預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，包括PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D，其中，所述各組分的含量均為10-100μg/ml；通過向鋁佐劑中加入相應(yīng)劑量的PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四種原液并混勻制得；所述免疫原性組合物可以預(yù)防覆蓋95％以上臨床上流行的肺炎鏈球菌的感染和侵襲，在肺炎預(yù)防方面具有廣泛應(yīng)用，其制備方法簡單，生產(chǎn)成本較低，生產(chǎn)周期縮短，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。
【專利說明】預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其是預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物 及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌是世界范圍內(nèi)引起死亡的重要原因之一，且是肺炎、腦膜炎、中耳炎等 侵襲性和非侵襲性感染的重要致病菌。肺炎鏈球菌常寄生在健康人的鼻咽部，約有40% - 70%的人帶菌，當機體免疫功能降低時，病菌就會乘虛而入侵入肺部，造成肺炎。肺炎鏈球 菌感染，一是來自自身帶菌，當?shù)挚沽档蜁r，肺炎鏈球菌向下呼吸道侵犯引起肺炎；二是 被來自帶菌的別人或患者所傳染，引起肺炎。
[0003] 接種疫苗是有效的特異性預(yù)防措施，具有極佳的衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)價值。目前普遍應(yīng)用 的預(yù)防肺炎鏈球菌疾病的疫苗主要有兩類，多糖疫苗（23價多糖疫苗，適用于2歲以上適合 人群）和多糖蛋白結(jié)合疫苗（7價、10價或13價，可用于2歲以下嬰幼兒）。
[0004] 肺炎多糖疫苗為"23價肺炎多糖疫苗"，能覆蓋23種經(jīng)常引起肺炎球菌感染的血 清型，約90%的肺炎球菌感染疾病是由這23種血清型引起的。絕大多數(shù)健康的成年人，在 接種后2-3周內(nèi)，均能產(chǎn)生抵抗所有或大部分肺炎鏈球菌的保護性抗體。23價肺炎疫苗可 以有效地預(yù)防肺炎，已經(jīng)在美國、加拿大等30多個國家及地區(qū)應(yīng)用14年以上，接種后保護 率可達92%，具有良好的安全性，免疫功效可維持5年。2歲以上體弱或反復(fù)患肺炎的幼兒 及高危人群（如無脾兒童）可以使用。
[0005] 23價肺炎多糖疫苗所含的莢膜多糖抗原為T細胞非依賴性抗原，可以刺激成熟的 B淋巴細胞，但不會刺激T淋巴細胞，此抗原介導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)時間較短，不能產(chǎn)生免疫 記憶。2歲以下嬰幼兒免疫功能發(fā)育尚不完善，對T細胞非依賴性抗原的反應(yīng)很差，所以多 糖疫苗不能誘導(dǎo)嬰幼兒產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。23價肺炎多糖疫苗不能用于2歲以下兒童 的預(yù)防。7價肺炎多糖蛋白結(jié)合疫苗可以預(yù)防疫苗所覆蓋7種血清型肺炎鏈球菌所引起的 疾病，國外研究顯示，其所包含的7種血清型所導(dǎo)致的疾病約占所有肺炎鏈球菌感染疾病 的80%左右。2006-2007年在我國四所有代表性的兒童醫(yī)院（北京兒童醫(yī)院、上海復(fù)旦大 學(xué)附屬兒科醫(yī)院、廣州兒童醫(yī)院和深圳兒童醫(yī)院）5歲以下住院肺炎兒童中臨床分離到279 株肺炎鏈球菌。分析發(fā)現(xiàn)主要的致病肺炎鏈球菌血清型與PCV7所覆蓋血清型一致，而這7 種血清型占到所有致病肺炎鏈球菌的81 %。這說明7價肺炎結(jié)合疫苗在中國同樣具有較高 的血清型覆蓋率。但7價肺炎結(jié)合疫苗不能預(yù)防疫苗覆蓋這7種血清型之外的其他血清型 肺炎鏈球菌的感染。研究表明，其它血清型肺炎鏈球菌的感染也普遍存在。
[0006] 肺炎鏈球菌表面的多種膜蛋白是重要的毒力因子，可作為一種重要的抗原物質(zhì)， 由于外膜蛋白具有保守的組成結(jié)構(gòu)，因此外膜蛋白可誘發(fā)交叉免疫作用。肺炎表面蛋白 A(PspA)廣泛存在于90種肺炎鏈球菌亞型中,PspA蛋白的a螺旋端是一個重要的抗原決定 區(qū)域，在不同血清型中有廣泛的同源性，根據(jù)該端氨基酸序列，PspA蛋白被劃分為3個家族 (famlily)，再細分為6個支系（clade)。
[0007] 已有大量的研究報道了 PspA蛋白對不同血清型SPN的保護作用，將PspA蛋白作 為疫苗成分，可克服多糖蛋白結(jié)合疫苗莢膜血清型數(shù)量有限且抗蛋白載體抗體對病原菌缺 乏特異性保護作用的不足之處。流行性病學(xué)調(diào)查顯示，絕大多數(shù)SPN菌PspA屬于一、二兩 家族，臨床上很少分離到家族三菌株。本發(fā)明所述免疫原性組合物PspA-mRXl來自家族 一、PspA-EF5668和PspA-EF3296來自于PspA家族二，以此免疫組合物作為抗原組分，將覆 蓋95%以上的臨床分離株血清型。
