一種重組卡介苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組卡介苗，其菌總量在105CFU至106CFU之間，包括過表達85A抗原的重組卡介苗、過表達85B抗原的重組卡介苗和過表達HspX抗原的重組卡介苗。本發(fā)明提供的重組卡介苗多個菌株發(fā)揮協(xié)同作用，使其在結核病的不同發(fā)展階段均有免疫保護作用，并能避免同時過表達多抗原或融合表達等機制或因素對BCG自身的保護效果所帶來的負面影響。CCTCC NO: M 201435820140724CCTCC NO: M 201435620140724CCTCC NO: M 201435920140724CCTCC NO: M 201435720140724CCTCC NO: M 201436020140724
【專利說明】一種重組卡介苗

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體地，涉及一種重組卡介苗。

【背景技術】
[0002]據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，2012年仍約有860萬新發(fā)結核病(tuberculosis, TB)病例，其中包括50萬患病兒童，其余均是成人病例，共有130萬人因TB而死亡。而且，全球約有20多億人潛伏感染結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)。特別是近年來耐多藥結核病(MDR-TB)的流行和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，以及M.tb與HIV共同感染的上升等因素，造成TB仍是當今世界上對人類最具威脅性的傳染性疾病之一?？ń槊?M.bovis Bacillus Calmette_Gu6rin，BCG)是從牛型分枝桿菌制備的減毒活疫苗。目前作為唯一的TB預防疫苗，全球嬰幼兒的接種率每年高達90%以上，并在159個國家和地區(qū)應用。流行病學揭示非常低的全球兒童結核患病人數(shù)，證實其確實能夠較為有效地預防兒童罹患TB。但是，龐大的潛伏感染人群以及巨大的新發(fā)成人TB病例數(shù)，也表明BCG免疫對清除潛伏感染以及預防成人TB的效果很差。因此，研制新型的、更為有效的疫苗取代BCG，用于預防TB，對TB疫情的控制至關重要。
[0003]作為全球TB防控的優(yōu)先領域，研制TB新型的候選疫苗，包括亞單位疫苗、減毒活疫苗、滅活菌苗和重組卡介苗(recombinant BCG, rBCG)等類型。重組卡介苗(rBCG)因其在親代BCG的基礎上，表達外源基因或敲除自身基因，既能繼承親代BCG的免疫優(yōu)勢，又能彌補親代BCG的不足并改善保護性，而且易于納入現(xiàn)有的計劃免疫體系推廣使用。相對于其它類型的候選疫苗，重組卡介苗具有無可比擬的優(yōu)勢，受到廣泛重視。表達外源基因的重組卡介苗，已經(jīng)由構建表達單個抗原，向構建表達多個抗原轉(zhuǎn)變。如在rBCG30(過表達Ag85B)的基礎上，進一步發(fā)展的AERAS-422(同時過表達Ag85B、Ag85A和Rv3407的重組卡介苗)，其抗原Ag85B和Ag85A屬于急性期抗原，是M.tb急性感染后在巨噬細胞內(nèi)增殖表達的抗原，Rv3407屬于潛伏期抗原，參與調(diào)節(jié)M.tb在體內(nèi)進入潛伏感染狀態(tài)的抗原。在不同種類的動物實驗，均顯示AERAS-422具有較親代卡介苗顯著增強的保護性和免疫原性。以這些M.tb多階段性抗原為基礎建立的重組卡介苗免疫的人群，即使暴露M.tb后，其產(chǎn)生的免疫力可以靶向在體內(nèi)的不同生長狀態(tài)的M.tb，從而阻止感染的發(fā)生和發(fā)展，以達到預防疾病的目的。但是，過表達潛伏期抗原的AERAS-422在進行I期臨床試驗后即停止，原因在于其能激活免疫人群體內(nèi)潛伏感染的皰瘆病毒，具有較強的副作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種重組卡介苗，其目的在于通過選擇過表達不同階段抗原的卡介苗，并將上述卡介苗按照一定比例配合獲得“雞尾酒”重組卡介苗，從而提供更好的免疫活性和減輕副作用，由此解決現(xiàn)有的卡介苗免疫應答效果不理想，現(xiàn)有的重組卡介苗副作用較強的技術問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組卡介苗，其特征在于，所述卡介苗其菌總量在15CFU至16CFU之間，包括過表達85A抗原的重組卡介苗、過表達85B抗原的重組卡介苗和過表達HspX抗原的重組卡介苗。
[0006]優(yōu)選地，所述重組型卡介苗，包括細菌總數(shù)20%至33%的卡介苗rBCG::85A,33%至60%的卡介苗rBCG::85B以及15%至33%的卡介苗rBCG::X。
[0007]優(yōu)選地，所述重組型卡介苗，包括細菌總數(shù)20 %至80 %的共表達Ag85A和Ag85B的卡介苗rBCG::85AB，以及20%至80%共表達HspX和Ag85B的rBCG::XB。
[0008]總體而言，通過本發(fā)明所構思的以上技術方案與現(xiàn)有技術相比，能夠取得下列有益效果:
[0009]本發(fā)明提供的混合制成的“雞尾酒”重組卡介苗，對急性M.tb感染小鼠的保護性優(yōu)于BCG，多個菌株能夠協(xié)同發(fā)揮作用，本發(fā)明提供的重組卡介苗是具有很好應用前景的候選疫苗。選擇M.tb感染后不同階段的保護性抗原，利用過表達不同單抗原的重組卡介苗優(yōu)勢，組成多相疫苗，可綜合實現(xiàn)強強聯(lián)合，優(yōu)勢互補，使其在TB的不同發(fā)展階段均有免疫保護作用，并能避免同時過表達多抗原或融合表達等機制或因素對BCG自身保護效果所帶來如前所述的負面影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是實施例7ABX菌株中各菌株在不同比例下特異性的IgG、IgGU IgG2a的抗體滴度及IgG2a/IgGl比值；其中圖1a為ABX菌株中rBCG::85A不同比例免疫小鼠Ag85A特異性的IgG、IgGl、IgG2a的抗體滴度及IgG2a/IgGl比值；圖1b為ABX菌株中rBCG::85B不同比例免疫小鼠Ag85B特異性的IgG、IgGl、IgG2a的抗體滴度及IgG2a/IgGl比值；圖1c為ABX菌株中rBCG::X不同比例免疫小鼠HspX特異性的IgG、IgGU IgG2a的抗體滴度及IgG2a/IgGl 比值；
[0011]圖2是ABX疫苗免疫小鼠誘導產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ水平；
[0012]圖3是ABX疫苗免疫應答效果；其中圖3a是ABX疫苗免疫小鼠誘導產(chǎn)生的PH)特異性多功能CD4+T細胞；圖3b是ABX疫苗免疫小鼠誘導產(chǎn)生的Ag85A特異性多功能CD4+T細胞；圖3c是ABX疫苗免疫小鼠誘導產(chǎn)生Ag85B特異性多功能CD4+T細胞；圖3d是ABX疫苗免疫小鼠誘導產(chǎn)生HspX特異性多功能CD4+T細胞；
[0013]圖4.不同類型的重組卡介苗免疫后抗M.tb急性感染小鼠肺臟的荷菌量。

【具體實施方式】
[0014]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0015]本發(fā)明提供的重組卡介苗，其菌總量在15CFU至16CFU之間，包括過表達Ag85A抗原的重組卡介苗、過表達Ag85B抗原的重組卡介苗和過表達HspX抗原的重組卡介苗。
[0016]優(yōu)選地，所述重組卡介苗包括細菌總數(shù)20%至33%的卡介苗rBCG::85A、33%至60%的卡介苗rBCG::85B以及15%至33%的卡介苗rBCG::X。其中，卡介苗rBCG:: 85A為過表達85A抗原的重組卡介苗，其相對過表達增強至少2倍(RT-qPCR技術鑒定，下同)，卡介苗rBCG::85B為過表達85B抗原的重組卡介苗，其相對過表達增強至少2倍，卡介苗rBCG::X為過表達HspX抗原的重組卡介苗，其相對過表達增強至少2倍。
[0017]rBCG::85A、rBCG::HspX 和 rBCG::85B 的構建方法如下:
[0018](I)以M.tb H37Rv的基因組為模板，采用PCR技術獲得M.tb靶抗原的編碼基因，即Ag85A、Ag85B和HspX的編碼基因。
[0019](2)將獲得的編碼基因克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261中，分別構建成重組表達質(zhì)pMVHspX, pMVAg85A和pMVAg85B。
[0020](3)將上述質(zhì)粒分別電穿孔法轉(zhuǎn)化入BCG中國株，通過卡那霉素抗性和免疫印跡技術鑒定，證實分別表達上述抗原的重組卡介苗構建成功。
[0021]這些重組卡介苗菌株分別命名為:過表達85A抗原的重組卡介苗菌株，其分類命名為牛型分枝桿菌卡介苗BCG rBCG::85A，拉丁文學名為mycobacterium bovis BCG池〇6::854，簡稱卡介苗池06::854，于2014年7月24日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC M 2014356 ;過表達85B抗原的重組卡介苗菌株，其分類命名為:牛型分枝桿菌卡介苗BCG rBCG::85B，拉丁文學名為mycobacterium bovis BCGrBCG::85B，簡稱卡介苗rBCG::85B，于2014年7月24日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC M 2014357 ;過表達HspX抗原的重組卡介苗菌株，其分類命名為:牛型分枝桿菌卡介苗BCG rBCG::X，拉丁文學名為mycobacterium bovis BCGrBCG::X，簡稱卡介苗rBCG::X，于2014年7月24日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC M 2014359。
[0022]具體構建方法參照文獻Enhanced protect1n against tuberculosis byvaccinat1n with recombinant BCG over-expressing HspX protein.Vaccine.2010 ；28 (32):5237-44.1 mmunogenicity and Protective Efficacy of a Novel RecombinantBCG Strain Overexpressing Antigens Ag85A and Ag85B.Clinical and DevelopmentalImmunology, Volume 2012, Article ID 563838.
