一種低毒的刺五加注射液及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種低毒的刺五加注射液及其制備方法。其中刺五加注射液含有以下活性成分：含總黃酮1.8-5.5mg/ml、紫丁香苷0.13-0.70mg/ml和刺五加苷E0.06-0.34mg/ml，鉀離子的數(shù)量≤800μg/ml。本發(fā)明提供的刺五加注射液鉀離子含量低，該制劑的鉀離子含量控制由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中≤1000μg/ml，降至800μg/ml(或計(jì)為800μg/5mg總黃酮)以下；異常毒性小，安全性高。經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，受試對(duì)象耐受濃度由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的5mg/ml，提高達(dá)到18mg/ml。本發(fā)明提供的刺五加注射液，異常毒性檢驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于現(xiàn)有市售產(chǎn)品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種低毒的刺五加注射液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及刺五加注射液，具體涉及一種低毒的刺五加注射液。

【背景技術(shù)】
[0002] 刺五加為五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim. ) Harms 的干燥根和根莖或莖。具有益氣健脾，補(bǔ)腎安神的功效。性辛、微苦，溫。刺五加注射液為 刺五加經(jīng)提取加工制成的滅菌水溶液，功效為平補(bǔ)肝腎，益精壯骨。用于治療肝腎不足所致 的短暫性腦缺血發(fā)作，腦動(dòng)脈硬化，腦血栓形成，腦栓塞等。亦用于治療冠心病，心絞痛合并 神經(jīng)衰弱和更年期綜合癥等。
[0003] 包括刺五加注射液在內(nèi)的中藥注射劑，作為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展而產(chǎn)生的中藥新劑 型，克服了傳統(tǒng)中藥生物利用度低、起效慢等缺點(diǎn)，逐漸受到廣大患者的青睞。然而，臨床使 用過(guò)程中，中藥注射液不良反應(yīng)的報(bào)道日益增多，其安全性也越加受到重視。
[0004] 臨床研究表明：靜脈滴注含鉀離子的藥物時(shí)，會(huì)增加血液中鉀離子濃度，能夠?qū)е?心臟擴(kuò)張和無(wú)力，甚至導(dǎo)致死亡。鉀離子能夠減慢心率并且阻止心臟從心房到心室的搏動(dòng)， 其原因是細(xì)胞外的高濃度鉀離子減少了心肌纖維的靜息膜電位，導(dǎo)致動(dòng)作電位降低，心臟 收縮無(wú)力。如果細(xì)胞外的鉀離子濃度太高，靜息膜電位就會(huì)被消除，心肌細(xì)胞就不能產(chǎn)生搏 動(dòng)，從而心臟停止跳動(dòng)。
[0005] 因此，靜脈滴注含鉀離子的藥物時(shí)，鉀離子一般濃度不超過(guò)0.3%，而就現(xiàn)有中藥 注射劑而言，日最大使用劑量一般在IOOml以下，如：血塞通注射液4-16ml、舒血寧注射液 20ml、黃芪注射液20ml、雙黃連注射液60ml ;而刺五加注射液20ml規(guī)格200ml (含總黃酮 IOOOmg)和刺五加注射液250ml規(guī)格500ml (含總黃酮IOOOmg)的日最大使用劑量特殊情 況，為保證人民用藥的安全，有必要對(duì)刺五加注射液含鉀離子的數(shù)量進(jìn)行規(guī)定與精確測(cè)定。
[0006] 而現(xiàn)有中國(guó)專(zhuān)利，如CN201210049755. 1(下面簡(jiǎn)稱(chēng)2012年專(zhuān)利）公開(kāi)了一種刺五 加組合物含其制劑及其檢測(cè)方法，均未提到控制藥物中鉀離子含量的問(wèn)題。
[0007] 針對(duì)現(xiàn)有刺五加注射液中存在的問(wèn)題，發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的研究，最終提出了本發(fā) 明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種低毒的刺五加注射液。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于，提供該注射劑的制備方法。本發(fā)明提供的一種刺五加注 射液，含有以下活性成分：含總黃酮1. 8-5. 5mg/ml、紫丁香苷0. 13-0. 70mg/ml和刺五加苷 E0. 06-0. 34mg/ml，鉀離子的數(shù)量彡800 g/ml。優(yōu)選地，所述刺五加注射液含有以下活性成 分，按現(xiàn)有規(guī)格劃分：
[0010] 每支 20ml，總黃酮 4. 5-5. 5mg/ml、紫 丁香苷 0? 32-0. 70mg/ml 和刺五加苷 E 0? 15-0. 34mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 800 y g/ml ;
[0011] 每支1001111，含總黃酮2.7-3.311^/1111、紫丁香苷0.19-0.4211^/1111和刺五加苷￡ 0? 09-0. 20mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 500 Ii g/ml ;
[0012]每支250ml，含總黃酮I. 8-2. 2mg/ml、紫丁香苷0? 13-0. 28mg/ml和刺五加苷 E0. 06-0. 14mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 300 u g/ml。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述刺五加注射液含有以下活性成分，按現(xiàn)有規(guī)格劃分：
[0014]每支20ml，含總黃酮4. 5-5. 5mg/ml、紫丁香苷0? 32-0. 70mg/ml和刺五加苷E 0? 15-0. 34mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 550 yg/ml ;
[0015] 每支100ml，含總黃酮2. 7-3. 3mg/ml、紫丁香苷0? 19-0. 42mg/ml和刺五加苷E 0? 09-0. 20mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 360 y g/ml ;
