一種用于腹壁缺損的生物修復材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程【技術領域】，公開了一種用于腹壁缺損的生物修復材料及其制備方法，該方法包含以下步驟：(1)對已死亡動物的腹直肌肌肉組織做前期處理；(2)脫細胞處理制備骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片；(3)將骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片溶于胃蛋白酶中進行消化；(4)將消化得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒與聚已內(nèi)酯混合后進行靜電紡絲，得到聚已內(nèi)酯/骨骼肌脫細胞基質(zhì)共混靜電紡絲纖維膜，即為本發(fā)明的生物修復材料。本發(fā)明將來源于腹壁組織的骨骼肌脫細胞基質(zhì)與聚己內(nèi)酯通過靜電紡絲技術結(jié)合，制備材料均可降解且降解產(chǎn)物對人體無害，制得的生物修復材料能很好地模擬細胞外基質(zhì)的組成成分和結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和生物力學性能。
【專利說明】一種用于腹壁缺損的生物修復材料及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程【技術領域】，特別涉及一種用于腹壁缺損的生物修復材料及其制備方法。

【背景技術】
[0002]腹壁缺損是當今臨床外科的一種常見疾病，腹壁疝、腹壁嚴重戰(zhàn)創(chuàng)傷、腹壁腫瘤擴大切除等均可造成腹壁缺損的形成。其中，腹股溝疝和切口疝是最常見的腹壁缺損，歐美國家腹股溝疝的發(fā)病率為1-5%。，我國上海地區(qū)的腹股溝疝發(fā)病率為3.6%。，60歲以上老年人的發(fā)病率則高達11.8%。，我國每年要進行的成人腹股溝疝手術病例達到300-400萬例。腹部切口疝的復發(fā)率約為腹部手術的2-20%，當缺損過大或者伴有感染時發(fā)生率甚至高達50%。經(jīng)典的治療方式采用直接縫合修補，病人術后疝復發(fā)率可達30-50%，甚至更高，Lichtenstein經(jīng)過多年的實踐于1986提出無張力_修補術(tens1n-freehern1plasty)概念治療腹壁疝，這種修補術是以人工生物材料作為補片，用以加強腹股溝管的后壁。此理念克服了傳統(tǒng)手術對正常解剖的影響，并且縫合無張力，使腹壁疝術后復發(fā)率大大減少。無張力疝修補術的概念的引入從此使腹壁缺損的治療進入材料修補的紀元。目前臨床上使用的修復材料主要包括合成和生物補片兩大類。合成材料分為可降解和不可降解兩大類，其中合成不可降解材料能提供并維持足夠的力學強度而被廣泛使用，但作為植入體內(nèi)的終身異物，可能引起腸瘺、腸梗阻、感染等并發(fā)癥，且不能用于已感染或伴污染的創(chuàng)面，因而使用受到一定限制；合成可降解材料(PGA、PLGA、PCL等)親水性能差，細胞粘附能力弱，因而不能刺激機體引起足夠的纖維組織再生，單獨使用不能滿足腹壁缺損的治療需求。生物補片來源于牛、豬、馬、人等哺乳動物的富含膠原的組織，例如小腸粘膜下層、皮膚、膀胱和心包等。經(jīng)過脫細胞技術處理后，生物補片保留有一定的細胞外基質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)。其中的膠原、糖蛋白、彈性纖維、粘多糖和生長因子等成分可促進宿主細胞在其三維結(jié)構(gòu)上生長并分泌細胞外基質(zhì)，形成自身組織并完成在缺損部位的修復重建。然而，脫細胞基質(zhì)生物補片同樣存在一些問題:1.生物補片機械強度差，植入人體內(nèi)降解速度過快，而宿主新生自體組織沒有充分的完成重塑，導致缺損處腹壁薄弱和疝復發(fā)。2.生物補片材料表面致密，宿主細胞較難遷移至材料內(nèi)部，只是在材料表面附著，導致其修復效果大打折扣。因此研究開發(fā)一種機械性能佳，生物相容性好，早期可以促進自體組織長入，不容易引起免疫排斥反應的可降解腹壁缺損修復材料是臨床醫(yī)師的追求。
[0003]靜電紡絲(electrostatic spinning)又稱“電紡”,是一種使帶電荷的聚合物溶液或熔體在靜電場中噴射來制備聚合物超細纖維的加工方法，能夠快速簡單的制備直徑在納米級到微米級的纖維。由于納米級纖維直徑與天然細胞外基質(zhì)(ECM)中蛋白質(zhì)纖維的物理結(jié)構(gòu)相似，同時納米纖維結(jié)構(gòu)具有很高的比表面積和孔隙率，所以其可模擬ECM的結(jié)構(gòu)和功能，有利于細胞的粘附、增殖和組織再生。近年來，靜電紡絲技術已應用到多種組織修復領域，如皮膚、神經(jīng)、血管、骨和軟骨等。
