專利名稱：利用針對FZD10的siRNA治療滑膜肉瘤的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抑制或減少FZD10基因表達的方法。同樣地，本發(fā)明涉及治療和/或預防受試者中FZD10相關疾病的方法，所述疾病特別是滑膜肉瘤、結腸直腸癌、胃癌、慢性髓細胞樣白血病和急性髓細胞樣白血病。此外，本發(fā)明涉及包括針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體的藥物組合物。
背景技術：
卷曲同源物(frizzled homologue)10(FZD10)是卷曲家族的成員，所述卷曲家族是Wnt信號傳導的受體。我們以前報道過FZD10在滑膜肉瘤(SS)中明顯超表達(Nagayama S，等人，(2002).CancerRes，625859-5866；WO2004/020668)。
盡管已證實FZD10表達在原發(fā)性結腸直腸癌(Terasaki，H.等人，Int J Mol Med.9107-12.，2002)和原發(fā)性胃癌(Kirikoshi，H.等人，Int J Oncol.19767-71.，2001)以及SS中是上調的，但FZD10在SS致癌作用中的細胞功能及牽連仍不明了。
發(fā)明概述如下文所述，我們證實經由RNA干擾敲除FZD10基因表達導致SS細胞的生長抑制，從而表明FZD10在SS的細胞生長中起重要作用。同樣地，我們鑒定出作為FZD10結合蛋白的核輸入蛋白質——輸入蛋白(importin)-β。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了體外、體內或離體(ex vivo)抑制或減少FZD10基因在細胞或組織中表達的方法，其包括將針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體導入細胞或組織中，其中針對FZD10的雙鏈RNA分子包括靶向SEQ ID NO1的10-100個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選10-50個連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選10-30個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。優(yōu)選地，針對FZD10的雙鏈RNA分子可以包括作為短干擾RNA(siRNA)的短核苷酸序列。例如，雙鏈RNA分子包括靶向SEQ ID NO1核苷酸編號1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸編號1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。更具體而言，針對FZD10的雙鏈RNA分子可以通過具有SEQ ID Nos.7、8、9或10序列的表達載體進行表達。
在其他方面，本發(fā)明提供了預防或治療受試者中滑膜肉瘤的方法，其包括給受試者施用治療上有效量的針對FZD10的雙鏈RNA或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA的表達載體。
此外，本發(fā)明人發(fā)現FZD10蛋白可以結合輸入蛋白-β。因此，抑制FZD10蛋白與輸入蛋白-β之間相互作用或結合的化合物也許可以影響滑膜肉瘤的發(fā)展。
在一方面，本發(fā)明提供了篩選抑制FZD10蛋白與輸入蛋白-β蛋白之間相互作用和/或結合的化合物的方法，其包括(a)在測試樣品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽與輸入蛋白-β蛋白或其部分肽接觸；并且(b)檢測FZD10蛋白與輸入蛋白-β蛋白之間的相互作用或結合的形成。
在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了篩選可以用于治療或預防滑膜肉瘤的化合物的方法，其包括(a)在測試樣品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽與輸入蛋白-β蛋白或其部分肽接觸；并且(b)檢測FZD10蛋白與輸入蛋白-β蛋白之間的相互作用或結合的形成。
除非另外定義，本文所使用的所有技術和科學術語均具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述那些相似或等同的方法和材料可以在本發(fā)明的實踐或測試中使用，但下文還是描述了適當的方法和材料。本文所提及的所有出版物、專利申請書、專利及其他參考文獻均整體引入作為參考。在沖突的情況下，以本說明書包括定義為準。此外，材料、方法和實施例僅為說明性的并不意欲是限制性的。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點由于下述詳細描述和權利要求將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A-1C顯示設計用于減少SS細胞系SYO-1中FZD10表達的小干擾RNA(siRNA)的生長抑制作用。(A)半定量RT-PCR顯示了SYO-1細胞中內源性FZD10表達的抑制。使用β2MG作為內部對照。FZD9的表達不受這些siRNA的影響。(B)用psiU6BX3.0載體轉染的SYO-1細胞的MTT測定。其中觀察到不可檢測的FZD10表達的A549細胞是顯示這些siRNA沒有生長作用的“脫靶(off-target)”對照。(C)集落形成測定證實通過敲除SYO-1細胞中FZD10表達減少集落數目。A549細胞系為“脫靶”對照。
圖2A-2C顯示FZD10可以形成同型寡聚體。(A)FZD10構建體的示意圖。7TM；7跨膜結構域。(B)FZD10與自身的共免疫沉淀。將來自未轉染的COS-7細胞或表達HA-FLAG-FZD10和FZD10-myc/His的細胞的裂解物與α-HA抗體一起進行免疫沉淀。通過使用α-HA和α-myc抗體的蛋白質印跡法來分析免疫沉淀。(C)FZD10的胞質區(qū)沒有牽涉在寡聚化中。將來自未轉染的COS-7細胞或表達HA-FLAG-FZD10、HA-FLAG-FZD10ΔC(1-578)、HA-FLAG-FZD10ΔC(1-525)和FZD10-myc/His的細胞的裂解物與α-HAF-7抗體一起進行免疫沉淀。通過使用α-HA F-7和α-myc 9E10抗體的蛋白質印跡法來分析免疫沉淀。
圖3A-3C顯示FZD10和FZD10結合蛋白的TAP系統純化。(A)FZD10-TAP和對照TAP的示意圖。(B)FZD10的TAP純化鑒定出一種新的復合物。對來自表達對照TAP或FZD10-TAP的SNU-C5細胞的裂解物實施TAP系統純化。銀染色的凝膠顯示了所鑒定的蛋白質。(C)通過共免疫沉淀還顯示了FZD10與輸入蛋白-β之間的相互作用。將來自未轉染的COS-7細胞或表達輸入蛋白-β-3XFLAG或FZD10-myc/His或兩者的細胞的裂解物與α-myc 9E10抗體一起進行免疫沉淀。通過使用α-FLAG M2和α-myc 9E10抗體的蛋白質印跡法分析免疫沉淀。
發(fā)明詳述及優(yōu)選實施方案卷曲同源物10(FZD10)是卷曲家族的成員，所述卷曲家族是Wnt信號傳導的受體。如下文所述，我們證實經由RNA干擾敲除FZD10基因表達導致SS細胞的生長抑制，從而表明FZD10在SS的細胞生長中起重要作用。
已知RNA干擾為細胞事件，其中通過導入雙鏈RNA(dsRNA)降解來自內源基因的mRNA，所述雙鏈RNA具有與內源基因序列互補的序列。因此，靶基因的表達可以得到抑制或減少。這個事件在例如Elbashir，SM.等人，Nature 411，494-498，2001；Hannon，GJ.，Nature 418，244-251，2002(綜述)；Shinagawa，T.等人，Genes Dev.171340-1345 2003；國際專利公開號WO99/32619和WO99/61613中被報道。
我們成功地設計了經由RNA干擾有效抑制或減少FZD10基因表達的dsRNA分子。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了體外、體內或離體抑制或減少FZD10基因在細胞或組織中表達的方法，其包括將針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體導入細胞或組織中，其中針對FZD10的雙鏈RNA分子包括靶向SEQ ID NO1的10-100個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選10-50個連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選10-30個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。優(yōu)選地，針對FZD10的雙鏈RNA分子可以包括作為短干擾RNA(siRNA)的短核苷酸序列。例如，雙鏈RNA分子包括靶向SEQ IDNO1核苷酸編號1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸編號1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。更具體而言，針對FZD10的雙鏈RNA分子可以通過具有如下所述的SEQ ID Nos.7、8、9或10序列的表達載體進行表達。同樣地，具有SEQ ID Nos.7、8、9或10序列的表達載體在本發(fā)明的方法中可以是有用的。
序列 Seq ID No.