[0023]優(yōu)選地，所述卡介苗包括細菌總數(shù)20%至80%的共表達Ag85A和Ag85B的卡介苗rBCG::85AB，以及 20%至 80%共表達HspX和 Ag85B 的 rBCG::XB。其中，卡介苗 rBCG::85AB為過表達85A和過表達85B抗原的重組卡介苗，相對過表達增強至少2倍，卡介苗rBCG::XB為過表達85B和過表達X抗原的重組卡介苗，相對過表達增強至少2倍。
[0024]rBCG::85AB 和 rBCG::XB 的構建方法如下:
[0025](I)以結核分枝桿菌的基因組為模板，采用PCR技術獲得M.tb不同靶抗原HspX, Ag85A或Ag85B的編碼基因。
[0026](2)將獲得的目的基因Ag85A和Ag85B克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261中，構建成重組表達質(zhì)粒pMVAg85AB。將獲得的目的基因HspX和Ag85B克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261中，構建成重組表達質(zhì)粒pMVAg85BX。
[0027](3)分別將上述質(zhì)粒pMVAg85AB和pMVAg85BX轉(zhuǎn)移入BCG中國株，通過卡那霉素抗性和免疫印跡技術鑒定，證實分別表達上述抗原的重組卡介苗構建成功。
[0028]這些重組卡介苗菌株命名為:過表達85A抗原和85B抗原的重組卡介苗菌株，其分類命名為牛型分枝桿菌卡介苗BCG rBCG::85AB，拉丁文學名為mycobacterium bovis BCGrBCG::85AB，簡稱卡介苗rBCG::85AB，于2014年7月24日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為I 2014358 ；過表達858抗原和也敁抗原的重組卡介苗菌株，其分類命名為牛型分枝桿菌卡介苗8(? 1-806: 18，拉丁文學名為^18 806池⑶::乂8，簡稱卡介苗！':乂8，于2014年7月24日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為I 2014360。
[0029]我們以1.吐的不同階段特征性表達的抗原為基礎，構建了一系列的重組卡介苗，通過大量的動物試驗研宄，從中篩選到五種重組卡介苗，分別為過表達也1^、八叻5八和八叻58的！'^,1-806::85^和沖⑶::858菌株，以及共同表達八妨5八和八妨58的重組卡介苗1-806:: 85八8，共同表達也敁和仏858和1-806::父8。這些菌株分別免疫05781/6小鼠，6周后進行1.吐攻毒實驗，攻毒后4周和18周，證實這些菌株誘導的抗感染保護效果，均明顯強于親代8“。分析表明:這些重組卡介苗增強的抗感染長期保護性，與疫苗免疫小鼠脾細胞分泌這些抗原特異性的11^-7水平上升密切相關，也在一定程度上反映出親代8(?免疫對預防1.吐潛伏感染以及成人18效果差的原因，可能分別與其免疫原性下降和對潛伏感染階段相關抗原的弱免疫應答有關，這與臨床上了8的發(fā)生和發(fā)展過程相印證。
[0030]因為，1.吐經(jīng)呼吸道原發(fā)感染后，大部分人群體內(nèi)的病原體會被清除，僅導致30% -40%的人群感染。感染者中，90%以上人群在機體免疫系統(tǒng)的參與下，形成肉芽腫并控制感染的進展形成潛伏感染；僅10%以下的感染者因原發(fā)感染導致18。5-10%的潛伏感染人群，在其一生中，如免疫力下降、共同感染、營養(yǎng)不良或年老等因素，體內(nèi)處于休眠的1.1:13會再激活，即原發(fā)后感染的主要形式、并導致成人18--肺結核。
從致病性看，1.吐在感染發(fā)生后，至少會經(jīng)歷活躍增殖、休眠和再次活躍增殖等不同階段。原發(fā)感染階段，體內(nèi)1.吐表達的代表基因如八妨5復合物(如八885八，^858)等。而在體外模擬潛伏感染的厭氧環(huán)境，揭示1.吐在潛伏階段由休眠調(diào)節(jié)基因00成調(diào)控，編碼并上調(diào)表達48個基因，包括也敁等。因此，為了進一步發(fā)揮這些重組卡介苗抗結核感染的協(xié)同效應，將1.讓感染后不同階段的特征性抗原也砂、八呂85八或八妨58，發(fā)展的重組卡介苗池⑶::父、1-806::85^和沖⑶::858菌株，以及共同表達八妨5八和仏858的重組卡介苗沖⑶仙、共同表達!！8砂和八妨58的重組卡介苗按照特定比例進行聯(lián)合。該聯(lián)合疫苗免疫，有可能靶向清除感染后在體內(nèi)處于不同狀態(tài)的1.吐，從而阻止感染的發(fā)生發(fā)展，甚至達到控制潛伏感染和預防成人18的能力。本發(fā)明研宄明確了該聯(lián)合疫苗的比例對免疫效果的影響以及其協(xié)同抗吐感染的效果。