[0016]每支250ml，含總黃酮I. 8-2. 2mg/ml、紫丁香苷0? 13-0. 28mg/ml和刺五加苷 E0. 06-0. 14mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 240 u g/ml。
[0017] 更進(jìn)一步優(yōu)選，所述刺五加注射液含有以下活性成分，按現(xiàn)有規(guī)格劃分：
[0018]每支 20ml，總黃酮 5. 14-5. 23mg/ml、紫 丁香苷 0? 36-0. 5mg/ml 和刺五加苷 E 0? 17-0. 25mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 550 y g/ml。
[0019] 本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的制備方法，該方法包括以下步驟：用水提取刺 五加藥材，得到的刺五加水煎膏經(jīng)過(guò)醇沉后，經(jīng)石硫法處理后，過(guò)大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附、洗脫， 洗脫液經(jīng)濃縮后再次醇沉，然后再經(jīng)過(guò)熱壓及超濾，得到刺五加提取物；經(jīng)配劑、灌封、滅 菌，即得刺五加注射液。
[0020] 上述方法中：
[0021] 所述刺五加提取物由以下方法制備：
[0022] (1)提?。河??12體積倍量的水提取刺五加藥材2?3次，每次提取1?2小 時(shí)，合并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用；
[0023] (2)第一次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入濃度為 93 %以上的乙醇使得含醇量為74-86 %，充分?jǐn)嚢?，靜置6小時(shí)以上，過(guò)濾，濾液回收乙醇 至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 10?1. 18,得到刺五加提取物的一次醇沉膏，備 用；
[0024] (3)石硫法處理：將步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏與水混合，攪拌均 勻后，進(jìn)行過(guò)濾，待濾液溫度40°C?50°C時(shí)，用20 %的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至10.0?12.0， 攪拌，再用20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 0?6. 0,繼續(xù)攪拌，靜置，濾取上清液并回收濃縮至 80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 14?1. 19,得到濃縮膏；
[0025] (4)大孔樹(shù)脂吸附：取步驟（3)得到的刺五加濃縮膏，用注射用水稀釋至總黃酮含 量為7. 5?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 0?5. 5,攪拌均勻，冷藏12小時(shí) 以上；冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值2. 0±0. 5,濾液以1. 5?2BV/h流速 上大孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速用〇. 3?0. 5倍柱體積純化水沖洗，然后用3?6體積倍 量的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 0?6. 5,將50 %洗脫液濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密 度為1. 13?1. 20,得到濃縮膏，備用；
[0026] (5)二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟⑷得到的濃縮膏中加入濃度為93%以上乙 醇使其含醇量為80?86%，充分?jǐn)嚢?，靜置12小時(shí)以上，濾取上清液，濾液回收乙醇至無(wú)醇 味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為I. 11?1.20,得刺五加提取物二次醇沉膏；
[0027] (6)熱壓及超濾：熱壓及超濾：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用注 射用水稀釋至總黃酮含量為7. 5?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. O?5. 0， 攪拌均勻，115?121°C滅菌30?40分鐘，冷藏12小時(shí)以上；冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò) 濾澄清后，調(diào)PH值5. 5 ± 0. 5，藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超 濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為I. 11?1. 20,即得到刺五加提取物。
[0028] 所述刺五加提取物中：
[0029] 所述第一次醇沉，包括以下步驟：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏 加入濃度為93%以上的乙醇使得含醇量為74. 5-75. 5%，充分?jǐn)嚢?，靜置6-18小時(shí)，過(guò)濾， 濾液回收乙醇至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為I. 11?1. 15,得到刺五加提取物的一 次醇沉膏。
[0030] 所述石硫法處理包括以下步驟：將步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏與 醇沉膏體積8-12倍量的水混合，攪拌均勻后過(guò)濾，待濾液溫度40°C?50°C時(shí)，用20%的石 灰乳調(diào)節(jié)pH值至10. 5?11. 5,攪拌，再用20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 1?5. 5,繼續(xù)攪拌， 靜置，濾取上清液并回收濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 16?1. 19,得到濃縮膏。