5’-CACCAACGCTGGACTGCCTGATGTTCAAGAGACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’75’-AAAAAACGCTGGACTGCCTGATGTCTCTTGAACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’85’-CACCGACTCTGCAGTCCTGGCAGTTCAAGAGACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’95’-AAAAGACTCTGCAGTCCTGGCAGTCTCTTGAACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’10加下劃線的是針對FZD10的特異性序列。
進一步地，如上所述，FZD10在滑膜肉瘤(SS)中明顯超表達，并且通過抑制或減少FZD10的表達抑制SS細胞的生長。因此，在一個可替代的實施方案中，本發(fā)明提供了預防或治療受試者中的滑膜肉瘤的方法，其包括給受試者施用治療上有效量的針對FZD10的雙鏈RNA或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA的表達載體。
本發(fā)明的方法可以離體(例如通過將來源于受試者的細胞與dsRNA或表達載體一起溫育)或可替代地體內(例如通過給受試者施用dsRNA或表達載體)進行。
dsRNA可以通過各種已知施用法送遞到靶位置(例如癌性細胞)。例如，dsRNA可以利用能夠表達dsRNA的表達載體進行送遞。能夠用于本發(fā)明的表達載體的實例包括，但不限于，腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒以及RNA病毒例如逆轉錄病毒。
可以用于將dsRNA施用于靶組織或細胞的基因送遞系統的其他實例包括膠態(tài)分散系統、脂質體誘導的系統及人工病毒包膜。具體而言，例如大分子復合物、納米膠囊(nano-capsule)、微球體、珠、水包油型乳劑、微膠粒、混合微膠粒以及脂質體均可用作送遞系統。
dsRNA或表達載體可以通過靜脈內注射(包括連續(xù)輸注)、肌內注射、腹膜內注射及皮下注射或經由其他施用途徑來直接施用。
可替代地，dsRNA或表達載體可以被導入從受試者獲得的細胞或組織中并隨后可以將該細胞施用于受試者(離體法)。將dsRNA或表達載體導入細胞或組織可以通過常規(guī)基因導入法來完成，例如磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、電穿孔或脂質轉染。其中表達dsRNA的細胞或組織的施用也可以以與dsRNA或表達載體直接施用情況下相同的方式來完成。
所施用的dsRNA或表達載體的劑量可以依賴于年齡、性別、癥狀、施用途徑、施用頻率及劑量形式而變。然而，相關領域的常規(guī)方法均可被適當選擇并使用。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了包括針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體以及藥物學上可接受的載體的組合物。
各種類型的組合物均可通過適當選擇藥物學上可接受的載體以常規(guī)方式進行配制，所述載體一般用于制劑的配制，例如賦形劑、崩解劑、潤滑劑、表面活性劑、分散劑、緩沖劑、防腐劑、增溶劑、抗菌劑、穩(wěn)定劑及等滲劑。
更進一步地，為了了解經由FZD10超表達的SS腫瘤發(fā)生機制，我們致力于通過IP-MS法鑒定新型FZD10結合蛋白。引人注目地，我們分離了作為FZD10結合蛋白的核輸入蛋白——輸入蛋白-β。我們通過免疫組織化學證實了FZD10蛋白局限于核和胞質機構(數據未公開)。因此，FZD10蛋白除了作為膜蛋白的作用外還可以在細胞核中起作用。
因此，抑制FZD10蛋白與輸入蛋白-β之間相互作用或結合的化合物可以影響滑膜肉瘤的發(fā)展。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選抑制FZD10蛋白與輸入蛋白-β蛋白之間相互作用和/或結合的化合物的方法，其包括(a)在測試樣品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽與輸入蛋白-β蛋白或其部分肽接觸；并且(b)檢測FZD10蛋白與輸入蛋白-β蛋白之間的相互作用或結合的形成。
FZD10蛋白的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO2中(GenBankAccession No.BAA84093)中。輸入蛋白-β蛋白的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO4中(GenBank Accession No.NM_002265；PDB IDNo.1QGK-A)中。
通過上述方法篩選的化合物可以用于治療或預防滑膜肉瘤。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了篩選可以用于治療或預防滑膜肉瘤的化合物的方法，其包括(a)在測試樣品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽與輸入蛋白-β蛋白或其部分肽接觸；并且(b)檢測FZD10蛋白與輸入蛋白-β蛋白之間的相互作用或結合的形成。
測試樣品可以包括，但不限于，蛋白質、肽、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產物以及天然提取物包括細胞提取物。同樣地，測試樣品可以是化學文庫或肽文庫。
FZD10與輸入蛋白-β之間相互作用和/或結合的形成的檢測可以根據本領域已知的常規(guī)方法來進行。
在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預防滑膜肉瘤的組合物，其中該組合物包括通過上述任何篩選方法獲得的作為活性成分的藥物學有效量化合物以及藥物學上可接受的載體。
在另一方面，本發(fā)明涵蓋了包含一種或多種本文所述治療化合物的藥物或治療組合物。此類治療化合物包括，但不限于，如本文所述的雙鏈RNA。藥物制劑可以包括適合于口、直腸、鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道或腸胃外(包括肌內、皮下和靜脈內)施用，或通過吸入或吹入法施用的那些。適當時，制劑可以方便地以不連續(xù)劑量單位的形式呈現并且可以通過藥劑學領域眾所周知的任何方法進行制備。所有此類藥劑學方法包括下述步驟如所需的，使活性化合物與液體載體或精密分開的固體載體或兩者結合，以及隨后需要時將產品制成所需制劑形式。
適合于經口施用的藥物制劑可以方便地呈現為不連續(xù)的單位，例如膠囊、扁膠劑(cachet)或片劑，每個包含預定量的活性成分；作為粉末或顆粒；或作為溶液、懸浮液或作為乳劑?；钚猿煞诌€可以呈現為大丸劑藥糖劑或糊劑，并且可以是純的形式的，即不含載體。用于經口施用的片劑和膠囊可以包含常規(guī)賦形劑，例如粘合劑、填料、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑。片劑可以通過壓縮或模制來制造，任選含一種或多種制劑成分。壓縮的片劑可以通過在適當的機器中壓縮自由流動形式的活性成分例如粉末或顆粒而制成，任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑或分散劑混合。模制的片劑可以通過在適當的機器中模制用惰性液體稀釋劑弄濕的粉末狀化合物的混合物而制成。片劑可以通過本領域眾所周知的方法進行包被。經口流體制劑可以是例如水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或者可以呈現為用于在使用前用水或其他適當載體構建的干燥產品。此類流體制劑可以包含常規(guī)添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水的載體(它可以包括可食用油)或防腐劑。片劑可以被任選地制備以便提供其中活性成分的緩慢或受控制的釋放。
