Semaphorin 4D在預(yù)防及治療骨代謝性疾病中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)藥物領(lǐng)域，公開(kāi)了骨代謝性疾病防治的新靶點(diǎn)——腦信號(hào)蛋白家族成員Semaphorin?4D蛋白或Sema4d基因，以及該靶點(diǎn)相關(guān)的重組蛋白或抗體及干擾RNA等在預(yù)防或治療骨代謝性疾病中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】Semaphor in 4D在預(yù)防及治療骨代謝性疾病中的應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)藥物領(lǐng)域,具體涉及腦信號(hào)蛋白家族成員Semaphorin 4D在制備治療骨代謝性疾病藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003]在健康的骨骼中，骨改建過(guò)程在激素、細(xì)胞因子及細(xì)胞間相互作用所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)精確調(diào)節(jié)下進(jìn)行，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)骨骼表面融解破壞骨骼的破骨細(xì)胞與促進(jìn)骨骼形成的成骨細(xì)胞均衡發(fā)揮作用，維持骨密度、硬度和柔韌性等，如果這種平衡失衡，就會(huì)患上骨代謝性疾病，如發(fā)生骨量增加(硬化癥)，但更常出現(xiàn)的是骨丟失(骨質(zhì)疏松癥)等疾病。
[0004]隨著社會(huì)老齡化加快，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率日益增高，目前中國(guó)60歲以上老年人的發(fā)病率就高達(dá)56%。骨質(zhì)疏松基本病理機(jī)理是骨吸收和骨形成的偶聯(lián)出現(xiàn)缺陷，使骨密度逐漸減少，累及全身骨骼，同時(shí)存在局部骨折或缺損愈合不良影響治療效果。因此，如何改善骨質(zhì)疏松患者的全身及局部狀況顯得尤為重要。
[0005]目前抗骨質(zhì)疏松藥物以抑制骨吸收為主，治療后可伴有骨質(zhì)硬化、脆性增高，骨折好發(fā)等臨床特點(diǎn)，不僅加大了骨缺損的治療難度，而且嚴(yán)重影響老齡化人口的生活質(zhì)量。因此如何增強(qiáng)骨骼自身的成骨修復(fù)能力而不影響破骨活性，讓成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞參與的骨改建循環(huán)正常進(jìn)行，從而再生滿(mǎn)足生理機(jī)械力學(xué)需求的功能化骨成為目前骨質(zhì)疏松研究中的首要問(wèn)題。
[0006]腦信號(hào)蛋白(Semaphorins)最初被確定為神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中控制軸突路徑的分子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)20多種腦信號(hào)蛋白，它們?cè)诓煌飳W(xué)行為中發(fā)揮不同功能，包括心臟發(fā)育、血管生成、癌變及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。特別是最近越來(lái)越多的研究表明腦信號(hào)蛋白參與骨代謝平衡并在骨代謝性疾病中發(fā)揮作用。
[0007]就局部而言，骨重塑過(guò)程是由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互作用直接進(jìn)行調(diào)節(jié)的。因?yàn)樵谕还趋牢稽c(diǎn)不能同時(shí)出現(xiàn)骨形成和骨吸收兩個(gè)過(guò)程；所以，假設(shè)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞存在相同的抑制劑，則可使一個(gè)特異位點(diǎn)同時(shí)存在骨形成和骨吸收。HiroshiTakayanagi的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了這種相互作用的分子機(jī)制，成骨細(xì)胞的骨形成作用同時(shí)阻礙了破骨細(xì)胞的骨吸收。Semaphorin 3A，是成骨細(xì)胞產(chǎn)生的一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，可抑制核因子K B配體的受體(RANKL，也稱(chēng)腫瘤壞死因子配體超家族)化導(dǎo)致的骨髓源單核細(xì)胞中的破骨細(xì)胞生成。他們假設(shè)培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞除了分泌護(hù)骨素(強(qiáng)效的破骨細(xì)胞抑制劑)，還分泌調(diào)節(jié)骨代謝的蛋白。