功能化的基于樹(shù)狀大分子的spect-ct雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法，以聚乙二醇化修飾的第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子作為高分子載體材料，通過(guò)共價(jià)接枝將二乙三胺五乙酸連接在樹(shù)狀大分子表面，通過(guò)原位合成的方法包裹金納米顆粒，并將表面剩余氨基進(jìn)行乙?；蛘吡u基化，標(biāo)記99mTc，即得。本發(fā)明具有良好的SPECT/CT成像效果，實(shí)現(xiàn)了小鼠的體內(nèi)不同組織部位SPECT/CT成像，為多功能組織特異性造影劑的開(kāi)發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說(shuō)明】功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于造影劑領(lǐng)域，特別涉及一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]核醫(yī)學(xué)影像利用放射性核素標(biāo)記的化學(xué)物質(zhì)作為顯像劑或放射性藥物引入生物體內(nèi)，進(jìn)而顯示體內(nèi)的生理、生化過(guò)程。通過(guò)核醫(yī)學(xué)SPECT或PET顯像設(shè)備接收放射性核素發(fā)出的射線，可以清晰地觀察到造影劑參與生物體內(nèi)各種生理生化甚至代謝方面的功能信息，獲得定性、定量及定位的臨床疾病診治結(jié)果。核醫(yī)學(xué)放射性核素顯像的最突出的優(yōu)點(diǎn)是其功能顯像，由于其獨(dú)特的功能成像特性，與形態(tài)學(xué)成像方法(X射線攝片、B超、CT、MRI)相比，可以反映臟器或組織的血流變化、受體密度及活性改變、代謝及功能變化，成為臨床診治疾病的最先進(jìn)技術(shù)之一。然而核醫(yī)學(xué)成像存在空間分辨率低，無(wú)法明確定位影像解剖學(xué)位置的缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，PET/CT及SPECT/CT的出現(xiàn)成功地解決了這一問(wèn)題。通過(guò)SPECT/CT檢查，能同時(shí)獲得體內(nèi)SPECT的功能代謝信息和CT的解剖診斷信息的圖像融合與診斷效能倍增(王榮福，李險(xiǎn)峰，王強(qiáng).SPECT/CT的最新應(yīng)用進(jìn)展[J].CT理論與應(yīng)用研究，2012，21 (3): 577-582.)。因此，與單獨(dú)的SPECT或CT相比，SPECT/CT在診斷疾病以及評(píng)價(jià)預(yù)后等方面都更加具有臨床應(yīng)用意義。
[0003]雖然SPECT/CT雙模態(tài)影像設(shè)備已經(jīng)在臨床上有了極大的推廣，但是相應(yīng)的SPECT/CT雙模態(tài)成像造影劑的研制開(kāi)發(fā)還沒(méi)有得到足夠的重視。雖然多種CT或SPECT成像造影劑可以完成各種相應(yīng)的造影成像，但是兩種造影劑的使用，不僅給臨床操作造成了不便，也會(huì)增加造影劑對(duì)患者的毒副作用，同時(shí)還存在造影劑之間難以協(xié)調(diào)，體內(nèi)分別存在差異的現(xiàn)象。因此，一種多功能的造影劑體系，能夠完成SPECT/CT雙模態(tài)成像造影診斷，將會(huì)極大地提高診斷的靈敏度與準(zhǔn)確度，并減輕對(duì)患者造成的痛苦和潛在的毒副作用，在臨床中將具有極大應(yīng)用價(jià)值。
[0004]聚酰胺胺(polyamidoamine, PAMAM)樹(shù)狀大分子是一類高度支化結(jié)構(gòu)的大分子，通過(guò)支化單元結(jié)構(gòu)逐步重復(fù)反應(yīng)而成。PAMAM具有高度單分散性和高度支化的特性，并擁有可控和規(guī)則的結(jié)構(gòu)。其不僅表面擁有眾多的可修飾性氨基，而且內(nèi)部具有獨(dú)特的空腔結(jié)構(gòu)。因?yàn)镻AMAM可以作為多能載體材料，在表面修飾功能化基團(tuán)，而以內(nèi)部空腔包裹藥物或者無(wú)機(jī)納米顆粒，實(shí)現(xiàn)多功能的整合，形成多功能納米探針，滿足臨床應(yīng)用的要求。