[0008] 溶血素的主要作用是溶血和激活補體，鼻腔和腹膜腔的肺炎鏈球菌攻擊試驗證 實，重組Ply可使老鼠的壽命延長89%和93%。ply氨基酸序列高度保守，抗原性強，因此， Ply可以作為覆蓋所有血清型抗原疫苗的備選蛋白，該蛋白的疫苗潛能已經(jīng)在不同的實驗 室中證實。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原 性組合物。
[0010] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免 疫原性組合物的制備方法。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0012] 一種用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物（PBPV制劑），包括 PspA-mRXl (去除人同源性的RXl亞型肺炎球菌表面蛋白A)、PspA-EF5668(EF5668亞型肺 炎球菌表面蛋白A)、PspA-EF3296(EF3296亞型肺炎球菌表面蛋白A)和PlyL460D(改造的 肺炎鏈球菌溶血素），其中，所述PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D的含量 均為10-100 μ g/ml，即該免疫原性組合物的組分劑量配制方案為：
[0013] (I) PspA-mRXl 用量 10-100 μ g/ml ;
[0014] (2) PspA-EF5668 用的量 10-100 μ g/ml ;
[0015] (3) PspA-EF3296 用量 10-100 μ g/ml ;
[0016] (4) PlyL460D 用量 10-100 μ g/ml。
[0017] 優(yōu)選的，上述用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，所述 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D 的質(zhì)量比為 1:1:1:1。
[0018] 優(yōu)選的，上述用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，所述PspA-mRXl 是根據(jù)申請?zhí)枮?01110455047. 3的發(fā)明專利制備得到的。
[0019] 優(yōu)選的，上述用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，可以作為預(yù)防 肺炎鏈球菌家族一型和二型感染的疫苗。
[0020] 上述用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物的制備方法，具體制備步 驟如下：
[0021] (1)準備上述組方中各抗原原液和鋁佐劑，按照PspA-mRXl、PspA-EF5668、 PspA-EF3296、PlyL460D四種蛋白最終濃度為10-100μ g/ml，鋁離子最終濃度為0. 48mg/ ml，計算原液、佐劑以及補充的生理鹽水用量；
[0022] (2)向計算所得量的生理鹽水中加入對應(yīng)量的鋁佐劑混勻，按順序依次加入 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四種原液，緩慢上下顛倒混勻，放入 2-8°C冷庫過夜，即得。
[0023] 本發(fā)明的有益效果是：
[0024] 上述用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，可以預(yù)防覆蓋95%以上 血清型的肺炎鏈球菌（家族一型和二型）的感染和侵襲，PspA-mRXl抗原組分中氨基酸肽 段的加入可以增強該組分在免疫原性組合物中所發(fā)揮的免疫功效，在肺炎預(yù)防方面具有廣 泛應(yīng)用，其制備方法簡單，生產(chǎn)成本較低，生產(chǎn)周期縮短，適合規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的需要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為PspA-EF5668抗原蛋白的分離純化SDS-PAGE電泳圖譜，其中，
[0026] 1 :破碎液；2 :SP流穿；3 :SP洗脫；4 :SP洗脫拖尾；5 :柱清洗；6 :SP洗脫；7 :Q流 芽；8 :雜蛋白清洗；9 :目標蛋白洗脫。
[0027] 圖2為PlyL460D抗原蛋白的分離純化SDS-PAGE電泳圖譜，其中，
[0028] 1 :破碎液；2 :硫酸銨沉淀；3 :SP流穿；4 :洗脫；M =Marker ;5 :柱清洗。

【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的說明。
[0030] 實施例1
[0031] 單個抗原組分的制備
[0032] I、構(gòu)建PspA-mRXl，按照申請?zhí)枮?01110455047. 3進行制備，具體方法包括：