[0031] 所述大孔樹(shù)脂吸附包括以下步驟：將步驟（3)得到的刺五加濃縮膏，用注射用水 稀釋至總黃酮含量為8. 0?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. 0?5. 4,攪拌均 勻，冷藏12-14h ;冷藏后的藥液經(jīng)0. 45 y m微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值2. 0-2. 3,濾液以 I. 5BV/h的流速上大孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速用0. 3?0. 5倍柱體積純化水沖洗，然后 用3?5體積倍量的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 3?5. 5,將50%洗脫液濃縮至 相對(duì)密度為1. 15?1. 20,得到濃縮膏。
[0032] 所述二次醇沉包括以下步驟：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏加入93% 以上乙醇使得含醇量為84. 5-85. 5%，充分?jǐn)嚢?，靜置12-16小時(shí)，濾取上清液，濾液回收乙 醇至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 14?1. 16,得刺五加提取物二次醇沉膏。
[0033] 所述熱壓及超濾包括以下步驟：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用 注射用水稀釋至總黃酮含量為8. 0?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 2? 4. 8,攪拌均勻，115?121°C滅菌30?40分鐘，冷藏12小時(shí)，冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò) 濾澄清后，調(diào)PH值5. 2-5. 5,藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超 濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 15?1. 18,即得到刺五加提取物。
[0034] 優(yōu)選地，所述刺五加提取物由以下方法制備：
[0035] (1)提?。河??12體積倍量的水提取刺五加藥材2?3次，每次提取1?2小 時(shí)，合并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用；
[0036] (2)第一次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入濃度為 93?95%的乙醇使得含醇量為74. 5-75. 5%，攪拌15min后，靜置6?18小時(shí)，過(guò)濾，濾液 回收乙醇至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為I. 11?1. 15,得到刺五加提取物的一次醇 沉膏，備用；
[0037] (3)石硫法處理：將步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏與水混合，攪拌均 勻后，進(jìn)行過(guò)濾，待濾液溫度45°C時(shí)，用20%的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至10. 5?11. 5,攪拌，再用 20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 1?5. 5,繼續(xù)攪拌，靜置4?8小時(shí)，濾取上清液并回收濃縮至 80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 16?1. 19,得到濃縮膏；
[0038] (4)大孔樹(shù)脂吸附：取步驟（3)得到的刺五加濃縮膏，用注射用水稀釋至總黃酮含 量為8. O?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. O?5. 5,攪拌均勻，冷藏12? 18小時(shí)；冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值2. 0-2. 3,濾液以I. 5BV/h流速上大 孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速用〇. 3?0. 5倍柱體積純化水沖洗，然后用3?5體積倍量的 50 %乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 3?5. 5,將50 %洗脫液濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為 1. 13?1. 20,得到濃縮膏，備用；
[0039] (5)二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏中加入濃度為93?95% 乙醇使其含醇量為84?85. 5%，充分?jǐn)嚢?，靜置12?16小時(shí)，濾取上清液，濾液回收乙醇 至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 14?1. 16,得刺五加提取物二次醇沉膏；
[0040] (6)熱壓及超濾：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用注射用水稀釋至 總黃酮含量為8. O?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 2?4. 8,高溫蒸汽滅菌， 冷藏12小時(shí)；冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值5. 2?5. 5,藥液經(jīng)微孔濾膜 過(guò)濾澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 15?1. 20,即得 到刺五加提取物。
[0041]步驟（3)中，所述大孔樹(shù)脂的型號(hào)為 ADS-F8、ADS-17、HPD750、D101、HPD100、 HPD450、AB-8 或DM130。
[0042] 步驟⑷中，純化水的pH值為3.O。
[0043] 本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的制備方法，該方法包括以下步驟：刺五加提取 物用水稀釋至總黃酮6. O?10mg/ml，加入活性炭，回流煮沸吸附15min，冷卻40-50°C， 0. 45 y m濾膜過(guò)濾至澄清，用1萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，再過(guò)濾，收集并合并 濾液，停止超濾，濾液調(diào)pH值至5. O?6. 0,藥液經(jīng)0. 22 ii m濾芯精濾，分裝，經(jīng)高溫蒸汽滅 菌，冷卻，即得。
