pcr或病毒分離分析都未檢測到fmdv，那么認(rèn)為動物是非續(xù)留的。表7續(xù)留和非續(xù)留頻率處理續(xù)留％非續(xù)留％t01(鹽水)5050t02(fmdvpeg沉淀-8μg)0100t03(fmdvpeg沉淀-2μg)5050t04(fmdvpeg沉淀-0.5μg)1000t05(fmd中空纖維-8μg)0100t06(fmdv中空纖維-2μg)5050t07(fmdv中空纖維-0.5μg)2575投與8μg抗原的八只動物(t02組和t05組)中的僅兩只表現(xiàn)出存在病毒，并且僅一天存在病毒(一天分別在第37天和第42天)。這些組中的其它動物完全得到保護考慮到在感染之后28天和31天均未檢測到病毒存在，投與8μg抗原的動物中無一者被認(rèn)為是持續(xù)感染。投與2μg抗原的八只動物(t03組和t06組)中的五只表現(xiàn)出病毒續(xù)留。投與0.5μg抗原的八只動物八只動物(t04組和t07組)中的四只表現(xiàn)出續(xù)留。結(jié)合在一起，這些結(jié)果指示在投與8μg抗原的動物中保護免遭fmdv病毒續(xù)留，并且還可看出，相比于peg沉淀，通過中空纖維過濾純化抗原是有利的。兩種抗原制劑之間的主要差異為在中空纖維過濾制劑中存在除了結(jié)構(gòu)蛋白以外的非結(jié)構(gòu)蛋白。因此，在不受理論束縛的情況下，可看出由其中抗原含有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(并且具體來說蛋白3d)兩者的疫苗引起的免疫應(yīng)答的品質(zhì)在預(yù)防性fmdv續(xù)留方面更有效，如表8中所示。表8.抗原制備方法對免疫應(yīng)答的影響.處理續(xù)留％非續(xù)留％t01(鹽水)50％(4只中2只)50％(4只中2只)prepa(中空纖維，合并的t05組到t07組)25％(12只中3只)75％(12只中9只)prepb(peg沉淀，合并的t02組到t04組)50％(12只中6只)50％(12只中6只)本說明書中引用的所有公開案(專利公開案和非專利公開案)表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技能水平。所有這些公開案在本文中以全文引用的方式并入，其程度如同每一篇個別公開案具體并且單獨地說明為以引用方式并入。盡管本文中已參考特定實施例描述本發(fā)明，但應(yīng)理解，這些實施例僅僅說明本發(fā)明的原理和應(yīng)用。因此，應(yīng)理解，在不脫離如由以下權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對說明性實施例作出眾多修改并且可設(shè)計出其它配置。序列表<110>dominowski,pauljosephhardham,johnmorganjackson,jamesalangay,cyrilgerardrodriguez,luisleandrokrug,peterwilliamrieder,aidaelizabeth<120>口蹄疫疫苗<130>p17h27473aj<160>30<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<400>1tcgtcgacgatcggcgcgcgccg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<400>2tcgacgtcgatcggcgcgcgccg23<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<400>3tcgacgtcgatcggcgcgcgccgt24<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5'-碘-2'-脫氧尿苷<400>4ncgacgtcgatcggcgcgcgccg23<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5'-碘-2'-脫氧尿苷<400>5ncgacgtcgatcggcgcgcgccgt24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5'-碘-2'-脫氧尿苷<400>6ncgacgtcgatcggcgcgcgccgt24<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5'-乙基-2'-脫氧尿苷<400>7ncgacgtcgatcggcgcgcgccg23<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5'-碘-2'-脫氧尿苷<400>8ncgtcgacgatcggcggccgccgt24<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5'-碘-2'-脫氧尿苷<400>9ncgtcgacgatcggcggccgccgt24<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>cpg寡核苷酸<400>10tcgtcgacgatcggcgcgcgccg23<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>rna<400>11uuguuguuguuguuguuguu20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>rna<400>12uuauuauuauuauuauuauu20<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>rna<400>13aaacgcucagccaaagcag19<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna/rna<220><221>misc_feature<222>(11)..(17)<223>核糖核苷酸<400>14tcgtcgttttguugugutttt21<210>15<211>10867<212>dna<213>人工序列<220><223>融合核苷酸:口蹄疫病毒(fmdv)和牛類動物鼻病毒2型(brv2)<400>15ggggccggccaatccagtccggcgaccggctcgcagaaccaatctggcaacactggcagc60ataattaacaactactacatgcagcaataccagaactccatggacacacagttgggagac120aatgccatcagtggaggctccaacgagggctccacggacacaacttcaacacacacaacc180aacactcaaaacaatgactggttctcgaagctcgccagttcagcttttaccggtctgttc240ggtgcactgctcgccgacaagaagacagaggaaacgacacttcttgaggaccgcatcctc300accacccgcaacgggcacaccacctcgacgacccaatcgagtgtgggtgtcacacacggg360tactccacagaggaggaccacgttgctgggcccaacacatcgggcctggagacgcgagtg420gtgcaggcagagagattctacaa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