[0033] 構(gòu)建PspA-mRXl，利用大腸桿菌BL21 (DE3)表達PspA-mRXl，具體方法包括：將 mRX 1的PspA的DNA序列導(dǎo)入PET9a質(zhì)粒，再將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌E. Co I i BL21(DE3)中，得到含有PspA-mRXl的表達載體；
[0034] 取PspA-mRXl大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株的凍存菌種一支，吸取IOOyL涂 布平板，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，使用涂布棒刮取菌苔轉(zhuǎn)接到IOOml搖瓶培養(yǎng)基中，37°C， 200-300rpm搖床培養(yǎng)3-4h，轉(zhuǎn)接50L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度37°C，pH7. 0,轉(zhuǎn)速200-600rpm，補料 采用pH-star工藝流加，對數(shù)中期一次性加入終濃度為ImM的IPTG，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心 取菌體，進行勻漿破碎，離心后收集上清；
[0035] 對PspA-mRXl抗原蛋白進行分離純化：將收獲的菌體進行勻漿破碎，然后按照IL 破碎液加入30-250ml檸檬酸（IM)的比例加入檸檬酸，攪拌均勻后離心收集上清。將上清 經(jīng)過SP FF進行純化。首先使用pH為3-4的檸檬酸進行平衡，然后使用pH為5-6的檸檬 酸進行洗脫，得到洗脫溶液。將洗脫液經(jīng)過Q FF進行純化。首先使用pH為7-8的檸檬酸 進行平衡，然后使用PH為5-6的檸檬酸進行洗脫，得到純度大于95%的樣品（PspA-mRXl)。 測定結(jié)果見圖1。所得PspA-mRXl的序列為序列表〈400>1所述序列。
[0036] II、構(gòu)建PspA-EF5668,利用大腸桿菌BL21 (DE3)表達PspA-EF5668,具體方法包 括：將EF5668的PspA的DNA序列導(dǎo)入PET9a質(zhì)粒，再將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌 E. Coli BL21 (DE3)中，得到含有PspA-EF5668的表達載體：
[0037] 取PspA-EF5668大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌株的凍存菌種一支，吸取100 μ L涂 布平板，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，使用涂布棒刮取菌苔轉(zhuǎn)接到IOOml搖瓶培養(yǎng)基中，37°C， 200-300rpm搖床培養(yǎng)3-4h，轉(zhuǎn)接50L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度37°C，pH7. 0,轉(zhuǎn)速200-600rpm，補料 采用pH-star工藝流加，對數(shù)中期一次性加入終濃度為ImM的IPTG，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心 取菌體，進行勻漿破碎，離心后收集上清。
[0038] 對PspA_EF5668抗原蛋白進行分離純化：將收獲的菌體進行勻漿破碎，然后按照 IL破碎液加入30-250ml檸檬酸（IM)的比例加入檸檬酸，攪拌均勻后離心收集上清。將上 清經(jīng)過SP FF進行純化。首先使用pH為3-4的檸檬酸進行平衡，然后使用pH為5-6的檸檬 酸進行洗脫，得到洗脫溶液。將洗脫液經(jīng)過Q FF進行純化。首先使用pH為7-8的檸檬酸進 行平衡，然后使用PH為5-6的檸檬酸進行洗脫，得到純度大于95%的樣品（PspA-EF5668)。 測定結(jié)果見圖1。所得PspA-EF5668的序列為序列表〈400>2所述序列。
[0039] III、構(gòu)建PspA-EF3296,利用同樣的方法構(gòu)建含有PspA-EF3296的大腸桿菌表達載 體，具體方法包括：
[0040] 取PspA-EF3296大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌株的凍存菌種一支，吸取100 μ L涂 布平板，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，使用涂布棒刮取菌苔轉(zhuǎn)接到IOOml搖瓶培養(yǎng)基中，37°C， 200-300rpm搖床培養(yǎng)3-4h，轉(zhuǎn)接50L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度37°C，pH7. 0,轉(zhuǎn)速200-600rpm，補料 采用pH-star工藝流加，對數(shù)中期一次性加入終濃度為ImM的IPTG，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心 取菌體，進行勻漿破碎，離心后收集上清。