用于腸胃外施用的制劑包括水性和非水的無菌注射液，它可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質，所述溶質使得該制劑與預期受體的血液等滲；以及水性和非水的無菌懸浮液，它可以包括懸浮劑和增稠劑。該制劑可以以單位劑量或多劑量容器的形式呈現，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以以冷凍干燥(凍干)的條件儲存，只要求緊在使用前添加無菌液體載體例如注射用鹽水?？商娲?，可以提供該制劑用于連續(xù)輸注。臨時注射液和懸浮液可以由先前描述的類型的無菌粉末、顆粒和片劑進行制備。
用于直腸施用的制劑可以呈現為含常規(guī)載體例如可可脂或聚乙二醇的栓劑。用于口中局部施用例如頰或舌下的制劑包括錠劑，其包括在加味的基質例如蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠中的活性成分，以及軟錠劑，其包括在例如白明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的活性成分。對于鼻內施用，本發(fā)明的化合物可以用作液體噴霧劑或可分散的粉末或以滴劑的形式。滴劑可以與水性或非水基質一起進行配制，還包括一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑方便地由加壓包裝來送遞。
對于吸入施用，該化合物方便地由吹入器、噴霧器、加壓包裝或送遞氣溶膠噴霧劑的其他便利工具來送遞。加壓包裝可以包括適當的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供閥以送遞計量的量來確定。
可替代地，對于吸入或吹入施用，該化合物可以采取干燥粉末組合物的形式，例如化合物與適當的粉末基質例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末組合物可以呈現單位劑量形式，例如膠囊、藥筒、白明膠或泡罩片劑形式，其中的粉末可以借助于吸入器或吹入器施用。
當需要時，可以采用適合于產生活性成分持續(xù)釋放的上述制劑。藥物組合物還可包含其他活性成分，例如抗微生物劑、免疫抑制劑或防腐劑。
應當理解除了上文特別提及的成分外，本發(fā)明的制劑可包括與所述的制劑類型有關的領域中的其他常規(guī)試劑，例如適合于經口施用的那些可以包括調味劑。
優(yōu)選的單位劑量制劑是包含如下文所述的有效劑量的活性成分或其適當級分的那些制劑。
對于上述每種情況，該組合物可以經口施用或經由約0.1-約250mg/kg/天的劑量注射施用。成人的劑量范圍一般為約5mg-約17.5g/天，優(yōu)選約5mg-約10g/天，并且最優(yōu)選約100mg-約3g/天。以不連續(xù)單位提供的呈現的片劑或其他單位劑量形式可以方便地包含在此類劑量上有效的量或作為多重所述的量，例如，包含約5mg-約500mg，通常為約100mg-約500mg的單位。
藥物組合物優(yōu)選經口施用或通過注射(靜脈內或皮下)施用，并且給受試者施用的精確量將由主治醫(yī)師負責。然而，所采用的劑量將取決于諸多因素，包括受試者的年齡和性別、所治療的確切病癥及其嚴重性。同樣地，施用途徑可以依賴于狀況及其嚴重性而變。
實施例本發(fā)明將由下述非限制性實施例進一步地舉例說明實施例1siRNA表達載體的構建為了研究FZD10的細胞功能，我們構建了在U6啟動子控制下表達對FZD10特異的siRNA的質粒(psiU6BX-FZD10)。根據FZD10ORF序列構建了兩種siRNA(psiU6BX-FZD10B和C)。
(1)siRNA表達載體psiU6X3.0的構建因為據報道snRNA U6基因由RNA聚合酶III轉錄，所述RNA聚合酶III產生在3’端有尿苷的短轉錄物，所以我們通過PCR擴增了包含其啟動子區(qū)的snRNA U6基因的基因組片段，所述PCR利用一組引物5′-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQ ID No.11)和5′-TAGGCCC CACCTCCTTCTAT-3’(SEQ ID No.12)以及人胎盤DNA作為模板。產物被純化并利用TA克隆試劑盒根據廠商的規(guī)程(Invitrogen)克隆到pCR質粒載體中。包含snRNA U6基因的BamHI、XhoI消化的片段被純化并克隆到pcDNA3.1(+)質粒的核苷酸1257-56片段中，所述片段通過PCR用一組引物5′-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO.13)和5′-CTCTATCTC GAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ IDNo.14)進行擴增。使用所連接的DNA作為PCR模板，引物為5′-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTT TTCT-3′(SEQ ID No.15)和5′-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3′(SEQID No.16)(下劃線表示HindIII位點)。將產物用Hind III進行消化，它隨后自我連接以產生psiU6BX3.0載體質粒。
(2)質粒構建為了構建myc/His標記的全長FZD10表達載體，我們首先利用人胎盤cDNA文庫作為模板使用下述引物PCR擴增了FZD10(SEQID No.1)的完整編碼序列5′-CCGGAATTCCAGACCGTGCATCATGCAGCGCCCGGGCCCCCGCCT-3’(SEQ ID No.17)(下劃線表示EcoRI位點)和5′-AAAAAGCTTCACGCAGGTGGGCGACTG-3’(SEQ ID No.18)(下劃線表示HindIII位點)。
EcoRI和HindIII消化后，將PCR產物克隆到pcDNA3.1-myc/His載體(Invitrogen)中，并隨后將插入的含myc/His標記的FZD10 cDNA進一步亞克隆到pCAGGS/neo表達載體中。然后，通過使用下列引物組合的PCR擴增從克隆的全長FZD10 cDNA產生內部標記的HA-FLAG-FZD10FL(殘基1-581；SEQ ID No.2)表達質粒構建體對于FZD10 N-末端部分(SEQ ID No.2的氨基酸1-217)為FZD10-ATG，5’-AAGTCGACACCATGCAGCGCCCGGGCCCC-3′(SEQ ID No.19)(下劃線表示SalI位點)和FZD10-nt651，5′-TCTCGAGGACATCCACGCCGGGCGTG-3’(SEQ ID NO.20)(下劃線表示XhoI位點)；對于FZD10 C-末端部分(SEQ ID NO.2的氨基酸218-581)為FZD10-nt652，5′-AAGTCGACTACTGGAGCCGCGAGGACAAG-3’(SEQ IDNO.21)(下劃線表示SalI位點)和FZD10-TGA，5′-AACTCGAGTCACACGCAGGTGGGCGACT-3’(SEQ ID NO.22)(下劃線表示XhoI位點)。
通過正向引物(FZD10-nt652)和下述反向引物分別產生FZD10ΔC1(殘基1-578)和FZD10ΔC2(殘基1-525)表達質粒構建體的N-末端部分(殘基1-217)以及每種構建體的C-末端部分(殘基218-各端)FZD10ΔC1(1-578)，5′-AACTCGAGTCAGGGCGACTGGGCAGGGATCT-3’(SEQ IDNo.23)(下劃線表示XhoI位點)和FZD10ΔC2(1-525)，5′-AACTCGAGTCAGGAGGTCCAAATCCACATCCC-3’(SEQ IDNo.24)(下劃線表示XhoI位點)。
通過將雙鏈寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0載體中制備表達對FZD10特異的siRNA的質粒(表1)。每種質粒中關于siRNA的靶序列顯示于表2中?；パa寡核苷酸各自通過與T4多核苷酸激酶在37℃一起溫育30分鐘進行磷酸化，隨后煮沸并緩慢冷卻至室溫以使兩種寡核苷酸復性。將每種產物連接到psiU6BX3.0中以構建FZD10-siRNA表達載體。
表1插入到siRNA表達載體中的特異性雙鏈寡核苷酸序列Seq ID No.