作者對(duì)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞(來(lái)自護(hù)骨素缺陷小鼠)條件性培養(yǎng)基進(jìn)行分懼，鑒定Semaphorin 3A是一個(gè)成骨細(xì)胞衍生蛋白，它能抑制破骨細(xì)胞的形成。重要的是，該蛋白不僅抑制破骨細(xì)胞骨吸收，也增加成骨細(xì)胞骨形成。Semaphorin 3A缺陷小鼠骨質(zhì)減少，靜脈注射Semaphorin 3A預(yù)防卵巢切除引起的骨丟失。Semaphorin3A通過(guò)不同信號(hào)途徑減少骨吸收,增加骨形成。對(duì)骨吸收的抑制作用由semaphorin-3A與神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合作用介導(dǎo)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制與神經(jīng)叢蛋白Al (Plexin-Al)的結(jié)合，并繼而抑制plexin-Al - TREM2 - DAP12復(fù)合物的產(chǎn)生，通過(guò)抑制免疫受體酪氨酸激活基序和RhoA信號(hào)途徑預(yù)防RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。當(dāng)Semaphorin 3A缺乏時(shí)，RANKL信號(hào)使neuropilin-Ι快速下調(diào)、plexin-Al釋放并促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。Semaphorin 3A通過(guò)使單核細(xì)胞處于“待命”狀態(tài)來(lái)抑制破骨細(xì)胞的分化，并以此支持骨形成。反之，Semaphorin 3A對(duì)骨形成的刺激作用由經(jīng)典fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)途徑的促進(jìn)作用介導(dǎo)?？刮罩委煼椒ㄒ种乒俏?，同時(shí)在一定程度上也抑制骨形成。因此,Semaphorin 3A的作用機(jī)制非常罕見(jiàn)，因?yàn)樗鼘⒐侵厮艿膬蓚€(gè)部分分解，對(duì)這種治療優(yōu)勢(shì)加以開(kāi)發(fā)研究，可能會(huì)帶來(lái)一類(lèi)新的雙重作用骨質(zhì)疏松治療藥物。
[0008]同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Semaphorin 6D也是Plexin-Al的配體，能夠與破骨細(xì)胞表面的DAP12-(Trem-1)-(Plexin-1)復(fù)合體結(jié)合，通過(guò)鈣振蕩促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。同時(shí)，Semaphorin 6D與Plexin-Al結(jié)合也會(huì)使胞衆(zhòng)內(nèi)FARP2活化,進(jìn)而產(chǎn)生Rac-GTP,從而使破骨細(xì)胞偽足重排而影響破骨細(xì)胞粘附能力。因此Semaphorin 6D其抗體或通過(guò)基因沉默抑制該蛋白的表達(dá)有可能作為治療骨質(zhì)疏松的革巴點(diǎn)，Semaphorin 6D重組蛋白也可能用于骨硬化病的治療。
[0009]Delorme等人的研究發(fā)現(xiàn)Semaphorin 7A能通過(guò)整合素β I促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移，同時(shí)也能通過(guò)促進(jìn)破骨前提細(xì)胞的融合誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟分化。但體內(nèi)研究表明，Semaphorin 7Α基因多態(tài)性能導(dǎo)致絕經(jīng)期婦女骨密度降低及較高的骨折風(fēng)險(xiǎn)。因此Semaphorin 7Α有可能作為治療骨質(zhì)疏松的祀點(diǎn)。
[0010]綜上可知，已證實(shí)多種腦信號(hào)蛋白在參與骨代謝平衡并在骨代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明首次公開(kāi)了治療骨代謝性疾病的新祀點(diǎn)----Semaphorin 4D蛋白或
5^_炎/基因。該靶點(diǎn)蛋白高表達(dá)于RANKL活化的破骨細(xì)胞中，在不改變破骨細(xì)胞的分化等生物表型基礎(chǔ)上，以膜蛋白及分泌蛋白形式作用于成骨細(xì)胞表面識(shí)別靶點(diǎn)，參與調(diào)控成骨細(xì)胞分化及遷移，進(jìn)而抑制成骨作用，分解骨吸收和骨形成偶聯(lián)過(guò)程，在破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞間的骨代謝平衡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
[0012]本發(fā)明公開(kāi)了腦信號(hào)蛋白家族成員Semaphorin 4D革巴點(diǎn)相關(guān)的重組蛋白、蛋白拮抗劑或抗體及干擾RNA等在維持正常骨代謝平衡、預(yù)防或治療骨代謝性疾病中的應(yīng)用。更具體的，制備的Semaphorin4D重組蛋白可用于以骨增多為主要表征的骨硬化等疾病的預(yù)防或治療，制備的Semaphorin 4D蛋白拮抗劑或抗體及干擾RNA可用于以骨丟失為主要表征的骨質(zhì)疏松等疾病的預(yù)防或治療。