[0004]隨著材料學的進展和電紡工藝的改進，許多天然材料(如明膠、殼聚糖等)和合成材料(如聚氨酯、聚己內(nèi)酯等)都已成功用于電紡技術。其中，合成材料聚己內(nèi)酯由于其良好的生物力學性質(zhì)和可降解性能在某些領域展現(xiàn)出良好的應用前景。但其親水性和生物相容性略差，細胞很難遷移至材料內(nèi)部。我們希望將脫細胞技術、電紡技術和聚己內(nèi)酯合成材料結(jié)合，為臨床腹壁缺損修復提供新的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于腹壁缺損的生物修復材料，該生物修復材料為一種聚已內(nèi)酯和骨骼肌脫細胞基質(zhì)共混靜電紡絲纖維膜，其能模擬正常的細胞外基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)，是一種具有良好生物相容性和生物力學性能的腹壁缺損修復材料。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明的實施方式提供了一種用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，包含以下步驟:
[0008](I)前期處理:取已死亡動物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，在無菌條件下剔除表面的脂肪組織和筋膜組織，再次沖洗；
[0009](2)脫細胞處理:將上述前期處理后的腹直肌肌肉組織進行反復凍融，然后漂洗，浸入到質(zhì)量濃度為I?10%的烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12?24小時；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；再加入含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液中，在37°C下振蕩24?36小時，將組織取出，沖洗后進行凍干處理，制得骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片；
[0010](3)消化:將上述骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片研磨成粉末后溶于胃蛋白酶溶液中，并使骨骼肌脫細胞基質(zhì)的濃度為5?10mg/ml ;然后在常溫下振蕩至肉眼看不到粉末，加入中和液使PH值調(diào)整為7.4，再進行凍干處理，得到骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒；
[0011](4)靜電紡絲:將上述骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒與聚已內(nèi)酯混合，并溶于六氟異丙醇中配置成共混液，所述骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒與聚已內(nèi)酯的質(zhì)量之和為共混液質(zhì)量的10%，且所述聚己內(nèi)酯的質(zhì)量為所述骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒質(zhì)量的25%?75% ;將共混液置于靜電紡絲裝置中進行紡絲，制得聚已內(nèi)酯/骨骼肌脫細胞基質(zhì)共混靜電紡絲纖維膜，烘干后即為用于腹壁缺損的生物修復材料。
[0012]本發(fā)明的實施方式將來源于腹壁組織的骨骼肌脫細胞基質(zhì)與聚己內(nèi)酯通過靜電紡絲技術組合在一起，制得一種新型的腹壁缺損修復材料，使其同時具有良好的生物相容性和生物力學性能。
[0013]本發(fā)明的實施方式所提供的生物修復材料的制備方法，相對于現(xiàn)有技術的區(qū)別之處首先在于對骨骼肌脫細胞基質(zhì)的選擇和制備過程。具體來說:首先，在修復材料的選擇上，不同組織器官的細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分具有一定的差異，同源性脫細胞基質(zhì)作為修復材料修復相應組織效果較好，而腹壁成分主要由肌肉組織組成，所以采用骨骼肌脫細胞基質(zhì)作為復合支架的生物性材料來源用于修復腹壁缺損，具有先天的優(yōu)勢。其次，在制備骨骼肌脫細胞基質(zhì)的步驟中:一方面，在保證脫細胞效果的基礎上，為了減少制備方法對支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)和活性的影響，采用了烷基糖苷進行脫細胞處理。烷基糖苷是由可再生資源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是一種性能較全面的新型非離子表面活性劑，無毒，且易于生物降解，對人體無害，性能溫和，對細胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)和活性蛋白幾乎沒有損傷；同時烷基糖苷還具有高表面活性、良好的生態(tài)安全性和相溶性。另一方面，為了進一步加強烷基糖苷脫細胞效果，本發(fā)明的實施方式還結(jié)合了凍融方法和核酸酶溶液共同處理腹壁骨骼肌，整個脫細胞基質(zhì)的制備步驟簡單、有效、成本低，在徹底除去存在于組織表面和內(nèi)部的細胞的基礎上，更好地保留骨骼肌脫細胞基質(zhì)的生物活性，為利用該脫細胞基質(zhì)結(jié)合聚己內(nèi)酯和靜電紡絲技術進一步制備出優(yōu)良的復合生物修復材料提供了基礎。