psi-U6BX-FZD10-B5’-CACCAACGCTGGACTGCCTGATGTTCAAGAGACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’75’-AAAAAACGCTGGACTGCCTGATGTCTCTTGAACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’ 8psi-U6BX-FZD10-C5’-CACCGACTCTGCAGTCCTGGCAGTTCAAGAGACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’95’-AAAAGACTCTGCAGTCCTGGCAGTCTCTTGAACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’10psi-U6BX-EGFP5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’255’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’26psi-U6BX-Luc5’-CACCGTGCGCTGCTGGTGCCAACTTCAAGAGAGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3’275’-AAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACTCTCTTGAAGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3’28加下劃線的是針對FZD10的特異性序列。
表2針對siRNA的靶序列Seq ID No.
psi-U6BX-FZD10-B5’-AACGCTGGACTGCCTGATG-3’5psi-U6BX-FZD10-C5 ’-GACTCTGCAGTCCTGGCAG-3’ 6psi-U6BX-EGFP5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’29psi-U6BX-Luc5’-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3 ’ 30實施例2FZD10-siRNA對滑膜肉瘤細胞系生長的作用我們將實施例1中制備的質粒轉染到滑膜肉瘤細胞系SYO-1中并通過半定量RT-PCR檢查FZD10的表達水平。同樣地，我們進行細胞生長測定以證實細胞生長抑制作用。
(1)半定量RT-PCR
將SYO-1細胞維持在補充有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基中。使用細胞系NucleofectorTM試劑盒V(Amaxa Biosystems，Cologne，德國)轉染SYO-1細胞。轉染的細胞在轉染后48-72小時進行測定。
利用TRIZOL試劑(Invitrogen)根據廠商規(guī)程從轉染的細胞中提取總RNA。被提取的RNA用DNA酶I(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)進行處理并利用oligo(dT)12-18引物用Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen)逆轉錄為單鏈cDNA。利用cDNA作為模板及下述引物進行PCR擴增對于FZD10為5′-TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3′(SEQ IDNO.31)和5′-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3′(SEQ ID No.32)，對于FZD9為5′-CTGCACGCTGGTCTTCCTCT-3′(SEQ IDNO.33)和5′-CCGATCTTGACCATGAGCTTC-3′(SEQ ID NO.34)，對于β2MG為5′-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3′(SEQ IDNO.35)和5′-TCACATGGTTCACACGGCAG-3′(SEQ ID NO.36)。
因此，與對照(psiU6BX-LUC或-EGFP)相比，兩種siRNA構建體-FZD10(si-B和-C)-特異性siRNA顯著抑制表達，而FZD9的表達不受這些siRNA影響(圖1A)，所述FZD9在卷曲家族基因中與FZD10最相似。
(2)細胞生長測定為了證實FZD10-特異性siRNA的細胞生長抑制，我們分別進行了集落形成和MTT測定。將SYO-1細胞如上文(1)中所述進行轉染。將肺癌細胞系A549細胞維持在補充有10％胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中。使用FuGENE6(Roche)轉染A549細胞。
將用psiU6-FZD10、psiU6-luc或psiU6-EGFP質粒轉染的SYO-1和A549細胞在含有適當濃度遺傳霉素的培養(yǎng)基中維持13天。將細胞用4％多聚甲醛固定并用吉姆薩(Giemsa)溶液染色。此外，如所述的(Shimokawa T等人(2003).Cancer Res，63，6116-20)，利用細胞計數試劑盒8(Dojindo)通過MTT測定來測量細胞生存力。
因此，與上述結果一致，抑制SYO-1生長的FZD10 siRNA構建體的導入降低了這種基因的表達(圖1B和1C)。此外，顯示不可檢測的FZD10表達的A549細胞的生長不受影響，從而表明這些siRNA沒有發(fā)生“脫靶”作用。每種結果都由3次獨立實驗證實。因此，我們的發(fā)現提示FZD10在滑膜肉瘤細胞生長中具有重要作用。
實施例3FZD10同型二聚體的形成因為據報道卷曲家族的成員FZD1可以形成寡聚體(Kaykas A，等人(2004).Nat.Cell Biol.652-8)，所以我們研究FZD10是否也能夠通過免疫沉淀進行寡聚化。將兩種FZD10構建體，HA-FLAG-FZD10(下文所述)和FZD10-myc-His(實施例1中制備；圖2A)共轉染到COS-7細胞中并利用α-HA抗體進行共免疫沉淀。
為了構建HA-FLAG-FZD10，一組下述寡核苷酸，5’-ACGTGTCGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCTCGAGATGC-3’(SEQ IDNo.37)(下劃線表示SalI位點)和5′-GCATCTCGAGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCGACACGT-3’(SEQ IDNO.38)(下劃線表示XhoI位點)被退火并用SalI和XhoI消化以產生HA-FLAG標記。首先，單獨PCR擴增殘基1-217和218-終止密碼子(或C-末端缺失)片段。將PCR產物用SalI和XhoI進行消化，并順序連接到pCAGGS/neo表達載體中。將用SalI和XhoI消化的HA-FLAG標記片段符合讀框地連接在nt651和nt652之間。
將COS-7細胞維持在補充有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基中。使用FuGENE6(Roche)轉染COS-7細胞。轉染的細胞在轉染后48-72小時使用。
將被轉染的COS-7細胞用冷PBS(-)洗滌兩次并在IPP緩沖液中進行裂解。將細胞裂解物與抗-HA F7抗體(Santa Cruz)和G蛋白-瓊脂糖(Sigma)一起溫育。將結合的蛋白用IP緩沖液洗滌5次并用SDS-樣品緩沖液洗脫。將被洗脫的蛋白質通過10％SDS-PAGE進行分析。將蛋白質經電泳轉移至硝酸纖維素膜(Amersham Biosciences)。將膜與抗-myc 9E10單克隆抗體、抗-FLAG M2抗體或抗-HA F7抗體溫育，隨后與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體(Amersham Biosciences)溫育。結合的第二抗體通過ECLTM蛋白質印跡檢測試劑(AmershamBiosciences)顯現。
如圖2B中上部小圖所示，免疫沉淀的HA-FLAG-FZD10看起來表現為預測分子量一倍或兩倍的多重條帶，并且最高的條帶堆積在SDS-PAGE電泳膠的頂部，從而提示FZD10能夠形成寡聚體。此外，利用α-HA抗體以破壞(pull down)HA-FLAG-FZD10導致FZD10-myc-His共免疫沉淀(圖2B，下部小圖)，從而表明FZD10可以形成同型二聚體，并且當來自轉染了HA-FLAG-FZD10或FZD10-myc的細胞的裂解物在免疫沉淀之前混合時，不是共免疫沉淀的，從而表明寡聚化發(fā)生在活細胞中(數據未顯示)。FZD10包含兩個基序，KTxxxW(Umbhauer M，等人(2000).EMBO J.194944-4954)，它定位在第7個跨膜結構域后2個氨基酸處，以及在預期的C-末端處的TCV基序，它被認為對于蛋白質-蛋白質相互作用很重要。為了研究這些基序在寡聚化中的牽涉，我們設計了兩種C-末端缺失的構建體(圖2A)它們是否能夠形成寡聚體。如圖2C中所示，利用α-HA抗體的破壞導致FZD10-myc-His共免疫沉淀，從而提示FZD10的C-末端基序可能不參與寡聚化。
實施例4與輸入蛋白-β的相互作用為了經由相互作用的蛋白質進一步研究FZD10蛋白的功能，我們實施了TAP系統純化法。
根據先前報道(Rigaut G，等人(1999).Nat Biotechnol，171030-1032)進行TAP(串聯親和純化)系統純化。簡言之，將作為對照的pCAGGS/neo-FZD 10-TAP或pCAGGS/neo-TAP轉染到SNU-C5細胞中。
為了構建TAP表達載體，根據標準規(guī)程PCR擴增了在3’端有SalI的TAP標記序列的cDNA，所述TAP標記序列由免疫球蛋白G結合結構域和鈣調蛋白結合肽組成，其通過煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV)的切割位點分開(圖3A)。首先，將上述TAP標記序列克隆到pcDNA-3.1(+)-myc-His表達載體中。然后，將pcDNA-3.1(+)-myc-His-TAP用XhoI和SalI進行消化并將所得到的myc-His-TAP片段插入到pCAGGS/neo載體中。將FZD10 ORF cDNA亞克隆到pCAGGS-myc-His-TAP/neo表達載體中。