[0013]由于本發(fā)明所述Semaphorin4D重組蛋白在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成骨過(guò)程中能同時(shí)不影響破骨細(xì)胞分化，它將骨重塑的兩個(gè)部分分解，對(duì)這種治療優(yōu)勢(shì)加以開(kāi)發(fā)研究，可能會(huì)帶來(lái)一類(lèi)新的雙重作用骨質(zhì)疏松治療藥物。
[0014]由于本發(fā)明所述Semaphorin 4D拮抗劑或抗體及siRNA在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成骨過(guò)程中并未干擾正常破骨細(xì)胞破骨活動(dòng)，因此本發(fā)明所述Semaphorin 4D拮抗劑或抗體及siRNA除可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防與治療外，還可與其他治療骨質(zhì)疏松促進(jìn)骨生成類(lèi)藥物如阿倫磷酸鹽等協(xié)同給藥，減少藥物用量，預(yù)防因使用阿倫磷酸鹽等引起的骨硬化癥。
[0015]本發(fā)明所述重組蛋白不僅包括其全序列長(zhǎng)度重組蛋白，也包括相關(guān)的抗原結(jié)合片段蛋白或多肽衍生物，同時(shí)本發(fā)明所指可用于骨代謝相關(guān)疾病預(yù)防或治療的Semaphorin4D或多肽包括但不局限于上述所指的Semaphorin 4D。
[0016]本發(fā)明所述蛋白拮抗劑或抗體不僅包括可用于骨代謝相關(guān)疾病預(yù)防或治療的Semaphorin 4D的拮抗劑或抗體,也包括可用于骨代謝相關(guān)疾病預(yù)防或治療的Semaphorin4D在骨代謝相關(guān)疾病下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所涉及蛋白或多肽的拮抗劑或抗體。
[0017]本發(fā)明所述干擾RNA不僅包括可用于骨代謝相關(guān)疾病預(yù)防或治療的Semaphorin4D的干擾RNA，也包括可用于骨代謝相關(guān)疾病預(yù)防或治療的Semaphorin 4D在骨代謝相關(guān)疾病下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所涉及蛋白或多肽的干擾RNA。本發(fā)明所述干擾RNA形式包括siRNA，dsRNA 及 shRNA 等。
[0018]本發(fā)明所述針對(duì)5^_炎/基因的治療手段除上述干擾RNA外，還包括基因上調(diào)或下調(diào)等相關(guān)基因治療方案。
[0019]本發(fā)明同時(shí)提供合成上述重組蛋白的方法，包括重組DNA或重組RNA的體外方法或體內(nèi)方法。其一般過(guò)程為，應(yīng)用基因重組技術(shù)，獲得連接有可以翻譯成目的蛋白(Semaphorin 4D蛋白)的基因片段的重組載體，之后將其轉(zhuǎn)入可以表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞從而表達(dá)特定的重組蛋白分子。當(dāng)前主要應(yīng)用的重組蛋白的表達(dá)載體包括原核細(xì)胞如大腸桿菌、真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞以及CHO細(xì)胞等，重組蛋白的產(chǎn)生尚可利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺或者植物產(chǎn)生。本發(fā)明所述重組蛋白包括但并不局限于上述方法所得重組蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明所述重組蛋白基本劑型為注射劑，包括靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射及腔內(nèi)注射等多種注射途徑；其改進(jìn)劑型包括口服給藥，外用給藥，原位植入，胃腸外給藥，局部給藥，動(dòng)脈內(nèi)注射和用生物可降解的基質(zhì)遞送等。上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３值鞍邹卓箘┗蚩贵w分子的活性。
