一種p53-mdm2相互作用的抑制劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種P53-MDM2相互作用的抑制劑及其應用，所述P53-MDM2相互作用的抑制劑為靈芝酸X、靈芝酸Me、靈芝酸Y、靈芝酸T或靈芝酸F；或靈芝酸X、靈芝酸Me、靈芝酸Y、靈芝酸T、靈芝酸F中之一與藥理學上允許的添加成分組合而成的組合物。本發(fā)明的P53-MDM2相互作用的抑制劑在促腫瘤細胞凋亡中的應用，特別是在促表達P53蛋白的95-D肺癌細胞或不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞凋亡中的應用，該P53-MDM2相互作用的抑制劑具有顯著地抑制人惡性肺癌腫瘤細胞中MDM2活性，從而抑制P53蛋白的降解，進一步促進含有p53的腫瘤細胞的凋亡。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種P53-MDM2相互作用的抑制劑及其在由P53介導的誘導腫瘤細胞 凋亡中的應用。 -種P53-MDM2相互作用的抑制劑及其應用

【背景技術】
[0002] 隨著生活方式、環(huán)境條件及人口老齡化等影響腫瘤發(fā)生發(fā)展因素的改變，自20 世紀7〇年代以來，我國腫瘤發(fā)生率呈明顯上升趨勢，現已成為城、鄉(xiāng)居民的首要死因。腫 瘤的共同特性是由于正常細胞凋亡系統(tǒng)的缺陷導致細胞凋亡失調，具有無限增生的能力 (Carcinogenesis， 21:485, 2〇00)。因此，直接抑制癌細胞中的細胞凋亡方面起著中心作用 的靶向負調節(jié)劑代表了新抗癌藥物設計的一種很有前景的治療策略。
[0003] 靈芝（Ganoderma lucidum)是一種傳統(tǒng)的藥用真菌，《中華人民共和國藥典》收錄 了靈芝作為法定中藥材，2001年靈芝被列入《可用于保健食品的真菌菌種名單》。靈芝具有 抗腫瘤、免疫調節(jié)等作用。三萜類化合物是靈芝類的主要化學成分之一，自1982年T Kubota (Helv. Chim. Acta, 65(2)，611-619，1982)等人首次分離得到該類化合物以后，迄今 為止已分離得到140多種同類化合物。自Toth 0(Tetrahedron Letter, 24: 1081-1084, 1983)等報道靈芝三萜類化合物的抗癌活性以來，多種靈芝酸被證實具有抑制腫瘤增殖和 轉移功能。
[0004] 有關靈芝抗腫瘤的專利和文獻，主要是靈芝子實體或孢子粉和其他藥物配伍及靈 芝酸單體，用于抑制癌癥的體內體外實驗研究：專利CN1483423報道了一種治療惡性腫瘤 的中藥制劑及其制備方法，該中藥制劑是以半枝蓮、靈芝、雞血藤、生地、枸杞子等為主要原 料，對各種腫瘤皆有很好的療效。專利CN 1480208報道了一種用于放化療減毒增效的藥物 組合物及其制備方法，這種藥物由黃芪、枸杞、靈芝按重量配比制成。專利CN 1421227報道 了包含靈芝的用于治療與預防輻射線損傷的藥物。專利CN 1286119報道了一種靈芝保健 品及其制備方法，靈芝酸純度為15%，對腫瘤的抑制率達30%上。CN 1709264公開了靈芝 酸T和靈芝酸Me在腫瘤生長或增殖抑制劑中的應用。文獻報道：靈芝酸T體外誘導腫瘤細 胞凋亡的途徑是依賴于線粒體的內源性凋亡途徑（Life sciences, (80) :205-211,2006)。
[0005] 近年來，關于蛋白-蛋白相互作用小分子抑制劑的研究已經成為藥物化學家關注 的熱點，P53-HDM2的相互作用已成為近年腫瘤藥物研究的一個主要領域，抑制HDM2與Ρδ3 相互作用無疑為新藥研究提供了一個很好的作用點。
[0006] 腫瘤抑制基因 Ρ53是一個轉錄激活因子，它可以調控細胞生長，當細胞中DNA受 到損傷時，Ρ53會上調有關基因進行DNA修復，使受損細胞處于細胞周期G1的停滯狀態(tài)， 并誘導過度受損細胞進行凋亡，從而避免發(fā)生癌變。Ρ53的突變與很多癌癥的發(fā)生有關， Ρ53腫瘤抑制基因在控制細胞周期進行和細胞凋亡中起著重要作用（Nature，408:307， 2000)，。p53的活性由蛋白MDM2來調控。通過兩種不同機制起作用：（1)直接與p 53結合， 抑制其正常結合功能使之不能形成轉錄復合物；（2)通過蛋白酶體途徑靶向P53,使其泛 素化并降解。MDM2是一種p53的關鍵負向調節(jié)劑。其通過結合至 P53的氨基終端轉活化 區(qū)而形成一種負向自動調節(jié)回路，所以，在具有野生型p53的腫瘤中，活性p53的平衡濃度 可通過拮抗MDM2和p53間的相互作用而增加，將導致在這種腫瘤細胞中P53介導的凋亡。 MDM2除了抑制P53的外，還直接與pRb-調節(jié)的轉錄因子E2F1/DP1相互作用，因為MDM2與 P53和E2F1的相互作用均位于MDM2的相同結合部位，可預期MDM2/P 53拮抗劑將不僅活化 細胞的P53,而且也調整E2F1的活性，而E2F1的活性在腫瘤細胞中通常是不受調節(jié)的。因 此，MDM2和P53的相互作用的抑制提供一種以野生型p53治療性干預腫瘤的方法，甚至在 缺乏功能性P53的腫瘤細胞中也顯示抗增殖效果。