將結腸癌細胞系SNU-C5維持在補充有10％胎牛血清和抗生素的RPMI1649培養(yǎng)基中。使用FuGENE6(Roche)轉染SNU-C5細胞。
轉染后72小時，用IPP緩沖液(含有蛋白酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktail)SetIII(Calbiochem)的10mM Tris-HCl[pH8.0]、0.1％NP-40、150mM NaCl、1mM NaF)裂解細胞。取出不溶的級分并將上清液與IgG-瓊脂糖(Amersham Biosciences)一起溫育。將結合的蛋白與TEV蛋白酶(Invitrogen)一起在4℃溫育過夜，并且將被洗脫的蛋白質進一步與含1mM CaCl2的鈣調蛋白親和(Calmodulin Affinity)樹脂(Stratagene)一起溫育。最后，將結合的蛋白用1mM EGTA洗脫并實施12％SDS-PAGE。利用Silver Stain“Daiichi”(Daiichi Pure Chemicals)通過銀染色顯現蛋白質。從凝膠上切下與對照TAP有差異的蛋白質條帶并通過Aproscience Co.(Tokushima，日本)常規(guī)運行MALDI-TOF MS分析。
當我們轉染FZD10-TAP且作為對照的TAP載體在SNU-C5細胞中超表達時(圖3B)，我們鑒別出輸入蛋白-β為FZD10的候選相互作用蛋白。我們進一步證實FZD10在COS-7細胞中可以與輸入蛋白-β共免疫沉淀(圖3C)。
盡管本發(fā)明已根據某些優(yōu)選實施方案進行詳細描述，但應當理解在如附加權利要求中所定義的本發(fā)明精神和范圍內，本領域技術人員可以進行多種改變和修飾。
序列表<110>The University of TokyoOncotherapy Science，Inc.
<120>利用針對FZD10的siRNA治療滑膜肉瘤的方法<130>PH-2219-PCT<150>US 60/598,834<151>2004-08-05<160>38<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2811<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(18)..(1763)<223>
<400>1acacgtccaa cgccagc atg cag cgc ccg ggc ccc cgc ctg tgg ctg gtc 50Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val1 5 10ctg cag gtg atg ggc tcg tgc gcc gcc atc agc tcc atg gac atg gag98Leu Gln Val Met Gly Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu15 20 25cgc ccg ggc gac ggc aaa tgc cag ccc atc gag atc ccg atg tgc aag146Arg Pro Gly Asp Gly Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys30 35 40gac atc ggc tac aac atg act cgt atg ccc aac ctg atg ggc cac gag194Asp Ile Gly Tyr Asn Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu45 50 55aac cag cgc gag gca gcc atc cag ttg cac gag ttc gcg ccg ctg gtg242
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1 5 10 15Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly20 25 30Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn35 40 45Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala50 55 60Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His65 70 75 80Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr85 90 95Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln100 105 110Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp115 120 125Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn130 135 140Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg145 150 155 160Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His Ser165 170 175Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Cys
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<221>CDS<222>(337)..(2967)<223>
<400>3ctccctcgct ccctccctgc gcgccgcctc tcactcacag cctcccttcc ttctttctcc60ctccgcctcc cgagcaccag cgcgctctga gctgccccca gggtccctcc cccgccgcca120gcagcccatt tggagggagg aagtaaggga agaggagagg aaggggagcc ggaccgacta180cccagacaga gccggtgaat gggtttgtgg tgacccccgc cccccacccc accctccctt240cccacccgac ccccaacccc catccccagt tcgagccgcc gcccgaaagg ccgggccgtc300gtcttaggag gagtcgccgc cgccgccacc tccgcc atg gag ctg atc acc att 354Met Glu Leu Ile Thr Ile1 5ctc gag aag acc gtg tct ccc gat cgg ctg gag ctg gaa gcg gcg cag 402Leu Glu Lys Thr Val Ser Pro Asp Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ala Gln10 15 20
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atc aag aac cca gat tgg cgg tac cgg gat gca gca gtg atg gct ttt1506Ile Lys Asn Pro Asp Trp Arg Tyr Arg Asp Ala Ala Val Met Ala Phe375 380 385 390ggt tgt atc ttg gaa gga cca gag ccc agt cag ctc aaa cca cta gtt1554Gly Cys Ile Leu Glu Gly Pro Glu Pro Ser Gln Leu Lys Pro Leu Val395 400 405ata cag gct atg ccc acc cta ata gaa tta atg aaa gac ccc agt gta1602Ile Gln Ala Met Pro Thr Leu Ile Glu Leu Met Lys Asp Pro Ser Val410 415 420gtt gtt cga gat aca gct gca tgg act gta ggc aga att tgt gag ctg1650Val Val Arg Asp Thr Ala Ala Trp Thr Val Gly Arg Ile Cys Glu Leu425 430 435ctt cct gaa gct gcc atc aat gat gtc tac ttg gct ccc ctg cta cag1698Leu Pro Glu Ala Ala Ile Asn Asp Val Tyr Leu Ala Pro Leu Leu Gln440 445 450tgt ctg att gag ggt ctc agt gct gaa ccc aga gtg gct tca aat gtg1746Cys Leu Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Pro Arg Val Ala Ser Asn Val455 460 465 470tgc tgg gct ttc tcc agt ctg gct gaa gct gct tat gaa gct gca gac1794Cys Trp Ala Phe Ser Ser Leu Ala Glu Ala Ala Tyr Glu Ala Ala Asp475 480 485gtt gct gat gat cag gaa gaa cca gct act tac tgc tta tct tct tca1842Val Ala Asp Asp Gln Glu Glu Pro Ala Thr Tyr Cys Leu Ser Ser Ser490 495 500ttt gaa ctc ata gtt cag aag ctc cta gag act aca gac aga cct gat1890Phe Glu Leu Ile Val Gln Lys Leu Leu Glu Thr Thr Asp Arg Pro Asp505 510 515gga cac cag aac aac ctg agg agt tct gca tat gaa tct ctg atg gaa1938Gly His Gln Asn Asn Leu Arg Ser Ser Ala Tyr Glu Ser Leu Met Glu520 525 530att gtg aaa aac agt gcc aag gat tgt tat cct gct gtc cag aaa acg1986Ile Val Lys Asn Ser Ala Lys Asp Cys Tyr Pro Ala Val Gln Lys Thr535 540 545 550