[0020]本發(fā)明同時(shí)提供合成上述蛋白拮抗劑或抗體的方法，包括合成單克隆抗體或多克隆抗體等。多克隆抗體基本制備方法包括:①制備抗原，依照上述重組蛋白方法合成或直接提取上述Semaphorin 4D蛋白，②進(jìn)行動(dòng)物免疫，選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等采用淋巴結(jié)注射法、皮下多點(diǎn)注射法或多途徑聯(lián)合注射法，③試取血檢測(cè)是否成功免疫，④如果成功免疫則處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采集全部血清，⑤抗體純化及鑒定。單克隆抗體基本制備方法包括:①提取合成上述專(zhuān)一性抗體的單個(gè)B淋巴細(xì)胞，②用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合,得到雜交瘤細(xì)胞，③對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，選出所需要的細(xì)胞群，體外或體內(nèi)培養(yǎng)，從培養(yǎng)液或動(dòng)物腹水中提取單克隆抗體。本發(fā)明所述蛋白拮抗劑或抗體基本劑型為注射劑，包括靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射及腔內(nèi)注射等多種注射途徑；其改進(jìn)劑型包括口服給藥，外用給藥，原位植入，胃腸外給藥，局部給藥，動(dòng)脈內(nèi)注射和用生物可降解的基質(zhì)遞送等。上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３值鞍邹卓箘┗蚩贵w分子的活性。
[0021]本發(fā)明同時(shí)提供干擾RNA的制備及應(yīng)用方法，干擾RNA序列可以是單鏈結(jié)構(gòu)，也可以是雙鏈結(jié)構(gòu)。干擾RNA的制備可采用多種方法，比如:化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長(zhǎng)鏈dsRNA、載體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等。出于應(yīng)用目的，可將siRNA分子、表達(dá)siRNA分子的DNA表達(dá)框、或者包含siRNA分子表達(dá)框的質(zhì)粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。優(yōu)選的，本發(fā)明所述RNA干擾系統(tǒng)基本劑型為注射劑，包括靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射及腔內(nèi)注射等多種注射途徑；其改進(jìn)劑型包括口服給藥，外用給藥，原位植入，胃腸外給藥，局部給藥，動(dòng)脈內(nèi)注射和用生物可降解的基質(zhì)遞送等。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３指蓴_RNA分子的活性。
[0022]本發(fā)明所涉及各種重組蛋白、蛋白拮抗劑或抗體及干擾RNA的有效治療劑量可能根據(jù)各種因素而不同，這些因素包括但不僅限于，所使用化合物的活性、患者體內(nèi)活性化合物的穩(wěn)定性、所要緩解的病癥的嚴(yán)重程度、所治療患者的總體重、給藥的途徑、活性化合物在患者體內(nèi)吸收的容易程度、分布、排泄，所治療患者的年齡和敏感性等等，這些對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。攝入量可因各種因素隨著時(shí)間變化而調(diào)整。
[0023]本發(fā)明所指以骨丟失為主要表征的疾病包括但不限于骨質(zhì)疏松癥，比如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，類(lèi)固醇或糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥，年齡骨質(zhì)疏松癥，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或癌癥誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥，骨質(zhì)軟化，特發(fā)性骨質(zhì)疏松，或者佩吉特病。此外，本發(fā)明亦可用于治療或延遲任何局部性骨質(zhì)流失，比如相關(guān)的牙周炎，骨折，假肢周?chē)侨芙獾陌l(fā)生。
[0024]本發(fā)明所指以骨增加為主要表征的疾病包括但不限于骨硬化癥，還包括其他一些骨組織代謝性疾病，如骨異常增生等。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1,展示了 Seim4d siRNA在轉(zhuǎn)錄(a)和翻譯(b)水平均成功干擾Semaphorin 4D合成。
[0026]圖2，展示了 Sema4d siRNA在干擾沉默基因過(guò)程中不影響破骨前體細(xì)胞的破骨分化能力。
[0027]圖3,展示了破骨細(xì)胞在使用siRNA干擾Semaphorin 4D合成后能抑制骨髓間充質(zhì)細(xì)胞遷移。
[0028]圖4，展示了 Sema4dsiRm在預(yù)防骨質(zhì)疏松過(guò)程中4周后股骨CT三維重建圖。
[0029]圖5，展示了 Sema4dSiRWi在預(yù)防骨質(zhì)疏松過(guò)程中后股骨骨小梁形態(tài)及礦化沉積。
[0030]圖6，展示了 Sema4dsiRm在治療骨質(zhì)疏松過(guò)程中4周后股骨CT三維重建圖。
[0031]圖7,展示了 5fe?a^￡/siRNA在治療骨質(zhì)疏松過(guò)程中后股骨骨小梁形態(tài)及礦化沉積。

【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1針對(duì)SemaAd mRNA根據(jù)Tuschl法篩選合成siRNA。