[0007] 關于MDM2和P53間相互作用的抑制劑的專利和文獻：Weissman等在2005年通 過高通量篩選得到MDM2抑制劑（Cancer Cell，7 :547,2005. )，Hardcastle和Lunec等也在 2005年報道了異吲哚啉酮類小分子抑制劑（Mol. Cancer Then4 :1019, 2005.)，美國強生 公司Koblish等在2006年報道了一種利用Thermo Fluor微量量熱法來發(fā)現P53HTOM2小分 子抑制劑的技術（Mol. Cancer Ther.,5:160，2006.)。柳 00/15357 提供了哌嗪-4-苯 基衍生物作為MDM2和P53間相互作用的抑制劑。EP 1137418提供了三環(huán)化合物，用于恢 復P53家族蛋白質的構形穩(wěn)定性。W0 03/041715描述了取代的1，4_苯并二氮雜革及其作 為MDM2-P53相互作用抑制劑的用途。W0 03/51359提供了順式_2,4,5_三苯基-咪唑酮， 其抑制MDM2蛋白質與類P53肽的相互作用且具有抗增殖活性。W0 04/05278公開了雙芳基 磺酰胺化合物，其結合MDM2且可用于治療癌癥。CN101023074公開了 MDM2及P53間相互 作用的抑制劑的合成的小分子化合物。CN 101405285公開了作為MDM2和P53間相互作用 的抑制劑的環(huán)狀-烷基胺衍生物。CN 102548963公開了新穎的作為MDM2-P53相互作用抑 制劑的N經取代的吡咯烷類化合物。CN 102627649公開了幾種MDM2的小分子抑制劑以及 其應用。CN 101316823公開了用作抗癌劑的作為P53和MDM2蛋白之間相互作用的抑制劑 的2, 4, δ-三苯基咪唑啉衍生物。在鑒定有效的小分子抑制劑方面，雖然高效的篩選策略取 得了十分有限的成功，但還是十分有限的化合物被認為具有活性。因此，迫切需要篩選新的 可以抑制P53-MDM2相互作用的藥物小分子。
[0008]雖然現有研究已經采用結構-活性模擬篩選模型找到了幾類有限的有潛在應用 價值的小分子抑制劑，但毒副作用大，不穩(wěn)定，尚未進行臨床研究，同時，基于結構-活性模 擬篩選模型篩選出的小分子抑制劑主要是作用于MDM2和P53的結合結構域里，阻止二者結 合，沒有其他的生物活性，對正常細胞和腫瘤細胞無選擇性，單純地抑制這種結合對正常細 胞是致命的。因此從安全性較高的中草藥中篩選新的更安全的P53-MDM2相互作用抑制劑 具有重要的意義。長期的臨床實踐已經證明了靈芝及其成分的安全性，從靈芝中篩選P53-MDM2相互作用抑制劑還未見報道。


【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的是為了提供的一種P53-MDM2相互作用的抑制劑，該抑制劑是從靈 芝中篩選的。
[0010] 本發(fā)明的技術方案 一種P53_MDM2相互作用的抑制劑，為靈芝酸X (以下簡稱以^、靈芝酸恥（以下簡 稱GA-Me)、靈芝酸Y (以下簡稱GA-γ)、靈芝酸τ (以下簡稱GA_T)或靈芝酸1?(以下簡稱 GA-F)； 或GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F之一與藥理學上允許的添加成分組合而成的組合物； 所述的藥理學上允許的添加成分為藥物上可接受的鹽類或酯類； 所述的GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T或GA-F從赤靈芝(G. Lucidum)子實體中提取純化 (Biochemical Engineering Journal, 32 (3): 205,20〇6)而得，其純度大于 99%。
[0011] 所述的一種P53-MDM2相互作用的抑制劑，其可以經脂溶劑(如乙醇)等溶劑用常規(guī) 法調制，因此其在劑型上無特殊限制。