例如(WenS，Li K，Cai H，et al.Multifunct1nal dendrimer—entrapped gold nanoparticles fordual mode CT/MR imaging applicat1ns[J].B1materials, 2013, 34(5):1570-1580.)利用修飾有釓離子螯合劑的第五代PAMAM樹(shù)狀大分子為模板原位還原制備了金納米顆粒，并螯合釓離子制備得到的CT/MR雙模態(tài)成像造影劑，得到了較好的體內(nèi)外雙模態(tài)成像效果。因此利用樹(shù)狀大分子為載體制備SPECT/CT雙模態(tài)造影劑將可以滿足臨床應(yīng)用的需求，同時(shí)根據(jù)樹(shù)狀大分子表面的可修飾性，進(jìn)行不同表面修飾實(shí)現(xiàn)不同的體內(nèi)組織器官成像也將成為可能。
[0005]檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)SPECT/CT雙模態(tài)造影劑方面的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明:目前，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基于樹(shù)狀大分子的包裹金納米粒子螯合"mTc的SPECT/CT造影劑的制備與應(yīng)用方面的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑及其制備方法，該造影劑具有良好的SPECT/CT成像效果，為多功能造影劑的開(kāi)發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑，以聚乙二醇化修飾的第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子作為高分子載體材料，通過(guò)共價(jià)接枝將二乙三胺五乙酸連接在樹(shù)狀大分子表面，通過(guò)原位合成的方法包裹金納米顆粒，并將表面剩余氨基進(jìn)行乙?；蛘吡u基化，標(biāo)記"mTc，即得。
[0008]本發(fā)明的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，包括:
[0009](I)將G5.NH2 (購(gòu)于Dendritech公司)溶解在水中，并加入二乙三胺五乙酸環(huán)酸酐cDTPAA (購(gòu)于Sigma Aldrich)的水溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)8_12h得到G5-DTPA，再加入EDC(購(gòu)于Sigma Aldrich)活化后的mPEG-COOH(購(gòu)于上海炎怡生物科技有限公司)，攪拌反應(yīng)l-3d，得到功能化樹(shù)狀大分子G5-DTPA-mPEG溶液；
[0010](2)在G5-DTPA1PEG溶液中加入氯金酸溶液攪拌20_40min，再加入硼氫化鈉溶液，攪拌反應(yīng)l_4h ；
[0011](3)乙?；?加入三乙胺攪拌20-40min，隨后加入乙酸酐，攪拌反應(yīng)12_24h ；
[0012]或者羥基化:加入縮水甘油，攪拌反應(yīng)12_24h ;將反應(yīng)液透析，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到Au-Ac DENPs或Au-Gly DENPs ；
[0013](4)將上述Au-Ac DENPs或Au-Gly DENPs溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入SnCl2，然后再加入無(wú)菌放射性高鍀酸鹽溶液并混合，柱層析分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹(shù)狀大分子 99niTc-Au-Ac DENPs 或 99niTc-Au-Gly DENPs。
[0014]所述步驟(I)中G5.NH2和cDTPAA的摩爾比為1:5-10 ；mPEG-COOH和EDC的摩爾比為1:8-15，活化時(shí)間為2-4小時(shí)；G5-DTPA和mPEG-COOH的摩爾比為1:15-25。
[0015]所述步驟(I)中的mPEG-COOH的分子量為5000。
[0016]所述步驟⑴-⑷中反應(yīng)除了可以在純水中進(jìn)行外，還可以在PBS緩沖液，二甲基亞砜，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺等極性溶劑中反應(yīng)。