[0014]此外，本發(fā)明的實施方式所提供的生物修復材料的制備方法，相對于現(xiàn)有技術的區(qū)別之處還在于將制備得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)進一步與聚己內(nèi)酯材料和靜電紡絲技術的結(jié)合。聚己內(nèi)酯材料具有良好的生物學性質(zhì)和可降解性能，將其與骨骼肌脫細胞基質(zhì)結(jié)合，獲得一種很好的生物修復補片的基材；而靜電紡絲技術所制備得到的復合納米纖維結(jié)構(gòu)又能進一步地彌補聚己內(nèi)酯材料在其水性和生物相容性方面的不足，從而制備得到本發(fā)明的實施方式所提供的能模擬正常的細胞外基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)、具有良好生物相容性和生物力學性能的腹壁缺損修復材料。而且，本發(fā)明的實施方式所涉及的靜電紡絲技術，步驟簡單有效，制備材料均為可降解材料且降解產(chǎn)物對人體無害，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(I)中取已死亡動物的腹直肌肌肉組織時，供體動物為?；蜇i，取材時間為動物死亡后30分鐘內(nèi)。組織和器官的細胞外基質(zhì)提供了細胞發(fā)揮功能和維持表型的微環(huán)境，這種微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和成分在不同組織器官具有一定的差異，因此同源性脫細胞基質(zhì)材料修復相應組織的效果較好。肌肉脫細胞基質(zhì)來源的成分對于促進成肌細胞增殖和分化具有重要的影響，因此本發(fā)明的實施方式采用死亡動物的腹直肌肌肉組織作為制備生物修復材料的來源，可使最終制備得到的材料更好地適應于對腹壁肌肉缺失的生物修復。
[0016]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(I)中的兩次沖洗操作所采用的沖洗液為含有鏈霉素和青霉素的去離子水或PBS緩沖液；所述青霉素在所述沖洗液中的濃度為100 μ g/ml、所述鏈霉素在所述沖洗液中的濃度為100 μ g/ml O采用含有鏈霉素和青霉素雙抗的去離子水或PBS緩沖液作為沖洗液,對動物的腹直肌肌肉組織材料進行沖洗，可達到抑制細菌和真菌生長的作用。
[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(2)中所述的反復凍融的方法為:將所述腹直肌肌肉組織置于_80°C冰箱3?6小時，然后取出放在37°C水浴箱中30?60分鐘。上述對腹直肌組織進行反復凍融的作用為:凍融方法可以有效地使組織和器官中的細胞裂解，單次凍融可以減少免疫排斥反應，反復凍融多用于脫細胞處理。凍融處理最大的優(yōu)點是對組織的機械性能影響不大，因為其不會減少細胞外基質(zhì)膠原纖維的含量。
[0018]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(2)中所述的含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液，由DNA酶和RNA酶溶于0.05mol/L的MgCl2溶液中配置而成，其中，DNA酶的濃度為100?200μ g/ml，RNA酶的濃度為100?200 μ g/ml。在烷基糖苷處理后，采用含有核酸酶和脫氧核酸酶的MgCl2溶液繼續(xù)對腹直肌進行處理，裂解核酸的序列，可以清除細胞內(nèi)殘留的核酸物質(zhì)。
[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(3)中所述的胃蛋白酶溶液由胃蛋白酶溶于0.01mol/L的HCl中配制而成，所述胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的濃度為lmg/ml。消化步驟的作用是:單純的物理研磨方法后的骨骼肌脫細胞基質(zhì)粉末很難溶于六氟異丙醇溶液，結(jié)合胃蛋白酶消化法可以更好地使其溶于六氟異丙醇溶液中。
[0020]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(3)中所述的中和液為0.01mol/L的NaOH溶液。使用中和液調(diào)整經(jīng)胃蛋白酶消化后的骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒的PH值，可消除胃蛋白酶對骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒的進一步降解。
[0021]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(4)中所述聚已內(nèi)酯的分子量為14000。