[0012] 所述的一種P53-MDM2相互作用的抑制劑還能與藥理學上允許的添加成分，如稀 釋劑，著色劑，安定劑，界面活性劑，助溶劑，緩沖劑，矯味劑，香料，保存劑或糖衣劑等進行 組合。
[0013] 所述的一種P53-MDM2相互作用的抑制劑，其給藥途徑可以經口給藥，也可非經口 給藥。
[0014] 經口給藥劑型是指片劑，丸劑，顆粒劑，散劑或膠囊。
[0015] 非經口劑型是指靜脈注射劑，肌肉注射劑，皮下注射劑，浴劑，直腸，肛門或陰道給 藥。
[0016] 所述的"相互作用的抑制劑"，是指避免或降低一種或多種分子、肽、蛋白質、酶或 受體的直接或間接結合；或避免或降低一種或多種分子、肽、蛋白質、酶或受體的正?；钚?。
[0017] "P53-MDM2相互作用的抑制劑"是指在藥理分析過程中増加 P53表達的藥劑。此 種增加可由下述的一種或多種下列作用機制所引起，但不限于此：
[1] 、抑制P53與MDM2間的相互作用；
[2] 、與MDM2或P53蛋白質的任一者直接結合；
[3] 、與上游或下游靶，例如激酶，或涉及泛蛋白化修飾的酶活性的相互作用；
[4] 、MDM2與P53在不同細胞區(qū)間的隔離或傳輸；
[5] 、與MDM2結合的蛋白質的調節(jié)，例如(但不限于）p73、p21 ;
[6] 、向下調節(jié)或干擾MDM2表達和/或MDM2活性，例如通過(但不限干）影響其細胞局 部化、后轉譯修飾、核輸出或泛蛋白連接酶活性；
[7] 、P53蛋白質的直接或間接穩(wěn)定化，例如通過保持其為其結構形式或通過避免錯折 疊；
[8] 、促進p53表達或p53家族成員（例如p63及p73)的表達；
[9] 、増加 p53活性，例如通過(但不限干）增強其轉錄活性；
[10] 、增加 p53信號傳輸路徑的基因及蛋白質的表達，例如(但不限于）p21wafl、cipl 及ATF-3。
[0018] "P53"是指因 p53基因的表達所獲得的蛋白質，包含所有被P53基因編碼的蛋白 質、其變異物、其選擇性的切斷蛋白質及其磷酸化蛋白質； "MDM2"是指因 MDM2基因的表達所獲得的蛋白質。在此術語的意義中，MDM2包含所有 被MDM2編碼的蛋白質、其變異物、其選擇性的切斷蛋白質及其磷酸化蛋白質。另外，當用于 發(fā)明時，術語"MDM2"包括MDM2類似物，例如MDMX(也稱為MDM4)及MDM2同系物及其它動 物的類似物，例如人類同系物HDM2或人類類似物HDMX。
[0019] 上述的P53-MDM2相互作用的抑制劑在促腫瘤細胞凋亡中的應用。
[0020] 所述的腫瘤細胞是指醫(yī)學上所屬的各類惡性腫瘤：肺癌，甲狀腺癌，惡性黑色素 瘤，惡性淋巴瘤，腦部腫瘤，消化器官的腫瘤，乳癌，卵巢癌，子宮癌，睪丸癌，前列腺癌，上顎 癌，咽喉癌，舌癌，口腔癌，各類肉瘤，骨肉瘤，白血病，神經系統(tǒng)腫瘤，膀胱腫瘤，皮膚癌，皮 膚附屬器官癌和皮膚轉移癌。
[0021] 上述的一種MDM2-P53相互作用抑制劑，在腫瘤細胞中小劑量使用能抑制MDM2活 性或MDM2-P53相互作用，導致P53的降解過程被抑制，具有對P53介導的腫瘤細胞的選擇 性誘導凋亡作用。所述的小劑量是指每天、每公斤體重低于〇. l-5mg的劑量； 上述的一種MDM2-P53相互作用抑制劑，在腫瘤細胞中大劑量使用直接表現出無選擇 性的細胞毒性?？蓪⑺鼈冏鳛镻53介導的腫瘤治療藥物。所說的大劑量是指每天、每公斤 體重高于5_50mg的劑量。
[0022] 本發(fā)明的一種P53-MDM2相互作用的抑制劑，在野生型p53和缺陷型p53腫瘤細胞 中均有抑制MDM2作用，從而具有促腫瘤細胞凋亡作用，特別是表達P53蛋白的95-D肺癌細 胞或p53缺陷型的H1299肺癌細胞，并且對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞的促凋亡作用更 好。
[0023] 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的一種P53- MDM2相互作用的抑制劑，來源于中國傳統(tǒng)中藥靈芝，能夠通過多種 分子途徑抑制P53- MDM2相互作用，具有顯著地抑制人惡性肺癌腫瘤細胞中MDM2活性，抑 制P53蛋白降解的功能，可以用于抑制泛素化作用介導的蛋白降解，促進含有 p53的腫瘤細 胞凋亡。