[0017]所述步驟(2)中G5-DTPA1PEG和氯金酸的摩爾比為1:150-250 ；G5-DTPA-mPEG和硼氫化鈉的摩爾比為1:750-1250。
[0018]所述步驟(3)中G5-DTPA-mPEG和三乙胺的摩爾比為1:400-800 ;G5-DTPA_mPEG和乙酸酐的摩爾比為1:350-750 ;G5-DTPA-mPEG和縮水甘油的摩爾比為1:500-1000。
[0019]所述步驟(3)中的透析的具體工藝為:采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析，透析袋為纖維素透析膜，截留分子量為8000-14000。
[0020]所述步驟⑷中的Au-Ac DENPs和SnCl2的質(zhì)量比為1:0.1-0.5 ;Au_Ac DENPs和放射性高鍀酸鹽的比例為Img:1850-3700mBq ;Au_Gly DENPs和SnCl2的質(zhì)量比為1: 0.1-0.5 ；Au-Gly DENPs和放射性高鍀酸鹽的比例為Img:1850-3700mBq。
[0021]所述步驟(4)中的磷酸鹽緩沖液的pH = 7.2-7.4。
[0022]所述步驟(4)中柱層析分離的具體工藝為:采用PD-10脫鹽色譜柱純化目標(biāo)產(chǎn)物，除去游離99mTc和未反應(yīng)物質(zhì)。
[0023]本發(fā)明中將99mTc螯合劑cDTPAA接枝到末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子表面，cDTPAA采用在快速攪拌下逐滴滴加的方式加入到樹(shù)狀大分子溶液中，以保證樹(shù)狀大分子接枝DTPA的均一性。
[0024]本發(fā)明中使用5-20倍量EDC活化mPEG-COOH的羧基，增強(qiáng)與樹(shù)狀大分子反應(yīng)的活性，活化的mPEG-COOH也采用逐滴滴加的方式加入到樹(shù)狀大分子溶液中，以保證樹(shù)狀大分子接枝PEG的均一性。同時(shí)PEG的加入可以增加該材料的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，并增加后續(xù)包裹納米金的量，達(dá)到更加靈敏的CT造影效果。
[0025]本發(fā)明中氯金酸溶液加入后，攪拌20_40min，使氯金酸分子與樹(shù)狀大分子充分混合，利用AuC14_與樹(shù)狀大分子氨基的親和力使得其進(jìn)入樹(shù)狀大分子內(nèi)部空腔，再以強(qiáng)還原劑NaBH4快速還原，得到樹(shù)狀大分子包裹的金納米顆粒，很好地防止了金納米顆粒的聚集。
[0026]本發(fā)明中分別以乙酰化和羥基化修飾樹(shù)狀大分子表面剩余的氨基，以降低其表面電勢(shì)，提高材料的生物相容性，并賦予其不同的表面基團(tuán)，以實(shí)現(xiàn)其在體內(nèi)不同的組織成像性能。
[0027]使用1H NMR (核磁共振波普)、UV-Vis (紫外可見(jiàn)光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、MTT測(cè)試(細(xì)胞活力分析)，以及體內(nèi)SPECT/CT成像表征本發(fā)明獲得的具有雙模態(tài)造影功能的樹(shù)狀大分子，結(jié)果分別如下:
[0028](I)1H NMR 測(cè)試結(jié)果
[0029]1H NMR測(cè)試結(jié)果表明:本發(fā)明中制備得到的SPECT/CT雙模態(tài)造影劑顆粒Au-AcDENPs和Au-Gly DENPs均在3.5ppm處有PEG的特征吸收峰，參見(jiàn)圖2。同時(shí)G5的特征峰出現(xiàn)在2.1-3.3ppm之間，而且乙?；揎椇笤?.8ppm出現(xiàn)乙?；奶卣魑铡?br> [0030](2) UV-Vis 測(cè)試結(jié)果
[0031]UV-Vis測(cè)試結(jié)果表明:本發(fā)明中制備得到的SPECT/CT雙模態(tài)造影劑顆粒Au-AcDENPs和Au-Gly DENPs的表面等離子體共振(SPR)峰分別位于530和510nm，參見(jiàn)圖3。這表明本發(fā)明中制備得到了金納米顆粒，而且不同的表面修飾有不同的SPR峰位置。
[0032](3) TEM測(cè)試結(jié)果
[0033]--Μ測(cè)試結(jié)果顯示了兩種金納米顆粒的尺寸及尺寸分布，參見(jiàn)圖4。兩種金納米顆粒大小相似，平均直徑分別為3.3nm和3.2nm，且其尺寸分布較窄，具有良好的分散性。
[0034](4) MTT測(cè)試結(jié)果