[0044] 優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：刺五加提取物用水稀釋至總黃酮6. Omg/ml，加 入0. 2%活性炭，回流煮沸吸附15分鐘，冷卻至40-50°C，經(jīng)0. 45 y m濾膜過(guò)濾至澄清；用1 萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，適量頂水，停止超濾，送檢、根據(jù)含量稀釋至總黃酮 2-511^/1111，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)？11值5.2?5.5 ;藥液經(jīng)0.2211111濾芯精濾，灌裝于2〇1111 或250ml、500ml安瓶中，封口；高溫蒸汽滅菌，并及時(shí)冷卻至60°C以下，即得刺五加注射液。
[0045] 上述制備方法中，所用的微孔濾膜的孔徑均為0. 45 y m。
[0046] 所述高溫蒸汽滅菌是指115?121 °C蒸汽滅菌30?40分鐘。
[0047] 本發(fā)明提供的刺五加注射液具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0048] 1、本發(fā)明制備低濃度鉀離子注射液的原因：在石硫法處理后，先經(jīng)大孔樹(shù)脂處理， 去掉多余雜質(zhì)，減少離子的同時(shí)也會(huì)增加部分其它離子，再經(jīng)二次醇沉后，形成雜質(zhì)的同時(shí) 會(huì)吸附鉀離子，一同除去。
[0049] 2、本發(fā)明提供的刺五加注射液鉀離子含量低，該制劑的鉀離子含量控制由國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)中 < 1000 U g/ml，降至 800 ii g/ml (或計(jì)為 800 ii g/5mg 總黃酮），甚至 550 ii g/ml 以下； 異常毒性小，安全性高。
[0050] 3、經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，受試對(duì)象耐受濃度由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的5mg/ml，提高達(dá)到 18mg/ml。本發(fā)明提供的刺五加注射液，異常毒性檢驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于現(xiàn)有市售產(chǎn)品。
[0051] 初步確定本發(fā)明提供的刺五加注射劑的安全性，希望為刺五加注射劑的臨床使用 打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0053] 實(shí)施例1 :刺五加提取物的制備
[0054] (1)提?。河?2體積倍量的水（72L)提取刺五加藥材6kg 3次，每次提取1小時(shí)， 合并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用；
[0055] (2) -次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入95%乙醇 (使含醇量達(dá)75% )，充分?jǐn)嚢瑁o置6小時(shí)；過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，繼續(xù)濃縮至相 對(duì)密度為1. 15 (80°C測(cè)），得到刺五加提取物的一次醇沉膏，備用；
[0056] (3)石硫法處理：取步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏適量加入盛有適 量的純化水的罐中，補(bǔ)加純化水至純化水的用量為醇沉膏體積10倍量（v/v)，攪拌15min 后，進(jìn)行過(guò)濾，待濾液加熱至溫度45°C時(shí)，用20%的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至11.0,攪拌15min， 再用20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5,繼續(xù)攪拌15min，靜置4小時(shí)，開(kāi)始濾取上清液回收濃縮 至相對(duì)密度為I. 19(80°C測(cè)），得到濃縮膏；
[0057] (4)大孔樹(shù)脂吸附：取步驟（3)得到的濃縮膏適量，加入注射用水稀釋至Iml含總 黃酮約10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. 0,攪拌均勻，冷藏12小時(shí)；冷藏后的 藥液經(jīng)0. 45 ii m微孔濾膜過(guò)濾澄清后，用稀HCl調(diào)pH值2. 0,濾液以I. 5BV/h流速上DlOl 大孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速（I. 5BV/h)用0. 3倍柱體積純化水（pH值為3. 0)沖洗，然 后用4倍量的50 %乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 4,將50 %洗脫液濃縮至相對(duì)密度為 I. 13(80°C測(cè)），得到濃縮膏，備用；
[0058] (5)二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏中加入95%乙醇（使含醇 量達(dá)85. 5% )，攪拌15min，靜置16小時(shí)，濾取上清液（剩余藥渣離心后過(guò)濾取上清液），濾 液回收乙醇至無(wú)醇味并濃縮至相對(duì)密度為I. 14(80°C測(cè)），收膏得刺五加提取物二次醇沉 膏，備用；
[0059] (6)熱壓及超濾：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用注射用水稀釋至 總黃酮含量為10. 〇mg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 2,攪拌均勻，121°C滅菌30分 鐘，冷藏12小時(shí)。冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值5. 5,藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾 澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 17 (80°C測(cè)），即得到 刺五加提取物。
[0060] 實(shí)施例2:刺五加提取物的制備
[0061] (1)提?。河?體積倍量的水（64L)提取刺五加藥材8kg 2次，每次提取2小時(shí)， 合并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用；