[0031]以下為實施例:
[0032]實施例1
[0033]一種重組卡介苗，命名為八8乂，其菌總量為10?冊，包括細菌總數(shù)25%的卡介苗1-806:::858 以及 15%的卡介苗!'8(?:
[0034]實施例2
[0035]一種重組卡介苗，命名為八8乂，其菌總量為5 X 10?冊，包括細菌總數(shù)20 %的卡介苗1-806:::858 以及 20%的卡介苗!'8(?:
[0036]實施例3
[0037]一種重組卡介苗，命名為八8乂，其菌總量為10?冊，包括細菌總數(shù)33%的卡介苗1-806:::858 以及 33%的卡介苗!'8(?:
[0038]實施例4
[0039]一種重組卡介苗，命名為ABXB，其菌總量為15CFU,包括細菌總數(shù)20%的共表達Ag85A 和 Ag85B 的卡介苗 rBCG::85AB，以及 80%共表達 HspX 和 Ag85B 的 rBCG::XB。
[0040]實施例5
[0041 ] 一種重組卡介苗，命名為ABXB，其菌總量為5 X 15CFU,包括細菌總數(shù)50 %的共表達 Ag85A 和 Ag85B 的卡介苗 rBCG::85AB，以及 50%共表達 HspX 和 Ag85B 的 rBCG::XB。
[0042]實施例6
[0043]一種重組卡介苗，命名為ABXB，其菌總量為16CFU,包括細菌總數(shù)80%的共表達Ag85A 和 Ag85B 的卡介苗 rBCG::85AB，以及 20%共表達 HspX 和 Ag85B 的 rBCG::XB。
[0044]實施例7
[0045]在菌總量16CFU恒定的情況下，分別按照各組成成分各15%，20%，30%和40%的比例，對三種重組卡介苗rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X菌株進行混合，命名為混合菌苗ABXo分別免疫C57BL/6小鼠，以BCG為陽性對照，PBS為陰性對照。免疫12周和32周后，收集血清，ELISA法檢測血清分別針對HspX，Ag85A和Ag85B的抗原特異性的IgG抗體、IgGl抗體和IgG2a的抗體滴度，計算IgG2a/IgGl比值以評價疫苗免疫的有效劑量配比和免疫原性。
[0046]1.動物分組與免疫:SPF級C57BL/6 (H-2b)小鼠，武漢大學動物實驗中心提供，(合格證號:SCXK (鄂)2008-0004，N0.4200592947)，雌性，6-8 周齡，18_20g。實驗分三大組:不同劑量配比的ABX疫苗組、BCG陽性對照組、PBS陰性對照組。每一大組再分為12周、32周兩個時間點，3只。實驗重復兩次。
[0047]ABX組:rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X按照各占15?40%的不同比例混合，皮下注射、免疫I次，劑量為1X106CFU/100yl/只。
[0048]BCG組:皮下注射，免疫I次，劑量為I X 16CFU/100 μ I/只。PBS組:皮下注射，免疫I次，劑量為100 μ I/只。
[0049]2.ELISA檢測血清中抗原特異性抗體水平以及IgG2a/IgGl比值。
[0050](I)收集血清:免疫后12周、32周，分別摘眼球取血，無菌剖殺3只小鼠，室溫放置2h后，4000rpm離心lOmin，收集血清并分裝后凍存于_80°C。
[0051](2)包被:用0.05M的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)稀釋不同蛋白至5 μ g/ml，100 μ I/孔，空白對照孔加100 μ I包被緩沖液，4°C孵育過夜。
[0052](3)封閉:棄去孔內(nèi)液體，0.05 % PBST洗滌4次，每次3min ;之后加入I %BSA-PBST 封閉，150 μ I/ 孔，37°C孵育 2h ;洗滌 4 次。
[0053](4)加樣:各組小鼠血清樣本用無菌IXPBS從1:50倍起始按倍比稀釋，空白對照孔加入包被緩沖液100 μ 1，每個樣本做三個復孔。37°C孵育Ih ;洗滌4次。
[0054](5)加二抗:加入新鮮配置的HRP標記羊抗鼠二抗，抗體稀釋度為:IgG 1:5000，IgGll: 10000，IgG2c 1:10000，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ;洗滌，最后一遍用雙蒸水洗滌。
[0055](6)顯色:臨時配制TMB底物溶液，100 μ I/孔，37°C顯色30min ；