[0022]優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，步驟(4)中進行靜電紡絲時，紡絲溫度為20?25°C，相對濕度為45?55%。
[0023]本發(fā)明的實施方式也提供根據(jù)上述方法制備得到的用于腹壁缺損的生物修復材料。該生物修復材料為骨骼肌脫細胞基質(zhì)/聚己內(nèi)酯復合納米纖維支架能夠更好的模擬細胞外基質(zhì)的組成成分和結(jié)構(gòu)，有利于誘導細胞粘附和增殖，為細胞生長和組織再生提供較好的生理微環(huán)境，根據(jù)復合納米纖維支架中聚己內(nèi)酯含量的不同，復合支架的力學性能可以有一定的調(diào)整，可同時適應其他不同組織的修復。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是實施例2中對骨骼肌脫細胞基質(zhì)(實施例1第(I)、(2)步驟制備得到)的脫細胞程度測定結(jié)果圖:
[0025]其中，圖1A為骨骼肌脫細胞基質(zhì)HE染色結(jié)果圖、圖1B為骨骼肌脫細胞基質(zhì)DAPI染色結(jié)果圖；
[0026]圖2是實施例2中對生物修復材料(實施例1制備得到)進行超微結(jié)構(gòu)和力學性能測定的結(jié)果圖:
[0027]其中，圖2A為生物修復材料的掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)示意圖、圖2B為將大鼠成纖維細胞種植在生物修復材料上3天后的掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)示意圖、圖2C為生物修復材料的力學性能示意圖；
[0028]圖3是實施例2中大鼠成纖維細胞在生物修復材料(實施例1制備得到)上的增殖活性結(jié)果圖；
[0029]圖4是實施例3的體內(nèi)試驗驗證生物修復材料(實施例1制備得到)在腹壁缺損中的應用的結(jié)果圖:
[0030]其中，圖4A為術后2周修復組織區(qū)域馬森染色結(jié)果圖、圖4B為術后2周修復組織區(qū)域免疫組化CD31染色結(jié)果圖、圖4C為術后3個月修復組織區(qū)域馬森染色結(jié)果圖、圖4D為術后3個月修復組織區(qū)域免疫組化⑶31染色結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0031]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節(jié)。但是，即使沒有這些技術細節(jié)和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護的技術方案。
[0032]實施例1制備試驗例
[0033](I)前期處理:供體豬取自當?shù)赝涝讏觯?5?30周齡，體重30?40kg，雌雄不限。麻醉藥安樂死后，選擇自劍突直到下腹的正中切口，游離皮下組織和淺筋膜暴露腹直肌組織，沿腹直肌表面剝離腹直肌前鞘，沿腹外斜肌腱膜完整取出腹直肌，使用O?8°C的去離子水或者Ph值為7.4左右的緩沖鹽溶液(PBS)反復沖洗以除去表面的血凝塊，無菌條件下剔除表面脂肪組織，筋膜組織后，剪成2 X 2cm2大小片狀，繼續(xù)用去離子水或者ph值為7.4左右的緩沖鹽溶液(PBS)進行沖洗。
[0034](2)脫細胞處理:本部分將凍融法，烷基糖苷和核酸酶溶液相結(jié)合進行脫細胞處理，步驟如下，將上述腹直肌組織置于_80°C冰箱4h，然后取出放在37°C水浴箱中30min，如此反復凍融3次。無菌去離子水漂洗30min后，將其浸入到I %烷基糖苷溶液中，常溫下置于搖床中以100rpm/min的速度振蕩12h。將烷基糖苷廢液倒掉，去離子水沖洗30min，PBS溶液沖洗 2 次，每次 30min。然后加入 150U/ml Dnase 和 100 μ g/ml Rnase 的 0.05M MgC12溶液中，以100rpm/min的速度在37°C搖床中振蕩24h。最后將組織取出，PBS沖洗2次，每次30min，去離子水沖洗2次，每次30min。將脫細胞后的腹直肌組織置于_50°C真空冷凍干燥機行凍干處理18h，無菌環(huán)境下保存于-80°C冰箱備用。
[0035](3)消化:將凍干后的骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片研磨成粉，溶于lmg/ml的胃蛋白酶中，并配成骨骼肌脫細胞基質(zhì)終濃度為10mg/ml的混合液，然后常溫下?lián)u床振蕩24?36小時，直至肉眼看不到骨骼肌脫細胞基質(zhì)粉末，混合液呈云霧狀后，把中和液加入到混合液中，將混合液的PH值調(diào)整為7.4左右，最后再凍干處理為微粒留待下一步使用。