act ttg gtc atc atg gaa cga ctg caa cag gtt ctt cag atg gag tca2034Thr Leu Val Ile Met Glu Arg Leu Gln Gln Val Leu Gln Met Glu Ser555 560 565cat atc cag agc aca tcc gat aga atc cag ttc aat gac ctt cag tct2082His Ile Gln Ser Thr Ser Asp Arg Ile Gln Phe Asn Asp Leu Gln Ser570 575 580tta ctc tgt gca act ctt cag aat gtt ctt cgg aaa gtg caa cat caa2130Leu Leu Cys Ala Thr Leu Gln Asn Val Leu Arg Lys Val Gln His Gln585 590 595gat gct ttg cag atc tct gat gtg gtt atg gcc tcc ctg tta agg atg2178Asp Ala Leu Gln Ile Ser Asp Val Val Met Ala Ser Leu Leu Arg Met600 605 610ttc caa agc aca gct ggg tct ggg gga gta caa gag gat gcc ctg atg2226Phe Gln Ser Thr Ala Gly Ser Gly Gly Val Gln Glu Asp Ala Leu Met615 620 625 630gca gtt agc aca ctg gtg gaa gtg ttg ggt ggt gaa ttc ctc aag tac2274Ala Val Ser Thr Leu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Phe Leu Lys Tyr635 640 645atg gag gcc ttt aaa ccc ttc ctg ggc att gga tta aaa aat tat gct2322Met Glu Ala Phe Lys Pro Phe Leu Gly Ile Gly Leu Lys Asn Tyr Ala650 655 660gaa tac cag gtt tgt ttg gca gct gtg ggc tta gtg gga gac ttg tgc2370Glu Tyr Gln Val Cys Leu Ala Ala Val Gly Leu Val Gly Asp Leu Cys665 670 675cgt gcc ctg caa tcc aac atc ata cct ttc tgt gac gag gtg atg cag2418Arg Ala Leu Gln Ser Asn Ile Ile Pro Phe Cys Asp Glu Val Met Gln680 685 690ctg ctt ctg gaa aat ttg ggg aat gag aac gtc cac agg tct gtg aag2466Leu Leu Leu Glu Asn Leu Gly Asn Glu Asn Val His Arg Ser Val Lys695 700 705 710ccg cag att ctg tca gtg ttt ggt gat att gcc ctt gct att gga gga2514Pro Gln Ile Leu Ser Val Phe Gly Asp Ile Ala Leu Ala Ile Gly Gly715 720 725
gag ttt aaa aaa tac tta gag gtt gta ttg aat act ctt cag cag gcc2562Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Val Val Leu Asn Thr Leu Gln Gln Ala730 735 740tcc caa gcc cag gtg gac aag tca gac tat gac atg gtg gat tat ctg2610Ser Gln Ala Gln Val Asp Lys Ser Asp Tyr Asp Met Val Asp Tyr Leu745 750 755aat gag cta agg gaa agc tgc ttg gaa gcc tat act gga atc gtc cag2658Asn Glu Leu Arg Glu Ser Cys Leu Glu Ala Tyr Thr Gly Ile Val Gln760 765 770gga tta aag ggg gat cag gag aac gta cac ccg gat gtg atg ctg gta2706Gly Leu Lys Gly Asp Gln Glu Asn Val His Pro Asp Val Met Leu Val775 780 785 790caa ccc aga gta gaa ttt att ctg tct ttc att gac cac att gct gga2754Gln Pro Arg Val Glu Phe Ile Leu Ser Phe Ile Asp His Ile Ala Gly795 800 805gat gag gat cac aca gat gga gta gta gct tgt gct gct gga cta ata2802Asp Glu Asp His Thr Asp Gly Val Val Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ile810 815 820ggg gac tta tgt aca gca ttt ggg aag gat gta ctg aaa tta gta gaa2850Gly Asp Leu Cys Thr Ala Phe Gly Lys Asp Val Leu Lys Leu Val Glu825 830 835gct agg cca atg atc cat gaa ttg tta act gaa ggg cgg aga tcg aag2898Ala Arg Pro Met Ile His Glu Leu Leu Thr Glu Gly Arg Arg Ser Lys840 845 850act aac aaa gca aaa acc ctt gct aca tgg gca aca aaa gaa ctg agg2946Thr Asn Lys Ala Lys Thr Leu Ala Thr Trp Ala Thr Lys Glu Leu Arg855 860 865 870aaa ctg aag aac caa gct tga tctgttacca ttgggatgat aacctgagga 2997Lys Leu Lys Asn Gln Ala875cccccactgg aaatctccca tcttttgaaa aacctggaag tgaggagtgt gcacggatgc 3057tgaatgtttg ggaatgagag gatgagtgag tgaggcttga aaacacacca cattgaaaat 3117
cctgccacag cagcagccgc agccgccaac agcagcgctg ttagtgagct aagtaagcac 3177tgacttcgta gaaaaccata acatcggcca tcttggaaaa gagaaaaaca atggagttac 3237ttatttaaaa aaaaagaaag aaagttatct cttcccagga gaggctagaa gtagcttttc 3297tgtcttttgg ccagtgccga gtggaatgcc tggtttgggg gaggaggagg gactgggttc 3357agctgtggtg ctttgttgta aaaggcagcc tggcctttgc tactgaggag aaagatggag 3417cctgggtctc aagcccacct tcgctgtacc tttgccacat ggtactgtat gcttgccagc 3477tagaaggagg gtcagggatt ttttacagtc tgagaatgag tgtgtgtgag tgaggcggta 3537tccacattct caacttcaag tcattgcagt ttctttttcc cagaaaacaa ggggttagat 3597gttgcatttc ataaaactaa ccgaagttct gtctactgat gcagcacaag agatgtaaaa 3657aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacacac acacagagga aagacgctct ttaggttttg 3717ttttgttttt tttttttggt tttgtttttt gtttttttta ctctagggaa aacactgacg 3777aatggtcaga gctcctatcc tgatcttttc atcaaggcgc ctttcctaat aatatggttc 3837aactgtgaat gtagaagtgg gggggagggg ggagaaaaag aaaactctgg cgttagagga 3897tatagaaaaa tataagtaca attgttacaa ataacgcaga cttcaaaaac aaaaaaatca 3957caacccaaac aaaccaaaat ttaaatgatc agaattggca gcacaaagaa aacgccctct 4017cctgacttgt attgtggcag tctgaacgcc cccagaaaat tgtgccaaag agtttagaaa 4077aataaatata caataaaagt aaacacatac acacaaaaca gcaaacttca ggtaactatt 4137ttggattgca aacaggataa attaaatgtt caaacaatct