[0056](7)終止反應:每孔加入50 μ I的2Μ硫酸溶液，終止顯色反應。
[0057](8)結果測定:酶標儀，波長450nm處檢測OD值。
[0058](9)結果計算:將每一樣本OD值減去空白對照孔OD值后，每一血清樣本將復孔相加取平均OD值。其中PBS對照組的OD值設為陰性對照(N)，免疫實驗組為樣本(P)，當血清P/N值多2.1可以判斷為陽性?？贵w滴度以出現(xiàn)陽性結果的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。每只小鼠血清結果表示為log2(抗體滴度)。以每只小鼠IgG2a和IgGl出現(xiàn)陽性結果的最高稀釋倍數(shù)計算IgG2a:1gGl。最后計算每一組的平均值和標準誤，結果如圖1所示。
[0059](10)依據(jù)抗結核感染的免疫保護機制主要依靠Thl型應答。評價重組卡介苗ABX有效配比的劑量范圍的標準為:比值大于1，表示為Thl型應答；等于1，表示為Thl/Th2混合型應答；小于1，表示為Th2型應答。
[0060](11)結果和結論:在總量恒定的情況下，rBCG::85A按分別占ABX菌株中15%，20%，30%和40%的比例進行混合。免疫后12周，ABX各種比例混合組產(chǎn)生的Ag85A抗原特異性IgG、IgGl、IgG2a滴度，分別與BCG組相當(p > 0.05);免疫后32周，各組各自產(chǎn)生的Ag85A特異性IgGl (除15%比例混合組外)、IgG2a滴度，均較12周時顯著增加(p〈0.05)，僅20%，30%和40%比例混合組的IgG2a抗體滴度，顯著高于BCG組(p〈0.05)。在整個實驗觀察階段，各組的IgG2a/IgGl比值均大于1，比值隨免疫時間延長也均升高，但rBCG::85A按20%，30%和40%的比例混合組的比值增加更明顯，且高于BCG組。
[0061]因此，各亞組分占總混合菌苗的比例一旦低于20%，如15%的劑量，不能促進抗原特異性的Thl型應答的產(chǎn)生。因此，有效的劑量比例應各占總混合菌苗的20%?40%。
[0062]結果:在總量恒定的情況下，rBCG::85A按分別占ABX菌株中15%，20%，30%和40 %的比例進行混合。免疫后12周，ABX各種比例混合組產(chǎn)生的Ag85A抗原特異性IgG、IgGl、IgG2a滴度，分別與BCG組相當(p > 0.05);免疫后32周，各組各自產(chǎn)生的Ag85A特異性IgGl (除15%比例混合組外)、IgG2a滴度，均較12周時顯著增加(ρ〈0.05)，僅20%,30%和40%比例混合組的IgG2a抗體滴度，顯著高于BCG組(p〈0.05)。在整個實驗觀察階段，各組的IgG2a/IgGl比值均大于1，比值隨免疫時間延長也均升高，但rBCG::85A按20%，30%和40%的比例混合組的比值增加更明顯，且高于BCG組。
[0063]結果:在總量恒定的情況下，rBCG::85B分別占ABX菌株中15 %, 20 %, 30 %
40 %的比例進行混合。免疫后12周，ABX各種比例混合組產(chǎn)生的Ag85B抗原特異性IgG、IgG2a滴度，分別與BCG組相當；僅20%，30%和40%比例混合組的IgGl抗體滴度，顯著高于BCG組(ρ〈0.05) ο免疫后32周，各組各自產(chǎn)生的Ag85B特異性IgG, IgGl、IgG2a滴度，均較12周時顯著增加(p〈0.05)，值得注意的是各比例混合組產(chǎn)生的IgG2a抗體滴度顯著高于BCG組(p〈0.05)。在整個實驗觀察階段，各組的IgG2a/IgGl比值均大于1，比值隨免疫時間延長也均升高，但rBCG:: 85B按20 %，30 %和40 %的比例混合組的比值增加更明顯，且高于BCG組。
[0064]結果:在總量恒定的情況下，rBCG::X按分別占ABX菌株中15 %, 20 %, 30 %40%的比例進行混合。免疫后12周，按20%，30%和40%比例混合組產(chǎn)生的HspX抗原特異性IgG、IgGl滴度，均顯著高于BCG組(p〈0.05);各比例組產(chǎn)生的IgG2a滴度，分別與BCG組相當。免疫后32周，各組各自產(chǎn)生的HspX特異性IgG、IgGl滴度與BCG組相當；其中BCG組及15%的比例混合組均較12周時顯著增加(p〈0.05);值得注意的是20%，30%和40%的比例混合組產(chǎn)生的IgG2a抗體滴度顯著高于BCG組(p〈0.05)，并且比12周時顯著增加(p〈0.05)。在整個實驗觀察階段，各組的IgG2a/IgGl比值均大于1，比值隨免疫時間延長也均升高，但rBCG::X按20%，30%和40%的比例混合組的比值增加更明顯，且高于BCG組。