[0036](4)靜電紡絲:將聚已內(nèi)酯和骨骼肌脫細胞基質(zhì)微?；旌先苡诹惐既芤褐?，配置成共混液，聚已內(nèi)酯和骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒的質(zhì)量之和為共混液質(zhì)量的10 %，其中聚已內(nèi)酯(購買自Sigma公司，產(chǎn)品編號為440752，分子量為14000)和骨骼肌脫細胞基質(zhì)質(zhì)量比為1:1，共混液置于靜電紡絲裝置的注射器中，將電壓設定為7kV，推進速度為2.0ml/h，接收距離為6cm，紡絲溫度為25°C，相對濕度為55%。進行靜電紡絲，形成聚已內(nèi)酯/骨骼肌脫細胞基質(zhì)共混靜電紡絲網(wǎng)，靜紡時間為2小時，將靜紡納米膜從接收平臺上小心剝離后，放置于50°C烘箱中烘干，得到聚已內(nèi)酯/骨骼肌脫細胞基質(zhì)共混靜電紡絲纖維膜，即為本發(fā)明的用于腹壁缺損的生物修復材料。
[0037]實施例2體外試驗
[0038](I)脫細胞程度測定:
[0039]骨骼肌脫細胞基質(zhì)材料經(jīng)石蠟包埋切片行蘇木素-伊紅染色(HE染色)(附圖1A所示)和4，6- 二脒基-2-苯基吲哚熒光染色(DAPI染色)(附圖1B所示)，均證實材料內(nèi)部無明顯細胞核殘留，蛋白膠原纖維呈不規(guī)則狀排列。
[0040](2)纖維結(jié)構(gòu)和力學性能測定:
[0041]對實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)/聚己內(nèi)酯共混靜電紡絲纖維膜進行掃描電鏡(SEM)檢測，顯示該材料的纖維結(jié)構(gòu)呈條索狀無序排列，纖維直徑在幾百納米與幾微米之間(附圖2A所示)。
[0042]將大鼠成纖維細胞種植在實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)/聚己內(nèi)酯共混靜電紡絲纖維膜上，3天后進行掃描電鏡(SEM)檢測，結(jié)果顯示示支架生物相容性較好，大鼠成纖維細胞在支架上黏附并增殖(附圖2B所示，*表示大鼠成纖維細胞)。
[0043]附圖2C顯示了實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)/聚己內(nèi)酯共混靜電紡絲纖維膜的力學性能(經(jīng)Instron拉伸測量機測得)。
[0044](3)細胞增殖能力檢測:
[0045]將大鼠成纖維細胞種植在實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)/聚己內(nèi)酯共混靜電紡絲纖維膜上，I天、3天、5天和7天分別行CCK-8細胞增殖實驗，結(jié)果顯示培養(yǎng)皿對照組和復合支架實驗組隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，細胞數(shù)量均明顯增殖，同一時間點下(除了第5天)，培養(yǎng)皿對照組細胞數(shù)量和實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質(zhì)/聚己內(nèi)酯共混靜電紡絲纖維膜實驗組數(shù)量無統(tǒng)計學差異(附圖3所示)。
[0046]實施例3體內(nèi)試驗驗證復合納米纖維膜在腹壁缺損中的應用
[0047]為檢驗實施例1所制備的聚已內(nèi)酯/骨骼肌脫細胞基質(zhì)纖維納米膜的具體效果，我們將其用于修補大鼠全層腹壁缺損模型，詳細步驟如下:將SD雌性大鼠(12只)給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4ml/100g)，常規(guī)腹部備皮，消毒鋪巾。取腹部正中縱行切口，長約5cm，切開皮膚皮下組織，沿切口向兩側(cè)鈍性分離皮下組織，將腹直肌連同其下腹橫肌、腹橫筋膜和腹膜一并切除，制備大小約為2X2cm2的大鼠腹壁全層缺損模型，以實施例1所制備的纖維納米膜支架修補，采用4-0絲線間斷縫合，皮膚和皮下組織用3-0絲線間斷縫合。術后大鼠分籠飼養(yǎng)。術后定期查看傷口情況，觀察有無切口感染，皮膚切口裂開，腹壁疝復發(fā)等情況，分別于術后2周和12周取材處死動物，每個時間點分別為6只。取材時，切口狀態(tài)，皮下血腫和積液情況應記錄下來。
[0048]修復效果評估包括:(I)大體觀察:所有大鼠術后活動及進食均正常。傷口一期愈合，有2只大鼠于術后I周左右時間出現(xiàn)血清腫，無菌注射器穿刺抽出后無后續(xù)并發(fā)癥出現(xiàn)。所有大鼠直到處死前均沒有任何臨床征兆表明存在修復部位的感染、疝形成、瘺形成及其它嚴重不良反應發(fā)生。(2)組織學檢測(新生膠原，血管):術后2周時，馬森染色(附圖4A所示)示支架所在的區(qū)域的外圍部分被炎性細胞浸潤，免疫組化CD31染色(附圖4B所示)示支架周圍新生毛細血管較多，整個區(qū)域新生膠原含量較少，且排列紊亂，不規(guī)整。術后3月時，馬森染色(附圖4C所示)示脫細胞基質(zhì)支架區(qū)域主要由成熟的成纖維細胞和其分泌的大量膠原構(gòu)成，膠原有一定的極性排列，毛細血管數(shù)量穩(wěn)定，分布較均勻(附圖4D所示)O