[0062] (2) -次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入93%乙醇 (使含醇量達(dá)74. 5% )，充分?jǐn)嚢?，靜置12小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，繼續(xù)濃縮至 相對(duì)密度為I. 11 (80°C測(cè)），得到刺五加提取物的一次醇沉膏，備用；
[0063] (3)石硫法處理：取步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏適量加入盛有適 量的純化水的罐中，補(bǔ)加純化水至純化水的用量為醇沉膏體積12倍量（v/v)，攪拌15min 后，進(jìn)行過(guò)濾，待濾液加熱至溫度45°C時(shí)，用20%的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至11. 5,攪拌15min， 再用20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 3,繼續(xù)攪拌15min，靜置6小時(shí)，開(kāi)始濾取上清液回收濃縮 至相對(duì)密度為I. 17(80°C測(cè)），得到濃縮膏；
[0064] (4)大孔樹(shù)脂吸附：取步驟⑶得到的濃縮膏適量，加入注射用水稀釋至Iml含總 黃酮約8. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. 2,攪拌均勻，冷藏14小時(shí)；冷藏后的藥 液經(jīng)0. 45 ii m微孔濾膜過(guò)濾澄清后，用稀HCl調(diào)pH值2. 3,濾液以I. 5BV/h流速上HPDlOO 大孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速（1.5BV/h)用0.4倍柱體積純化水（pH值為3.0)沖洗，然 后用5倍量的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 3,將50 %洗脫液濃縮至相對(duì)密度為 I. 14(80°C測(cè)），得到濃縮膏，備用；
[0065] (5)二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏中加入95%乙醇（使含醇 量達(dá)84. 5% )，攪拌15min，靜置14小時(shí)，濾取上清液（剩余藥渣離心后過(guò)濾取上清液），濾 液回收乙醇至無(wú)醇味并濃縮至相對(duì)密度為1. 15 (80°C測(cè)），收膏得刺五加提取物二次醇沉 膏，備用；
[0066] (6)熱壓及超濾：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用注射用水稀釋至 總黃酮含量為8. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 5,攪拌均勻，121°C滅菌35分 鐘，冷藏12小時(shí)。冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值5. 4,藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾 澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 18 (80°C測(cè)），即得到 刺五加提取物。
[0067] 實(shí)施例3:刺五加提取物的制備
[0068] (1)提取：用12體積倍量的水（120L)提取刺五加藥材IOkg2次，每次提取1. 5小 時(shí)，合并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用；
[0069] (2) -次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入95%乙醇 (使含醇量達(dá)75. 5% )，充分?jǐn)嚢瑁o置18小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，繼續(xù)濃縮至 相對(duì)密度為1. 14 (80°C測(cè)），得到刺五加提取物的一次醇沉膏，備用；
[0070] (3)石硫法處理：取步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏適量加入盛有適 量的純化水的罐中，補(bǔ)加純化水至純化水的用量為醇沉膏體積8倍量（v/v)，攪拌15min后， 進(jìn)行過(guò)濾，待濾液加熱至溫度45°C時(shí)，用20%的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至10. 5,攪拌15min，再用 20 %的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 1,繼續(xù)攪拌15min,靜置8小時(shí),開(kāi)始濾取上清液回收濃縮至相 對(duì)密度為I. 16(80°C測(cè)），得到濃縮膏；
[0071] (4)大孔樹(shù)脂吸附：取步驟（3)得到的濃縮膏適量，加入注射用水稀釋至Iml含總 黃酮約10. 〇mg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. 4,攪拌均勻，冷藏12小時(shí)；冷藏后的 藥液經(jīng)0. 45 ii m微孔濾膜過(guò)濾澄清后，用稀HCl調(diào)pH值2. 2,濾液以I. 5BV/h流速上DM130 大孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速（I. 5BV/h)用0. 3倍柱體積純化水（pH值為3. 0)沖洗，然 后用3倍量的50 %乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 4,將50 %洗脫液濃縮至相對(duì)密度為 I. 15(80°C測(cè)），得到濃縮膏，備用；
[0072] (5)二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏中加入95%乙醇（使含醇 量達(dá)85.0% )，攪拌15min，靜置12小時(shí)，過(guò)濾，濾取上清液（剩余藥渣離心后過(guò)濾取上清 液），濾液回收乙醇至無(wú)醇味并濃縮至相對(duì)密度為1. 16 (80°C測(cè)），收膏得刺五加提取物二 次醇沉膏，備用；