[0024] 現有技術中的基于結構-活性模擬篩選模型篩選出的小分子抑制劑主要是作用 于MDM2和P53的結合結構域里，阻止二者結合，沒有其他的生物活性，對正常細胞和腫瘤細 胞無選擇性，單純地抑制這種結合對正常細胞是致命的。而本發(fā)明的一種P53- MDM2相互 作用的抑制劑，其來源于靈芝，由于靈芝酸具有多種作用位點，即可以抑制MDM2表達也可 以刺激P53的表達，而且對正常細胞低毒，對腫瘤細胞表現出更高的活性，因此本發(fā)明的一 種P53- MDM2相互作用的抑制劑可以促進腫瘤細胞的凋亡，特別是對促進表達P53蛋白的 95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞的凋亡效果非常明顯。
[0025]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖 1、濃度分別為 8· 5 μ g/ml、10 μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml 的 GA-T對表達P53 蛋白的 95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞的細胞毒性情況； 圖2、濃度16 μ g/ml、80 μ g/ml的GA-Me分別對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表 達P53蛋白的H1299肺癌細胞處理5min、13min、19min、25min、37min后，對兩種肺癌細胞抑 制作用情況； 圖3、GA-X、GA-Me、GA-Y、GA_T、GA-F對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋 白的H1299肺癌細胞凋亡的影響； 圖4、GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F對表達P53蛋白的％-D肺癌細胞中MDM2的活性 的影響。

【具體實施方式】
[0026] 下面通過實施例并結合附圖對本
【發(fā)明內容】
作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的保 護范圍。
[0027] 本發(fā)明的各實施例中所用的原料、試劑等如無特別說明均為市售。
[0028] 窀施例1 GA-T對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞的毒性作 用 取4份GA-T，純度大于99%，用DMS0(二甲基亞砜，分析純，上海國藥集團化學試劑有限 公司）分別稀釋成濃度為 8. 5μ g/ml、10u g/ml、25y g/ml、50u g/ml。
[0029] 采用噻唑藍（以下簡稱MTT，分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）快速比色法 測定上述四種不同濃度的GA-T對2種表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的 H1299肺癌細胞的毒性作用。
[0030] 分別將對數生長期細胞（106cell. ηιΓ)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0· 2ml，然后分別 加入上述四種不同濃度的GA-T處理，每濃度平行4孔，每孔中的DMS0最終濃度小于〇· 1%， 對照組加等量體積的RPMI1640細胞培養(yǎng)液(賽業(yè)蘇州生物科技有限公司），置于37°C，5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-4天，實驗終止前4h每孔加入10 μ 1濃度為5mg/ml的 MTT水溶液，培養(yǎng)結束后每孔加入150 μ 1濃度為〇· 04N的DMS0,振蕩10 min，待MTT還原 產物完全溶解，用BioRad 550型酶標儀，以550nm為實驗波長測定其吸收度，計算GA-T對 細胞的抑制率，然后以靈芝酸GA-T濃度為橫坐標，細胞的抑制率為縱坐標作圖，確定細胞 的半數抑制濃度（IC50)。實驗結果如圖1所示，從圖1中可以看出GA-T具有抑制表達P53 蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞增殖的作用，但表達Ρδ3蛋白的 95-D肺癌細胞對GA-T更敏感，比不表達Ρ53蛋白的Η1299肺癌細胞的毒性作用要高3. 3 倍。由此表明靈芝酸GA-T可以通過刺激Ρ53誘導增殖抑制。