[0049]本領域的普通技術人員可以理解，上述各實施方式是實現(xiàn)本發(fā)明的具體實施例，而在實際應用中，可以在形式上和細節(jié)上對其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)前期處理:取已死亡動物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，在無菌條件下剔除表面的脂肪組織和筋膜組織，再次沖洗； (2)脫細胞處理:將上述前期處理后的腹直肌肌肉組織進行反復凍融，然后漂洗，浸入到質(zhì)量濃度為I?10%的烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12?24小時；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；再加入含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液中，在37°C下振蕩24?36小時，將組織取出，沖洗后進行凍干處理，制得骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片； (3)消化:將上述骨骼肌脫細胞基質(zhì)生物薄片研磨成粉末后溶于胃蛋白酶溶液中，并使骨骼肌脫細胞基質(zhì)的濃度為5?10mg/ml ;然后在常溫下振蕩至肉眼觀察到溶液呈均勻云霧狀時，加入中和液使PH值調(diào)整為7.4，再進行凍干處理，得到骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒； (4)靜電紡絲:將上述骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒與聚已內(nèi)酯混合，并溶于六氟異丙醇中配置成共混液，所述骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒與聚已內(nèi)酯的質(zhì)量之和為共混液質(zhì)量的10 %，且所述聚己內(nèi)酯的質(zhì)量為所述骨骼肌脫細胞基質(zhì)微粒質(zhì)量的25 %?75 將共混液置于靜電紡絲裝置中進行紡絲，制得聚已內(nèi)酯/骨骼肌脫細胞基質(zhì)共混靜電紡絲纖維膜，烘干后即為用于腹壁缺損的生物修復材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中取已死亡動物的腹直肌肌肉組織時，供體動物為?；蜇i，取材時間為動物死亡后30分鐘內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的兩次沖洗操作所采用的沖洗液為含有鏈霉素和青霉素的去離子水或PBS緩沖液；所述青霉素在所述沖洗液中的濃度為100 μ g/ml、所述鏈霉素在所述沖洗液中的濃度為 100 μ g/ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的反復凍融的方法為:將所述腹直肌肌肉組織置于_80°C冰箱3?6小時，然后取出放在37°C水浴箱中30?60分鐘；反復凍融的次數(shù)為3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，步驟⑵中所述的含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液，由DNA酶和RNA酶溶于0.05mol/L的MgCl2溶液中配置而成；其中，DNA酶的濃度為100?200 μ g/ml, RNA酶的濃度為100?200 μ g/ml ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的胃蛋白酶溶液由胃蛋白酶溶于0.0lmol/L的HCl中配制而成，所述胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的濃度為lmg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，步驟⑶中所述的中和液為0.01mol/L的NaOH溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述聚已內(nèi)酯的分子量為14000。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腹壁缺損的生物修復材料的制備方法，其特征在于，步驟(4)中進行靜電紡絲時，紡絲溫度為20?25°C，相對濕度為45?55%。
10.一種用于腹壁缺損的生物修復材料，所述生物修復材料根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任一項所述的方法制備得到。
【文檔編號】A61L27/18GK104353111SQ201410605499
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】顧巖, 楊志, 宋致成, 楊建軍, 聶鑫, 劉正尼, 王恵春 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院