[0035]用SK-0V-3細(xì)胞來(lái)研究Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs的細(xì)胞相容性。將不同Au濃度(0,2.5, 5,10, 20,40,80 μ M)的 Au-Ac DENPs和 Au-Gly DENPs 與 KB細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，參見(jiàn)圖5。從圖中可以看出，相對(duì)于用PBS處理的對(duì)照SK-0V-3細(xì)胞，Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs復(fù)合物在Au濃度高達(dá)80 μ M時(shí)仍對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有任何的影響，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。
[0036](5) 99mTc-Au-Ac DENPs 小鼠體內(nèi) micro-SPECT/CT 成像
[0037]將200 μ L99niTc-Au-Ac DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au] = 0.08M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，通過(guò)micro-SPECT/CT小動(dòng)物成像儀掃描檢測(cè)得到的SPECT/CT圖片(圖6，圖8)。從圖中可以看出乙?；砻嫣幚淼?9mTc-Au-Ac DENPs材料可以實(shí)現(xiàn)小鼠的肺部特異性成像，其亮度明顯高于肝臟等其他主要器官，并同時(shí)可以看到肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱的信號(hào)增強(qiáng)，而且成像時(shí)間可以持續(xù)至少2小時(shí)，并逐漸代謝信號(hào)減弱(圖6)。證明本方法合成的99mTc-Au-Ac DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態(tài)成像效果。
[0038](6) 99mTc-Au-Gly DENPs 小鼠體內(nèi) micro-CT 成像
[0039]將200 μ L99niTc-Au-Gly DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au] = 0.08M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，通過(guò)micro-SPECT/CT小動(dòng)物成像儀掃描檢測(cè)得到小鼠CT圖片(圖7，圖9)。羥基化表面處理的99mTc-Au-Gly DENPs材料可以在血液中停留較長(zhǎng)的時(shí)間，完成心臟，腎臟，腹主動(dòng)脈等血池造影，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，材料可以代謝進(jìn)入脾臟，膀胱和肝臟(圖7)。證明本方法合成的99mTc-Au-Gly DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態(tài)成像效果。兩種材料的體內(nèi)成像結(jié)果表明所合成的不同表面修飾的造影劑具有顯著不同的體內(nèi)代謝分布行為，可以完成不同的組織器官特異性造影功能。
[0040]本發(fā)明制備的螯合鍀包裹金納米粒子的功能化樹(shù)狀大分子材料，其金納米顆粒尺寸分布較窄，具有良好的分散性。體外具有良好的細(xì)胞相容性，體內(nèi)試驗(yàn)也表明其良好的SPECT/CT雙模態(tài)成像性能。
[0041]以表面具有大量氨基，內(nèi)部具有大量空腔和結(jié)構(gòu)精確可控的聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子為模板和穩(wěn)定劑，制備了功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT/CT雙模態(tài)成像造影劑，本發(fā)明涉及了五個(gè)基本原理:
[0042](I)充分利用聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的表面大量的可修飾化氨基，接枝99mTc螯合劑DTPA和mPEG-COOH，既修飾了 SPECT造影劑99mTc螯合劑DTPA，又提高了該造影劑的血液循環(huán)時(shí)間和生物相容性。