[0031] 實施例2 不同濃度和時間的GA- Me處理對表達Ρ53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達Ρ53蛋白的 H1299肺癌細胞的抑制作用 GA-Me純度大于99%，用DMS0稀釋成所需濃度。采用噻唑藍（MTT)快速比色法測定 GA-Me對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞的毒性作用。
[0032] 將對數生長期的表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌 細胞（106cel 1. ml-1)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔〇· 2ml，兩種不同的細胞中分別加入終濃度 為16 μ g/ml、80 μ g/mlGA-Me，每個濃度平行4孔，每孔中的DMS0最終濃度小于0· 1%，對照 組加等量體積的RPMI1640細胞培養(yǎng)液(賽業(yè)蘇州生物科技有限公司），置于3rC，5%C02及 飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，實驗終止前4h每孔加入1〇μ1濃度為 5mg/ml的MTT水溶液， 培養(yǎng)結束后每孔加入150μ1濃度為0.04N的DMS0,振蕩10 min，待MTT還原產物完全溶 解，用BioRad 550型酶標儀，以550nm為實驗波長測定其吸收度，計算靈芝酸GA-Me對細胞 的抑制率，并以靈芝酸GA-Me的不同濃度對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋 白的H1299肺癌細胞的抑制率作圖，結果見圖2所示，從圖2中可以看出GA-Me對表達P53 蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞兩種肺癌細胞均具有增殖抑制 作用，但對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞比不表達PM蛋白的Hl 299肺癌細胞的毒性作用 要強，且短時間內就可產生較大的抑制。由此表明GA_Me可以通過刺激 P53誘導增殖抑制。
[0033] 實施例3 GA-X、GA-Me、GA_Y、GA-T、GA-F誘導表達P53蛋白的％-D肺癌細胞和不表達Ρδ3蛋白 的H1299肺癌細胞的凋亡作用 對數生長期表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299肺癌細胞培養(yǎng)4h 后，經DMSO稀釋而成50 μ g/mL的上述GA-X、GA_Me、GA_Y、GA-T、GA_F分別充分作用8h后， 經胰蛋白酶消化，分別離心收集表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白的H1299 肺癌細胞（1500 rpm X lOmin)，PBS (氯化鈉（NaCl)，8g/L;氯化鉀（KCl)，0.2g/L;磷酸 氫二鈉（Na2HP04)，1. 44g/L;磷酸二氫鉀（KH2P04)，0· 24g/L，調 pH 7· 4,高壓蒸汽滅菌，室 溫保存）洗滌兩遍，以PBS調整表達Ρ53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達Ρ53蛋白的Η1299 肺癌細胞濃度分別為106個/mL，分別加入RNase，終濃度為100U/mL，37°C保溫30min，加 入八111^〗丨11￥和？1，終濃度為5(^〖/1^，在常溫下暗反應 3〇1^11，然后200目濾膜過濾，經 流式細胞儀分析凋亡，每次記錄1000 - 1500個細胞，結果見圖3所示，從圖3中可以看出 GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F均可誘導表達P53蛋白的95-D肺癌細胞和不表達P53蛋白 的H1299肺癌細胞的凋亡，且對表達P53蛋白的95-D肺癌細胞凋亡的誘導效果更好。
[0034] 實施例4 GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F抑制95-D肺癌細胞中MDM2的活性的影響 對數生長期95-D肺癌細胞培養(yǎng)4h后,經DMSO稀釋而成0, 50 μ g/mL的上述各種靈芝 酸分別充分作用8h后，經胰蛋白酶消化，離心收集95-D肺癌細胞（1500rpm X lOmin)，使用 細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白樣品，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究 所）測定每個蛋白樣品的蛋白濃度，保證后續(xù)電泳的蛋白上樣量一致。