[0065]實施例8
[0066]1.用實施例3中的ABX混合疫苗并參照實施例7方式進行免疫。
[0067]2.脾細胞的制備:
[0068](I)免疫后12周、32周，分別無菌剖殺3只小鼠，在無菌條件下，從腹腔取出脾臟。
[0069](2)將脾臟放入事前標記、加5ml預冷PBS的三格細菌培養(yǎng)皿的一格中。(可用無菌剪刀在脾上剪些開口后再輕柔研磨，避免損傷脾細胞)。
[0070](3)200目尼龍篩網(wǎng)套在50ml無菌離心管上。用無菌鑷取脾臟放在尼龍篩網(wǎng)上，用Iml注射器活塞在200目尼龍篩網(wǎng)上輕柔研磨小鼠脾臟，用巴氏吸管或5ml移液器轉(zhuǎn)移5ml預冷PBS邊沖洗、邊研磨。
[0071](4)完成后，去掉尼龍篩網(wǎng)套，蓋好50ml無菌離心管的蓋子。2000rpm，4°C離心1min0倒棄上清。
[0072](5)取5ml紅細胞裂解液重懸每只小鼠的脾細胞，室溫孵育l_2min。2000rpm，4°C離心lOmin。迅速棄上清。(室溫孵育時間限定在3min內(nèi)。時間過長對脾細胞活性有影響。
[0073](6)加入5ml預冷PBS，2000rpm，4°C離心lOmin。迅速棄上清。共洗2次。棄上清。
[0074](7)加Iml預冷RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。取2 μ I細胞懸液加入198 μ I培養(yǎng)基混勻后，鏡下準確計數(shù)。做好記錄并標記。
[0075](8)用RPMI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度，并計算每只小鼠脾臟細胞總數(shù)。
[0076]3.特異抗原刺激脾細胞并收集上清
[0077](I)在24孔板中加入100 μ I的5X106/孔的脾細胞。
[0078](2)蛋白刺激:Ag85B，Ag85A，以及 HspX 蛋白，各 10 μ g/ml。
[0079]陽性對照刺激物:TB_Pro(10 μ g/ml)。
[0080]陰性對照刺激物:RPMI 1640培養(yǎng)基。
[0081](3)再加1640完全培養(yǎng)基補齊至體積1ml。放置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中。
[0082](4)培養(yǎng)72h收獲脾細胞上清用于檢測IFN- γ。收集24孔板中脾細胞及分泌液于無菌EP管中，2000rpm，離心lOmin，收集上清，注意標記組號及培養(yǎng)時間，按每次檢測所需量進行分裝，放于_80°C凍存?zhèn)錂z。
[0083]4.ELISA檢測脾細胞培養(yǎng)上清抗原特異性的IFN- γ水平:依照小鼠ELISA檢測試劑盒操作手冊完成實驗流程。結果計算:根據(jù)標準曲線計算樣品濃度，每孔濃度減去同組1640刺激孔本底值，作為最終數(shù)值。計算每一實驗組的均數(shù)和標準差，進行統(tǒng)計分析，如圖2所示。
[0084]5.結果和結論:免疫后12周或32周，無論用PTO或不同的特異抗原如Ag85A、Ag85B和HspX刺激，PBS對照組僅分泌非常低水平的IFN- γ，且均顯著低于BCG組或ABX疫苗組(ρ〈0.05)。在早期，ABX組分泌的各種抗原特異性的IFN- γ，且均顯著高于BCG組(ρ〈0.05)，隨著免疫時間的延長，ABX組和BCG組均比各自12周時顯著增加(ρ〈0.05)，但ABX組仍顯著高于BCG組(ρ〈0.05)。因此，ABX疫苗誘導免疫小鼠，比BCG相比，產(chǎn)生高水平的針對不同抗原如Ag85A、Ag85B和HspX特異性IFN- γ，能夠發(fā)揮協(xié)同抗感染作用。
[0085]實施例9
[0086]1.同實施例8進行免疫并分離脾細胞。
[0087]2.鋪板刺激:
[0088](I)無菌24孔板中，每孔加入脾細胞100 μ I (5 X 106)，鋪板。
[0089](2)每孔加入 2O μ I ant1-CD28mcAb 工作液。
[0090](3)每孔分別加入不同種類的刺激物:分別加入Ag85B，Ag85A,以及HspX抗原蛋白(終濃度為10 μ g/ml) ；PPD刺激作為陽性對照(終濃度為10 μ g/ml)，1640作為陰性對照。同時做空白孔對照、單標管對照。
[0091](4)補加入1640完全培養(yǎng)基至1ml?；靹颉?7°C，C02培養(yǎng)箱孵育16h。蛋白刺激后4h，每孔加入阻斷劑Brefeldin A+Monensin。500g離心5min，棄上清。
[0092]3.表面染色:
[0093](I)每孔分別加入100 μ I表面標記抗體，0.5 μ I CD3+1.25 μ I CD4抗體+98.25 μ I PBS
[0094](2)4°C避光孵育30min。加PBS 2ml，500g離心5min，棄上清。洗2次，棄上清。
[0095]4.固定和穿孔:
[0096](I)每管加入預冷的固定劑100 μ 1，混勻，以便充分固定。室溫放置30min。
[0097](2)每管加Iml穿膜工作液，500g離心5min，棄上清。洗2次。
[0098]5.胞內(nèi)染色:
[0099](I)加入100 μ I細胞因子熒光抗體混合，具體方法為::1.25 μ lIFN-γ+Ι.25 μ ITNF- α +1.25 μ I IL-2+96.25 μ I IX 穿膜液。室溫、避光孵育 30min。
[0100](2)每管加Iml穿膜工作液，500g離心5min，棄上清，洗2次。
[0101]6.流式檢測:加300 μ I PBS重懸細胞，4°C避光保存待檢。在上機前漩渦震蕩。先上空白管，調(diào)節(jié)電壓，依次檢測單標管，調(diào)節(jié)熒光補償。
[0102]7.分析策略:首先分析CD4+T細胞中的IFN- γ +、TNF- α +、IL-2+總細胞數(shù)，其次進一步按單陽、IFN-γ+-TNF-α +、TNF-a +-1L-2+、IFN-y+-1L-2+ 雙陽及IFN- γ +-TNF- a +-1L-2+三陽細胞分析多功能T細胞亞型。
[0103]8.結果計算:根據(jù)不同類型T淋巴細胞在上機檢測的總細胞數(shù)中所占比例以及每只小鼠脾細胞計數(shù)結果，分別計算單只小鼠脾臟中各種細胞因子分泌型T淋巴細胞的絕對數(shù)量，結果如圖3所示。
[0104]免疫后12周，pro刺激后，ABX組總IFN-γ分泌型⑶4+Τ細胞數(shù)顯著高于BCG組(ρ〈0.05)，而總TNF- α或總IL-2分泌型⑶4+Τ細胞數(shù)與BCG組基本持平。值得注意的是，隨免疫時間的延長，ABX組總TNF- α或總IL-2分泌型⑶4+Τ細胞數(shù)，均比免疫后12周有顯著增加(Ρ〈0.05)，且總IFN- γ、總TNF- α或總IL-2分泌型CD4+T細胞數(shù)，均顯著高于BCG組(ρ〈0.05)。因此，ABX疫苗免疫小鼠誘導脾細胞中PB)特異性總IFN-γ、總TNF-α或總IL-2分泌型⑶4+T細胞數(shù)量顯著且持久地增加。
[0105]將脾細胞抗原特異性分泌細胞因子的總CD4+T細胞數(shù)，進一步按單因子陽性、雙因子陽性和三因子陽性等7種情況進一步分類，以篩選最終構成ABX組保護性增強的免疫指標。免疫后12周與32周，經(jīng)PPD刺激，ABX組IFN- γ +、IL-2+及TNF- a +三種單陽⑶4+T細胞及IFN- γ +-TNF- a +雙陽⑶4+T細胞的數(shù)量，均顯著高于BCG組(p〈0.05)。隨免疫時間延長，BCG組僅TNF-a +單陽CD4+T細胞數(shù)量，以及ABX疫苗組包括IL-2+單陽和TNF-a +單陽⑶4+T細胞數(shù)量，均顯著高于各自12周的數(shù)量(p〈0.05)。因此，ABX疫苗免疫小鼠誘導脾細胞中PPD特異性分泌IFN-γ +、IL-2+, TNF- a +三種單陽及IFN-γ +-TNF- a +雙陽⑶4+T細胞的數(shù)量顯著且持久地增加。
[0106]免疫后12周和32周，分別用Ag85A、Ag85B或HspX蛋白刺激，ABX組免疫小鼠誘導脾細胞中特異性總IFN- γ、總TNF- α或總IL-2分泌型⑶4+Τ細胞數(shù)量，與BCG組相比，均顯著增加，除早期總IL-2分泌型⑶4+Τ細胞數(shù)量與BCG組相比相當外(ρ〈0.05)。免疫后32周，無論何種蛋白刺激，ABX組誘導的特異性總IL-2分泌型⑶4+Τ細胞數(shù)量均顯著高于12周(ρ〈0.05);此外，Ag85A、HspX特異性總TNF-α分泌型CD4+T細胞數(shù)量也顯著高于12周(p〈0.05)。因此，ABX疫苗免疫小鼠誘導脾細胞中Ag85A、Ag85B和HspX特異性總IFN-γ、總TNF-a或總IL-2分泌型⑶4+T細胞數(shù)量顯著且持久地增加。免疫后12周，無論用哪種抗原刺激，ABX組的抗原特異性分泌IFN- γ +單陽及IFN- γ +TNF- a +雙陽CD4+T細胞的數(shù)量顯著高于BCG組(p〈0.05)，重要的是，這兩種類型的⑶4+T細胞的數(shù)量，延續(xù)至免疫后32周仍高于BCG組(p〈0.05)。而且，免疫32周后，ABX組產(chǎn)生的不同抗原特異性的IL-2+單陽⑶4+T細胞的數(shù)量，均顯著高于BCG組(p〈0.05)。此外，ABX組產(chǎn)生的Ag85A特異性的三陽與TNF-a +單陽，Ag85B特異性的IFN-γ+-1L-2+雙陽，HspX特異性的TNF-a +單陽⑶4+T細胞的數(shù)量，均顯著高于BCG組(p〈0.05)。因此，ABX疫苗免疫小鼠，相對于卡介苗中國株，誘導脾細胞中Ag85A、Ag85B、HspX特異性分泌IFN- γ +單陽及IFN- γ +-TNF- a +雙陽⑶4+T細胞的數(shù)量顯著且持久地增加。