[0041] 對PSPA-EF3296抗原蛋白進行分離純化：將收獲的菌體進行勻漿破碎，然后按照 IL破碎液加入30-250ml檸檬酸（IM)的比例加入檸檬酸，攪拌均勻后離心收集上清。將上 清經(jīng)過SP FF進行純化。首先使用pH為3-4的檸檬酸進行平衡，然后使用pH為5-6的檸檬 酸進行洗脫，得到洗脫溶液。將洗脫液經(jīng)過Q FF進行純化。首先使用pH為7-8的檸檬酸進 行平衡，然后使用PH為5-6的檸檬酸進行洗脫，得到純度大于95%的樣品（PspA-EF3296)。 所得PspA-EF3296的序列為序列表〈400>3所述序列。
[0042] IV、構(gòu)建PlyL460D的序列，利用大腸桿菌BL21 (DE3)表達ply460D，具體方法包 括：
[0043] 取ply460D大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株的凍存菌種一支，吸取100μL涂布 平板，37 °C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，使用涂布棒刮取菌苔轉(zhuǎn)接到IOOml搖瓶培養(yǎng)基中，37 °C， 200-300rpm搖床培養(yǎng)3-4h，轉(zhuǎn)接50L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度37°C，pH7. 0,轉(zhuǎn)速200-600rpm，補料 采用pH-star工藝流加，對數(shù)中期一次性加入終濃度為ImM的IPTG，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心 取菌體，進行勻漿破碎，離心后收集上清。
[0044] 對ply460D抗原蛋白進行分離純化：將菌體進行勻漿破碎，然后通過0. 2 μ m膜包 進行超濾回收，再經(jīng)過30KD膜包濃縮換液。將溶液經(jīng)過Q 650M進行純化。首先使用pH為 8-9的tris進行平衡，然后使用含有50-250mM NaCl的tris(pH = 8-9)進行洗脫。將洗脫 液經(jīng)過phenyl進行純化。首先使用含有0. 5-3M NaCl的tris (pH = 8-9)進行平衡，然后 使用PH為8-9的tris進行洗脫。將洗脫液經(jīng)過CHT I進行純化。首先使用pH為6. 2的 PB(4-10mM)進行平衡，然后使用含有0. 5-1M NaCl的PB(4-10mM，pH = 7-8)進行洗脫，得 到樣品（PlyL460D)。測定結(jié)果見圖2。所得PlyL460D的序列為序列表〈400>4所述序列。
[0045] 實施例2
[0046] 免疫原性組合物的制劑配制
[0047] 免疫原性組合物的配制，按下表1進行：
[0048] 表 1
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，其特征在于：包括 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296 和 PlyL460D，其中，所述 PspA-mRXl、PspA-EF5668、 PspA-EF3296、PlyL460D 的含量均為 10-100 ii g/ml。
2. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，其特征 在于：所述 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D 的質(zhì)量比為 1:1:1:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，其特征 在于：所述PspA-mRXl是根據(jù)申請?zhí)枮?01110455047. 3的發(fā)明專利制備得到的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物，其特征 在于：可應(yīng)用于預(yù)防肺炎鏈球菌家族一型和二型感染的疫苗。
5. 權(quán)利要求1所述用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的免疫原性組合物的制備方法，其 特征在于：具體制備步驟如下： (1) 準備上述組方中各抗原原液和鋁佐劑，按照PspA-mRXl、PspA-EF5668、 PspA-EF3296、PlyL460D四種蛋白最終濃度為10-100 ii g/ml，鋁離子最終濃度為0? 48mg/ ml，計算原液、佐劑以及補充的生理鹽水用量； (2) 向計算所得量的生理鹽水中加入對應(yīng)量的鋁佐劑混勻，按順序依次加入 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四種原液，緩慢上下顛倒混勻，放入 2-8°C冷庫過夜，即得。
【文檔編號】A61K39/116GK104306965SQ201410605626
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】朱濤, 段磊, 楊鳴鳴, 邵忠琦, 宇學(xué)峰, 毛慧華, 邱東旭 申請人:天津康希諾生物技術(shù)有限公司