[0073] (6)熱壓及超濾：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用注射用水稀釋至 總黃酮含量為10. 〇mg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 8,攪拌均勻，115°C滅菌40分 鐘，冷藏12小時(shí)，冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)pH值5. 2,藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾 澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 15 (80°C測(cè)），即得到 刺五加提取物。
[0074] 實(shí)施例4:制備刺五加注射液（每支20ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)IOOmg)
[0075] 取實(shí)施例1得到的刺五加提取物，用注射用水稀釋至總黃酮6. Omg/ml，加入IOg活 性炭，回流煮沸吸附15min(是指加入炭后、回流加熱至煮沸，開(kāi)始計(jì)時(shí)15min，下同），冷卻 至50°C，經(jīng)0. 45 y m濾膜過(guò)濾至澄清；用1萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，適量頂 水，根據(jù)含量稀釋至總黃酮5. Omg/ml，用20 %氫氧化鈉溶液調(diào)pH值5. 5;藥液經(jīng)0. 22 ii m濾 芯精濾，灌裝20ml，封口；經(jīng)高溫蒸汽滅菌，冷卻，即得刺五加注射液。
[0076] 實(shí)施例5 :制備刺五加注射液（每支IOOml,含總黃酮類(lèi)物質(zhì)300mg)
[0077] 配劑、灌封、滅菌：取實(shí)施例2得到的刺五加提取物，用注射用水稀釋至總黃酮 7. 5mg/ml，加入12g活性炭，回流煮沸吸附15min，冷卻至40°C，經(jīng)0. 45 ii m濾膜過(guò)濾至澄 清；用1萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，適量頂水，根據(jù)含量稀釋至總黃酮3. Omg/ ml，用20 %氫氧化鈉溶液調(diào)pH值5. 4 ;藥液經(jīng)0. 22 ii m濾芯精濾，灌裝IOOml，封口；經(jīng)高溫 蒸汽滅菌，冷卻，即得刺五加注射液。
[0078] 實(shí)施例6 :制備刺五加注射液（每支250ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)500mg)
[0079] 配劑、灌封、滅菌：取實(shí)施例3得到的刺五加提取物，用注射用水稀釋至總黃酮 10. Omg/ml，加入IOg活性炭，回流煮沸吸附15min，冷卻至45°C，經(jīng)0. 45 ii m濾膜過(guò)濾至澄 清；用1萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，適量頂水，根據(jù)含量稀釋至總黃酮2. Omg/ ml，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值5.2;藥液經(jīng)0.22 iim濾芯精濾，灌裝250ml，封口；經(jīng)高溫 蒸汽滅菌，冷卻，即得刺五加注射液。
[0080] 實(shí)施例7:制備刺五加注射液（每支250ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)500mg)
[0081] 配劑、灌封、滅菌：取實(shí)施例3得到的刺五加提取物，用注射用水稀釋至總黃酮 8. Omg/ml，加入15g活性炭，回流煮沸吸附15min，冷卻至50°C，經(jīng)0. 45 ii m濾膜過(guò)濾至澄 清；用1萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，適量頂水，根據(jù)含量稀釋至總黃酮2. Omg/ ml，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值5.5;藥液經(jīng)0.22 iim濾芯精濾，灌裝250ml，封口；經(jīng)高溫 蒸汽滅菌，冷卻，即得刺五加注射液。
[0082] 實(shí)驗(yàn)例1:檢驗(yàn)鉀離子含量
[0083] 1、受試藥物
[0084] 市售品1，每支20ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)IOOmg;
[0085] 市售品2,每支20ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)IOOmg;
[0086] 市售品3的三種刺五加注射液，其中每支20ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)IOOmg;每支 IOOml,含總黃酮類(lèi)物質(zhì)300mg ;每支250ml，含總黃酮類(lèi)物質(zhì)500mg ;
[0087] 實(shí)施例4-7制成的刺五加注射液；
[0088] 對(duì)比例1-3:參照申請(qǐng)?zhí)枮?01210049755. 1的專(zhuān)利的實(shí)施例8、9、10制備得到刺 五加注射液。
[0089] 2、檢測(cè)方法1:按2010年版《中國(guó)藥典》附錄IX S注射劑有關(guān)物質(zhì)檢查法
[0090] 鉀離子取注射液2ml，蒸干，先用小火熾灼至炭化，再在500-600°C熾灼至完全灰 化，加稀醋酸2ml使溶解。置25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，作為供試品溶液。取IOml 納氏比色管兩支，甲管中精密加入標(biāo)準(zhǔn)鉀離子溶液（取硫酸鉀適量，研細(xì)，于IKTC干燥至 恒重，精密稱(chēng)取2. 23g，置IOOOml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備 液。臨用前，精密量取貯備液l〇ml，置IOOml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。每Iml 相當(dāng)于100 U g的K)0. 8ml，加堿性甲醛溶液（取甲醛溶液，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH值至8. 0-9. 0) 0. 6ml、3 %乙二胺四醋酸二鈉溶液2滴、3 %四苯硼鈉溶液0. 5ml，加水稀釋 成10ml，乙管中精密加入供試品溶液lml，與甲管同時(shí)依法操作，搖勻，甲、乙兩管同置黑紙 上，自上向下透視，乙管中顯出的濁度與甲管比較，不得更濃（K彡IOOOy g/ml)。
[0091] 3、檢測(cè)方法2 :原子吸收光度法測(cè)定鉀離子含量
[0092] 1)儀器與試劑
[0093] 儀器：HITACHI 180-50型原子吸收分光光度計(jì)，日本日立公司。
[0094] 2)溶液的制備
[0095] 對(duì)照品溶液的制備取K儲(chǔ)備液用超純水稀釋制成高、低2種濃度的對(duì)照品溶液。