[0035] 配制15%SDS-PAGE凝膠，在蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 (北京奧博來科技有限責任公司），沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，冷卻到室溫后，把 蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內。電泳時在上層膠時使用80V低電壓恒壓電 泳，下層膠時使用120V高電壓恒壓電泳，時間為90-120min。電泳后切膠，轉膜，選用PVDF 膜，轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60min。轉膜完畢后洗滌去除膜上的轉膜液，加 入封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60min。
[0036] 參考鼠抗人MDM2 -抗的說明書(上海信裕生物科技有限公司），按照適當比例用一 抗稀釋液稀釋，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4?在側擺搖床上緩慢搖動孵育lh?；厥找?抗。加入洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10min，吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10min，共洗滌3次。
[0037] 參考二抗的說明書(上海信裕生物科技有限公司），按照適當比例用二抗稀釋液稀 釋辣根過氧化物酶（HRP)標記的二抗，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4°C在側擺搖床上緩 慢搖動孵育lh，回收二抗。加入洗絳液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10min。吸盡洗滌液 后，再加入洗滌液，洗滌5-10min，共洗滌3次。
[0038] 蛋白檢測采用化學發(fā)光法，通過檢測儀檢測光密度，與陰性對照比，確定抑制率， 結果如圖4所示，從圖4中可以看出，GA-X、GA_Me、GA-Y、GA-T、GA-F抑制了 95-D肺癌細胞 中MDM2的表達，從而抑制了 P53蛋白的降解，進一步誘導95-D肺癌細胞的凋亡。
[0039] 綜上所述，本發(fā)明的一種P53_MDM2相互作用的抑制劑，具有顯著地抑制人惡性肺 癌腫瘤細胞中MDM2的表達，從而具有抑制P53蛋白降解的功能，因此P53-MDM2相互作用的 抑制劑可以促進含有P53的腫瘤細胞凋亡。
[0040] 以上所述僅是本發(fā)明的實施方式的舉例，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術 人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變 型也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種P53-MDM2相互作用的抑制劑，其特征在于所述的P53-MDM2相互作用的抑制劑 為靈芝酸X、靈芝酸Me、靈芝酸Y、靈芝酸T或靈芝酸F ; 或靈芝酸X、靈芝酸Me、靈芝酸Y、靈芝酸T、靈芝酸F中之一與藥理學上允許的添加成 分組合而成的組合物。
2. 如權利要求1所述的P53-MDM2相互作用的抑制劑，其特征在于所述的藥理學上允許 的添加成分為藥物上可接受的鹽類或酯類。 3_如權利要求1或2所述的P53-MDM2相互作用的抑制劑在促腫瘤細胞凋亡中的應用。
4.如權利要求1或2所述的P53-MDM2相互作用的抑制劑在促肺癌腫瘤細胞調亡中的 應用。
5·如權利要求4所述的應用，其中所述的肺癌腫瘤細胞為表達P53蛋白的95-D肺癌細 胞或不表達P53蛋白的HI2"肺癌細胞。
【文檔編號】A61P35/00GK104188976SQ201410420296
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權日:2014年8月25日
【發(fā)明者】唐文, 王雨薔, 孫培龍, 歐陽晶晶 申請人:上海應用技術學院