[0033]實(shí)驗(yàn)步驟
目標(biāo)基因開(kāi)放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開(kāi)始，尋找“AA” 二連序列后的19個(gè)堿基序列。
[0034]分析獲得的序列，選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優(yōu)選。將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人，或者小鼠，大鼠等等)進(jìn)行比較，排除和其他編碼序列/EST同源的序列。
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論
我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA序列如下:
正義鏈:5- GUGCCUGGAUAAGA⑶AAATT-3 (SEQ ID No:1); 反義鏈:5-UUUACUCUUAUCCAGGCACTT-3 (SEQ ID No:2)。
[0036]我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均成功干擾Sema4D合成(圖1)。
[0037]實(shí)施例2研究干擾沉默Serm4d對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響實(shí)驗(yàn)步驟
1.骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞原代分離及培養(yǎng)
取新鮮取材長(zhǎng)骨用含雙抗PBS漂洗后，無(wú)菌條件下沖凈髓腔內(nèi)骨髓，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，漂洗后用含10ng/ml M-CSF, 10%FBS的DMEM重懸后，密度20000個(gè)/孔接種于24孔板中，隔天換液，貼壁細(xì)胞中含有豐富的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞。
[0038]2.破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)
接種第三天轉(zhuǎn)染siRNA,并更換培養(yǎng)基為破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(10ng/ml M-CSF,100ng/ml RANKL, 10%FBS),隔天換液，第八至第十天觀察破骨細(xì)胞形成情況。
[0039]3.破骨細(xì)胞染色
棄培養(yǎng)基，PBS沖洗三遍，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS沖洗后再用雙蒸水沖洗，孵育TRAP染液20分鐘后終止，顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論:
Sema4d siRNA在干擾沉默分皿炎/過(guò)程中不影響破骨前體細(xì)胞的破骨分化能力(圖2)。
[0041]實(shí)施例3研究干擾沉默的破骨細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞遷移分化的影響實(shí)驗(yàn)步驟
1.Transwell上室為骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，下室為轉(zhuǎn)染/不轉(zhuǎn)染siRNA的破骨細(xì)胞，6小時(shí)候固定染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0042]2.骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染/不轉(zhuǎn)染Setm4d siRNA的破骨細(xì)胞共培養(yǎng)，均添加成骨誘導(dǎo)因子，每三天換液。
[0043]3.取7天共培養(yǎng)或條件培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行ALP活性測(cè)定。
[0044]4.取14天共培養(yǎng)或條件培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR分析RUNX2，COLl及BGLAP表達(dá)含量。
[0045]5.取21天共培養(yǎng)或條件培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，并進(jìn)行定量分析其礦化能力。
[0046]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論
1.破骨細(xì)胞在使用siRNA干擾Semaphorin 4D合成后能抑制骨髓間充質(zhì)細(xì)胞遷移(圖3)。
[0047]2.破骨細(xì)胞在使用siRNA干擾Semaphorin 4D合成后能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化。