[0096] 供試品溶液的制備取刺五加注射劑，用超純水稀釋50?100倍，搖勻，即得。
[0097] 3)測(cè)定法
[0098] 取對(duì)照品溶液和供試品溶液采用火焰法測(cè)定供試品溶液中K的含量，計(jì)算離子的 含量（mg/ml)。測(cè)試參數(shù)及對(duì)照品溶液濃度見(jiàn)下表1。
[0099] 表1測(cè)試參數(shù)及對(duì)照品溶液

【權(quán)利要求】
1. 一種刺五加注射液，其特征在于，含有以下活性成分：含總黃酮I. 8-5. 5mg/ml、紫丁 香苷0. 13-0. 70mg/ml和刺五加苷EO. 06-0. 34mg/ml，鉀離子的數(shù)量彡800 ii g/ml。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，所述刺五加注射液含有以下活性成分， 按現(xiàn)有規(guī)格劃分： 每支20ml，總黃酮4. 5-5. 5mg/ml、紫丁香苷0? 32-0. 70mg/ml和刺五加苷E 0? 15-0. 34mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 800 y g/ml ; 每支100ml，含總黃酮2. 7-3. 3mg/ml、紫丁香苷0? 19-0. 42mg/ml和刺五加苷E 0? 09-0. 20mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 500 y g/ml ; 每支250ml，含總黃酮I. 8-2. 2mg/ml、紫丁香苷0? 13-0. 28mg/ml和刺五加苷 E0. 06-0. 14mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 300 u g/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，所述刺五加注射液含有以下活性成分， 按現(xiàn)有規(guī)格劃分： 每支20ml，含總黃酮4. 5-5. 5mg/ml、紫丁香苷0? 32-0. 70mg/ml和刺五加苷E 0? 15-0. 34mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 550 y g/ml ; 每支100ml，含總黃酮2. 7-3. 3mg/ml、紫丁香苷0? 19-0. 42mg/ml和刺五加苷E 0? 09-0. 20mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 360 y g/ml ; 每支250ml，含總黃酮I. 8-2. 2mg/ml、紫丁香苷0? 13-0. 28mg/ml和刺五加苷 E0.06-0. 14mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 240iig/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，所述刺五加注射液含有以下活性成分， 按現(xiàn)有規(guī)格劃分： 每支20ml，總黃酮5. 14-5. 23mg/ml、紫丁香苷0? 36-0. 5mg/ml和刺五加苷E 0? 17-0. 25mg/ml，鉀離子的數(shù)量< 550 y g/ml。
5. -種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的注射液的方法，其特征在于，該方法包括以下 步驟：刺五加提取物，用注射用水稀釋?zhuān)^(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值，精濾，灌封、滅菌，即得刺五加注射 液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述刺五加提取物由以下方法制備： (1) 提?。河??12體積倍量的水提取刺五加藥材2?3次，每次提取1?2小時(shí)，合 并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用； (2) 第一次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入濃度為93% 以上的乙醇使得含醇量為74-86%，充分?jǐn)嚢瑁o置6小時(shí)以上，過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)醇 味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 10?1. 18,得到刺五加提取物的一次醇沉膏，備用； (3) 石硫法處理：將步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏與水混合，攪拌均勻 后，進(jìn)行過(guò)濾，待濾液溫度40°C?50°C時(shí)，用20%的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至10. 0?12. 0,攪拌， 再用20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 0?6. 0,繼續(xù)攪拌，靜置，濾取上清液并回收濃縮至80°C時(shí) 相對(duì)密度為1. 14?1. 19,得到濃縮膏； (4) 大孔樹(shù)脂吸附：取步驟（3)得到的刺五加濃縮膏，用注射用水稀釋至總黃酮含量為 7. 5?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 0?5. 5,攪拌均勻，冷藏12小時(shí)以上； 冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)PH值2. 0±0. 5,濾液以1. 5?2BV/h流速上大孔 樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速用〇. 3?0. 5倍柱體積純化水沖洗，然后用3?6體積倍量的 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. O?6. 5,將50 %洗脫液濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為 1. 13?1. 20,得到濃縮膏，備用； (5) 二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏中加入濃度為93%以上乙醇使 其含醇量為80?86%，充分?jǐn)嚢?，靜置12小時(shí)以上，濾取上清液，濾液回收乙醇至無(wú)醇味， 并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為I. 11?1. 20,得刺五加提取物二次醇沉膏； (6) 熱壓及超濾：熱壓及超濾：取步驟（5)得到的刺五加提取物二次醇沉膏，用注射用 水稀釋至總黃酮含量為7. 