[0107]實施例10
[0108]用實施例3中制備的ABX疫苗、實施例5中制備的ABXB疫苗，免疫C57BL/6小鼠，以BCG為陽性對照，PBS為陰性對照。免疫后第9周，用M.tb標準毒株經(jīng)尾靜脈感染，4周后，計算肺臟臟器荷菌量以評價疫苗抗感染保護效應，證實疫苗ABX的抗M.tb的短期保護性強于BCG中國株。
[0109]1.實驗動物:SPF級C57BL/6小鼠，武漢大學動物實驗中心提供，(合格證號:SCXK(鄂)200-0013)雌性，6-8 周齡，18_22g。
[0110]2.實驗分組及免疫:隨機分6組，每組10只。
[0111]疫苗組:rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X按照比例混合，命名ABX組。皮下注射、免疫I次，劑量為I X 16CFU/100 μ I/只。
[0112]疫苗組:rBCG::85AB 和 rBCG::XB 混合，命名為 ABXB 組。
[0113]陽性對照組:BCG組。皮下注射、免疫I次，劑量為I X 16CFU/100 μ I/只。
[0114]陰性對照組:皮下注射、免疫I次，劑量為100 μ I PBS/只。
[0115]3.實驗動物感染:免疫后第9周，利用Μ.tb H37Rv標準毒株經(jīng)尾靜脈注射方式感染小鼠，實際感染劑量為1.2 X 16CFU/只。4周后，處死小鼠。
[0116]4.肺臟荷菌量
[0117]將每組10只小鼠處死后，75%酒精浸泡lOmin，消毒皮膚。無菌取出肺臟，放于研缽中，充分研磨，加入無菌PBS-T 2ml沖洗。轉(zhuǎn)移到1ml無菌管中，振蕩器充分混勻后。取100 μ I原液加入到900 μ I PBS-T中，做倍比稀釋。振蕩器充分混勻，取4個稀釋度的菌液各100 μ I涂布7Η11-OADC培養(yǎng)皿(配制時加入放線菌酮，抑制真菌的生長，加入TCH可以選擇性抑制殘留BCG的生長)。同I個稀釋度的菌液分別涂布三孔。剩余原液保存在_80°C冰箱，為以后復查備用。平皿放于37°C培養(yǎng)箱3?4周后進行菌落計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果，分別計算每只小鼠的肺臟的荷菌量(CFU)，以LoglO進行荷菌量分析。計算每一實驗組的均數(shù)和標準誤，進行統(tǒng)計分析。
[0118]PBS陰性對照組肺臟的荷菌量最高。與PBS組相比，ABX、ABXB疫苗組和BCG組的肺臟荷菌量均顯著降低(p<0.001)。值得注意的是，與BCG組相比，ABX組小鼠的肺臟荷菌量顯著降低(P = 0.001)，比BCG組減少0.5851og，說明ABX疫苗能更好的抑制M.tb在免疫小鼠肺臟的增殖。因此，ABX疫苗免疫顯著降低M.tb急性感染小鼠肺臟的荷菌量。而ABXB疫苗組和BCG兩組小鼠肺臟的荷菌量無統(tǒng)計學差異(P > 0.05)，盡管如此，動物種屬差異可能是影響其保護效果的因素，不排除其在大動物或人體試驗的有效效果。
[0119]本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1.一種重組卡介苗，其特征在于，所述卡介苗其菌總量在105CFU至106CFU之間，包括過表達85A抗原的重組卡介苗、過表達85B抗原的重組卡介苗和過表達HspX抗原的重組卡介苗。
2.如權利要求1所述的重組型卡介苗，其特征在于，所述卡介苗包括細菌總數(shù)20%至33%的卡介苗rBCG:: 85A、33 %至60 %的卡介苗rBCG::85B以及15%至33%的卡介苗rBCG::Χ0
3.如權利要求1所述的重組型卡介苗，其特征在于，所述卡介苗包括細菌總數(shù)20%至.80 %的共表達Ag 85A和Ag85B的卡介苗rBCG:: 85AB，以及20 %至80 %共表達HspX和Ag85B的 rBCG::XBo
【文檔編號】A61P31/06GK104474538SQ201410399018
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2014年8月13日
【發(fā)明者】范雄林, 梁錦屏 申請人:華中科技大學