gataaaataa ccatttggaa 4197actgaaaa 4205<210>4<211>876<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>4Met Glu Leu Ile Thr Ile Leu Glu Lys Thr Val Ser Pro Asp Arg Leu1 5 10 15Glu Leu Glu Ala Ala Gln Lys Phe Leu Glu Arg Ala Ala Val Glu Asn20 25 30Leu Pro Thr Phe Leu Val Glu Leu Ser Arg Val Leu Ala Asn Pro Gly35 40 45Asn Ser Gln Val Ala Arg Val Ala Ala Gly Leu Gln Ile Lys Asn Ser50 55 60Leu Thr Ser Lys Asp Pro Asp Ile Lys Ala Gln Tyr Gln Gln Arg Trp65 70 75 80Leu Ala Ile Asp Ala Asn Ala Arg Arg Glu Val Lys Asn Tyr Val Leu85 90 95Gln Thr Leu Gly Thr Glu Thr Tyr Arg Pro Ser Ser Ala Ser Gln Cys100 105 110Val Ala Gly Ile Ala Cys Ala Glu Ile Pro Val Asn Gln Trp Pro Glu115 120 125Leu Ile Pro Gln Leu Val Ala Asn Val Thr Asn Pro Asn Ser Thr Glu130 135 140His Met Lys Glu Ser Thr Leu Glu Ala Ile Gly Tyr Ile Cys Gln Asp145 150 155 160Ile Asp Pro Glu Gln Leu Gln Asp Lys Ser Asn Glu Ile Leu Thr Ala165 170 175
Ile Ile Gln Gly Met Arg Lys Glu Glu Pro Ser Asn Asn Val Lys Leu180 185 190Ala Ala Thr Asn Ala Leu Leu Asn Ser Leu Glu Phe Thr Lys Ala Asn195 200 205Phe Asp Lys Glu Ser Glu Arg His Phe Ile Met Gln Val Val Cys Glu210 215 220Ala Thr Gln Cys Pro Asp Thr Arg Val Arg Val Ala Ala Leu Gln Asn225 230 235 240Leu Val Lys Ile Met Ser Leu Tyr Tyr Gln Tyr Met Glu Thr Tyr Met245 250 255Gly Pro Ala Leu Phe Ala Ile Thr Ile Glu Ala Met Lys Ser Asp Ile260 265 270Asp Glu Val Ala Leu Gln Gly Ile Glu Phe Trp Ser Asn Val Cys Asp275 280 285Glu Glu Met Asp Leu Ala Ile Glu Ala Ser Glu Ala Ala Glu Gln Gly290 295 300Arg Pro Pro Glu His Thr Ser Lys Phe Tyr Ala Lys Gly Ala Leu Gln305 310 315 320Tyr Leu Val Pro Ile Leu Thr Gln Thr Leu Thr Lys Gln Asp Glu Asn325 330 335Asp Asp Asp Asp Asp Trp Asn Pro Cys Lys Ala Ala Gly Val Cys Leu340 345 350
Met Leu Leu Ala Thr Cys Cys Glu Asp Asp Ile Val Pro His Val Leu355 360 365Pro Phe Ile Lys Glu His Ile Lys Asn Pro Asp Trp Arg Tyr Arg Asp370 375 380Ala Ala Val Met Ala Phe Gly Cys Ile Leu Glu Gly Pro Glu Pro Ser385 390 395 400Gln Leu Lys Pro Leu Val Ile Gln Ala Met Pro Thr Leu Ile Glu Leu405 4l0 415Met Lys Asp Pro Ser Val Val Val Arg Asp Thr Ala Ala Trp Thr Val420 425 430Gly Arg Ile Cys Glu Leu Leu Pro Glu Ala Ala Ile Asn Asp Val Tyr435 440 445Leu Ala Pro Leu Leu Gln Cys Leu Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Pro450 455 460Arg Val Ala Ser Asn Val Cys Trp Ala Phe Ser Ser Leu Ala Glu Ala465 470 475 480Ala Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ala Asp Asp Gln Glu Glu Pro Ala Thr485 490 495Tyr Cys Leu Ser Ser Ser Phe Glu Leu Ile Val Gln Lys Leu Leu Glu500 505 510Thr Thr Asp Arg Pro Asp Gly His Gln Asn Asn Leu Arg Ser Ser Ala515 520 525
Tyr Glu Ser Leu Met Glu Ile Val Lys Asn Ser Ala Lys Asp Cys Tyr530 535 540Pro Ala Val Gln Lys Thr Thr Leu Val Ile Met Glu Arg Leu Gln Gln545 550 555 560Val Leu Gln Met Glu Ser His Ile Gln Ser Thr Ser Asp Arg Ile Gln565 570 575Phe Asn Asp Leu Gln Ser Leu Leu Cys Ala Thr Leu Gln Asn Val Leu580 585 590Arg Lys Val Gln His Gln Asp Ala Leu Gln Ile Ser Asp Val Val Met595 600 605Ala Ser Leu Leu Arg Met Phe Gln Ser Thr Ala Gly Ser Gly Gly Val610 615 620Gln Glu Asp Ala Leu Met Ala Val Ser Thr Leu Val Glu Val Leu Gly625 630 635 640Gly Glu Phe Leu Lys Tyr Met Glu Ala Phe Lys Pro Phe Leu Gly Ile645 650 655Gly Leu Lys Asn Tyr Ala Glu Tyr Gln Val Cys Leu Ala Ala Val Gly660 665 670Leu Val Gly Asp Leu Cys Arg Ala Leu Gln Ser Asn Ile Ile Pro Phe675 680 685Cys Asp Glu Val Met Gln Leu Leu Leu Glu Asn Leu Gly Asn Glu Asn690 695 700
Val His Arg Ser Val Lys Pro Gln Ile Leu Ser Val Phe Gly Asp Ile705 710 715 720Ala Leu Ala Ile Gly Gly Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Val Val Leu725 730 735Asn Thr Leu Gln Gln Ala Ser Gln Ala Gln Val Asp Lys Ser Asp Tyr740 745 750Asp Met Val Asp Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Glu Ser Cys Leu Glu Ala755 760 765Tyr Thr Gly Ile Val Gln Gly Leu Lys Gly Asp Gln Glu Asn Val His770 775 780Pro Asp Val Met Leu Val Gln Pro Arg Val Glu Phe Ile Leu Ser Phe785 790 795 800Ile Asp His Ile Ala Gly Asp Glu Asp His Thr Asp Gly Val Val Ala805 810 815Cys Ala Ala Gly Leu Ile Gly Asp Leu Cys Thr Ala Phe Gly Lys Asp820 825 830Val Leu Lys Leu Val Glu Ala Arg Pro Met Ile His Glu Leu Leu Thr835 840 845Glu Gly Arg Arg Ser Lys Thr Asn Lys Ala Lys Thr Leu Ala Thr Trp850 855 860Ala Thr Lys Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn Gln Ala865 870 875