5?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值4. 0?5. 0,攪拌 均勻，115?121 °C滅菌30?40分鐘，冷藏12小時(shí)以上；冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄 清后，調(diào)PH值5. 5±0. 5,藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超濾， 濾液濃縮至相對(duì)密度為I. 11?1. 20,即得到刺五加提取物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一次醇沉，包括以下步驟：在攪 拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏加入濃度為93%以上的乙醇使得含醇量為 74. 5-75. 5%，充分?jǐn)嚢瑁o置6-18小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相 對(duì)密度為I. 11?1. 15,得到刺五加提取物的一次醇沉膏。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述大孔樹(shù)脂吸附包括以下步驟：將步驟 (3)得到的刺五加濃縮膏，用注射用水稀釋至總黃酮含量為8. 0?10. Omg/ml，攪拌均勻后， 過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. 0?5. 4,攪拌均勻，冷藏12-14h ;冷藏后的藥液經(jīng)0. 45 ii m微孔濾膜 過(guò)濾澄清后，調(diào)PH值2. 0-2. 3,濾液以I. 5BV/h的流速上大孔樹(shù)脂柱，然后以同樣的流速用 0. 3?0. 5倍柱體積純化水沖洗，然后用3?5體積倍量的50 %乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào) pH為5. 3?5. 5,將50%洗脫液濃縮至相對(duì)密度為1. 15?1. 20,得到濃縮膏。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述刺五加提取物由以下方法 制備： (1) 提?。河??12體積倍量的水提取刺五加藥材2?3次，每次提取1?2小時(shí)，合 并提取液，濃縮，得到刺五加水煎膏，備用； (2) 第一次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（1)得到的刺五加水煎膏中加入濃度為93? 95%的乙醇使得含醇量為74. 5-75. 5%，攪拌15min后，靜置6?18小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙 醇至無(wú)醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為I. 11?1. 15,得到刺五加提取物的一次醇沉膏， 備用； (3) 石硫法處理：將步驟（2)得到的刺五加提取物的一次醇沉膏與水混合，攪拌均勻 后，進(jìn)行過(guò)濾，待濾液溫度45°C時(shí)，用20%的石灰乳調(diào)節(jié)pH值至10. 5?11. 5,攪拌，再用 20%的硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 1?5. 5,繼續(xù)攪拌，靜置4?8小時(shí)，濾取上清液并回收濃縮至 80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 16?1. 19,得到濃縮膏； (4) 大孔樹(shù)脂吸附：取步驟（3)得到的刺五加濃縮膏，用注射用水稀釋至總黃酮含量為 8. 0?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò)濾，濾液調(diào)pH值5. 0?5. 5,攪拌均勻，冷藏12?18小時(shí)； 冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，調(diào)PH值2. 0-2. 3,濾液以I. 5BV/h流速上大孔樹(shù)脂 柱，然后以同樣的流速用〇. 3?0. 5倍柱體積純化水沖洗，然后用3?5體積倍量的50 %乙 醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)pH為5. 3?5. 5,將50%洗脫液濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 13? 1.20,得到濃縮膏，備用； (5) 二次醇沉：在攪拌條件下，向步驟（4)得到的濃縮膏中加入濃度為93?95%乙醇 使其含醇量為84?85. 5%，充分?jǐn)嚢瑁o置12?16小時(shí)，濾取上清液，濾液回收乙醇至無(wú) 醇味，并濃縮至80°C時(shí)相對(duì)密度為1. 14?1. 16,得刺五加提取物二次醇沉膏； (6)熱壓及超濾：用注射用水稀釋至總黃酮含量為8. O?10. Omg/ml，攪拌均勻后，過(guò) 濾，濾液調(diào)PH值4. 2?4. 8,高溫蒸汽滅菌，冷藏12小時(shí)；冷藏后的藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄 清后，調(diào)PH值5. 2?5. 5,藥液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾澄清后，先后進(jìn)行10萬(wàn)、3萬(wàn)級(jí)的二級(jí)超濾， 濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 15?1. 20,即得到刺五加提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：刺五加提取物用水 稀釋至總黃酮6. 0?10mg/ml，加入活性炭，回流煮沸吸附15min，冷卻40-50°C，0. 45 ii m濾 膜過(guò)濾至澄清，用1萬(wàn)超濾膜過(guò)濾，濾至透過(guò)液沒(méi)有流量時(shí)，再過(guò)濾，收集并合并濾液，停止 超濾，濾液調(diào)PH值至5. 0?6. 0,藥液經(jīng)0. 22 y m濾芯精濾，分裝，經(jīng)高溫蒸汽滅菌，冷卻，即 得。
【文檔編號(hào)】A61K36/254GK104306417SQ201410508745
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】方同華, 陳景超, 馮慧, 喬云峰, 許照芹, 劉玉成, 季慶亮, 席桂才, 周廣紅, 范玉奇 申請(qǐng)人:哈爾濱珍寶制藥有限公司