[0048]實(shí)施例4破骨細(xì)胞5^_炎/基因干擾用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療實(shí)驗(yàn)步驟
a.8周齡昆明小鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)(OVX)或假手術(shù)(Sham)，同期采取預(yù)防骨質(zhì)疏松措施，或4周建立骨質(zhì)疏松模型成功采取治療措施，干預(yù)實(shí)施強(qiáng)度為每周給藥I次，干預(yù)實(shí)施周期為4周。預(yù)防與治療實(shí)驗(yàn)均分組情況如下:①Sham組，②OVX組(不采取任何治療)，③ OVX+(STR-R8)組(載體)，④ OVX+ Scrambled siRNA-(STR-R8)組(無(wú)義 siRNA 對(duì)照)，⑤siRNA-(STR-R8)組(實(shí)驗(yàn)組)。并于干預(yù)開(kāi)始三天后及取材前四天分別皮下注射鈣黃綠素及茜素紅。
[0049]b.于八周實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及實(shí)驗(yàn)干預(yù)開(kāi)始后每周，通過(guò)活體X光分析其長(zhǎng)骨骨干柱密度動(dòng)態(tài)變化。
[0050]c.干預(yù)實(shí)施四周后取材雙側(cè)股骨、第三腰椎(L3)4%PFA固定后行microCT分析股骨遠(yuǎn)末端及椎骨松質(zhì)骨骨量、骨密度及骨微結(jié)構(gòu)變化。
[0051 ] d.取材雙側(cè)脛腓骨，浸潤(rùn)于生理鹽水中，萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)定生物力學(xué)強(qiáng)度變化。
[0052]e.將microCT掃描后股骨一半脫水后硬組織包埋切片，分析骨形成動(dòng)態(tài)指標(biāo)及骨組織形態(tài)學(xué)靜態(tài)參數(shù)。
[0053]f.將microCT掃描后股骨另一半脫鈣后石蠟包埋切片，免疫組化染色及TRAP染色，觀察骨組織形態(tài)學(xué)情況。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
a.Sema4d siRNA-(STR-R8)在預(yù)防干預(yù)及治療干預(yù)中均能增加骨干柱密度。
[0055]b.Sema4d siRNA-(STR-R8)在預(yù)防干預(yù)及治療干預(yù)中均能增加股骨遠(yuǎn)末端及椎骨松質(zhì)骨骨量、骨密度并維持或修復(fù)骨小梁正常結(jié)構(gòu)(圖4，和圖6)。
[0056]c.Sema4d si RNA-(STR-R8)在預(yù)防干預(yù)及治療干預(yù)中均能增加實(shí)驗(yàn)鼠脛腓骨生物機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度。
[0057]d.Sema4d siRNA-(STR-R8)在預(yù)防干預(yù)及治療干預(yù)中均能在不影響破骨骨吸收情況下增加成骨(圖5和圖7)。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)論
Sema4d siRNA-(STR-R8)能成功轉(zhuǎn)染破骨細(xì)胞，并沉默靶基因，在不影響破骨骨吸收的情況下促進(jìn)成骨活動(dòng)，從而達(dá)到預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的目的。
【權(quán)利要求】
1.Semaphorin4D重組蛋白在制備預(yù)防或治療以骨增多為主要表征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.Semaphorin 4D蛋白拮抗劑或抗體在制備預(yù)防或治療以骨丟失為主要表征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
3.Sema4d干擾RNA在制備預(yù)防或治療以骨丟失為主要表征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.Sema4d基因上調(diào)在制備預(yù)防或治療以骨增多為主要表征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.Sema4d基因下調(diào)在制備預(yù)防或治療以骨丟失為主要表征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.Semaphorin 4D蛋白受體及其下游信號(hào)分子重組蛋白、蛋白拮抗劑或抗體及基因干擾RNA在制備預(yù)防或治療骨代謝性疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104127862SQ201410399202
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】張玉峰, 邊專(zhuān), 魏凌飛 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)