<210>5<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>5aacgctggac tgcctgatg 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>6gactctgcag tcctggcag 19<210>7<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>7caccaacgct ggactgcctg atgttcaaga gacatcaggc agtccagcgt t 51<210>8<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>8aaaaaacgct ggactgcctg atgtctcttg aacatcaggc agtccagcgt t 51<210>9<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>9caccgactct gcagtcctgg cagttcaaga gactgccagg actgcagagt c 51<210>10<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>10aaaagactct gcagtcctgg cagtctcttg aactgccagg actgcagagt c 51<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>11ggggatcagc gtttgagtaa20<210>12<211>20
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>12taggccccac ctccttctat20<210>13<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>13tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30<210>14<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>14ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29<210>15<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>15tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct 40
<210>16<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>16tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca 37<210>17<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>17ccggaattcc agaccgtgca tcatgcagcg cccgggcccc cgcct45<210>18<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>18aaaaagcttc acgcaggtgg gcgactg27<210>19<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>19aagtcgacac catgcagcgc ccgggcccc 29<210>20<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>20tctcgaggac atccacgccg ggcgtg 26<210>21<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>21aagtcgacta ctggagccgc gaggacaag 29<210>22<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>22aactcgagtc acacgcaggt gggcgact 28<210>23<211>31
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>23aactcgagtc agggcgactg ggcagggatc t 31<210>24<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>24aactcgagtc aggaggtcca aatccacatc cc 32<210>25<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>25caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>26<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>26aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c51
<210>27<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>27caccgtgcgc tgctggtgcc aacttcaaga gagttggcac cagcagcgca c 51<210>28<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>28aaaagtgcgc tgctggtgcc aactctcttg aagttggcac cagcagcgca c 51<210>29<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>29gaagcagcac gacttcttc 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>siRNA的靶序列<400>30gtgcgctgct ggtgccaac 19<210>31<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>31tatcgggctc ttctctgtgc20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>32gactgggcag ggatctcata20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>33ctgcacgctg gtcttcctct20<210>34
<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>34ccgatcttga ccatgagctt c 21<210>35<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>35ttagctgtgc tcgcgctact20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>36tcacatggtt cacacggcag20<210>37<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>標記的人工合成的寡核苷酸<400>37
acgtgtcgac tacccatacg acgtcccaga ctacgctatg gactacaagg acgacgatga60caagctcgag atgc 74<210>38<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>標記的人工合成的寡核苷酸<400>38gcatctcgag cttgtcatcg tcgtccttgt agtccatagc gtagtctggg acgtcgtatg60ggtagtcgac acgt 7權利要求
1.一種用于體外、體內或離體抑制或減少FZD10基因在細胞或組織中表達的方法，其包括將針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體導入所述細胞或組織中，其中所述針對FZD10的雙鏈RNA分子包括靶向SEQ ID NO1的至少10個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
2.權利要求1的方法，其中所述針對FZD10的雙鏈RNA分子是短干擾RNA(siRNA)。
3.權利要求1或2的方法，其中所述雙鏈RNA分子包括靶向SEQ ID NO1核苷酸編號1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸編號1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。
4.權利要求1或2的方法，其中所述針對FZD10的雙鏈RNA分子通過具有SEQ ID Nos.7、8、9或10所述序列的表達載體進行表達。
5.一種用于預防或治療受試者中與卷曲同源物10(FZD10)相關的疾病的方法，其包括給所述受試者施用治療上有效量的針對FZD10的雙鏈RNA或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA的表達載體。
6.權利要求5的方法，其中所述針對FZD10的雙鏈RNA分子是短干擾RNA(siRNA)。
7.權利要求5或6的方法，其中所述雙鏈RNA分子包括靶向SEQ ID NO1核苷酸編號1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸編號1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。
8.權利要求5或6的方法，其中所述表達載體包括SEQ ID Nos.7、8、9或10所述的序列。
9.權利要求5-8中任何一項的方法，其中所述與FZD10相關的疾病選自滑膜肉瘤、結腸直腸癌、胃癌、慢性髓細胞樣白血病和急性髓細胞樣白血病。
10.一種藥物組合物，其包括針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體，以及藥物學上可接受的載體。
全文摘要
提供了用于抑制或減少FZD10基因表達的方法。同樣地，提供了用于治療和/或預防受試者中FZD10相關的疾病的方法。進一步提供的是包括針對FZD10的雙鏈RNA分子或能夠表達針對FZD10的雙鏈RNA分子的表達載體的藥物組合物。
文檔編號A61K31/713GK1993466SQ20058002617
公開日2007年7月4日 申請日期2005年7月14日 優(yōu)先權日2004年8月5日
發(fā)明者中村祐輔, 片桐豐雅, 福川千香子 申請人:國立大學法人東京大學, 腫瘤療法科學股份有限公司