[0043](2)充分利用聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的內(nèi)部空腔包裹穩(wěn)定納米金顆粒。采用強(qiáng)還原劑NaBH4對(duì)金屬離子進(jìn)行快速還原，在樹(shù)狀大分子內(nèi)部產(chǎn)生穩(wěn)定的金納米顆粒。
[0044](3)金納米顆粒對(duì)X-射線有良好的衰減能力。小鼠活體CT成像測(cè)試說(shuō)明樹(shù)狀大分子包裹金納米顆粒的造影劑可以作為一種充滿希望的CT造影劑。
[0045](4) 99mTc對(duì)SPECT成像有很好的造影效果。SPECT測(cè)試結(jié)果表明，該材料有較好的SPECT成像對(duì)比度。說(shuō)明樹(shù)狀大分子-99mTc成像造影劑可以作為一種充滿希望的SPECT造影劑。
[0046](5)利用聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的表面大量的可修飾化氨基進(jìn)行不同表面修飾和官能化，實(shí)現(xiàn)不同的體內(nèi)成像特性，完成不同的體內(nèi)造影功能，以利于臨床特異性組織器官檢查。
[0047]制備SPECT/CT雙模態(tài)造影劑的關(guān)鍵要素就是找到一個(gè)合適的載體平臺(tái)以負(fù)載不同的造影元素，形成多功能造影劑復(fù)合體。PAMAM是一類高度支化結(jié)構(gòu)的大分子，通過(guò)支化單元結(jié)構(gòu)逐步重復(fù)反應(yīng)而成的樹(shù)狀大分子。它具有高度單分散性和高度支化的特性，并擁有可控和規(guī)則的結(jié)構(gòu)。其不僅表面擁有眾多的可修飾性氨基，而且內(nèi)部具有獨(dú)特的空腔結(jié)構(gòu)。因?yàn)镻AMAM可以作為多能載體材料，在表面修飾功能化基團(tuán)，而以內(nèi)部空腔包裹藥物或者無(wú)機(jī)納米顆粒，實(shí)現(xiàn)多功能的整合，形成多功能納米探針，滿足臨床應(yīng)用的要求。利用樹(shù)狀大分子所具備的優(yōu)異的單分散性、表面大量官能團(tuán)的可修飾性、內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)所具有的載藥性和經(jīng)修飾后具備的良好的生物相容性，通過(guò)樹(shù)狀大分子對(duì)無(wú)機(jī)納米顆粒進(jìn)行修飾、組裝及生物功能化，以及各種小分子造影劑的接枝，制備出優(yōu)良的多功能分子影像學(xué)造影劑用于SPECT/CT雙模態(tài)成像，以期望應(yīng)用于疾病的早期診斷。
[0048]本發(fā)明利用樹(shù)狀大分子的特定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，將99mTc螯合劑DTPA接枝在樹(shù)狀大分子表面以螯合"mTc實(shí)現(xiàn)SPECT成像，然后將EDC活化的mPEG-COOH接枝在樹(shù)狀大分子表面以增加其血液循環(huán)時(shí)間，并提高生物相容性，最后在樹(shù)狀大分子內(nèi)部包裹納米金顆粒用于CT成像，并乙?；蛘吡u基化樹(shù)狀大分子表面剩余氨基降低表面正電荷性，以降低其毒性，制備出優(yōu)良的SPECT/CT雙模態(tài)造影劑，實(shí)現(xiàn)不同的成像需求。
[0049]有益.效果
[0050](I)本發(fā)明的SPECT/CT雙模態(tài)成像造影劑具有良好的SPECT/CT成像效果，為多功能造影劑的開(kāi)發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)；
[0051](2)本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化樹(shù)狀大分子的制備，以及SPECT和CT造影劑用于SPECT/CT雙模態(tài)成像，具有很好的使用價(jià)值；
[0052](3)本發(fā)明制備的不同表面基團(tuán)的雙模態(tài)造影劑具有不同的體內(nèi)特性，可以完成不同的組織器官造影，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，并為不同表面修飾實(shí)現(xiàn)不同組織器官造影打下了良好的基礎(chǔ)；
[0053](4)本發(fā)明所采用的制備工藝可用于制備具有靶向性的SPECT和CT造影劑用于SPECT/CT靶向雙模態(tài)成像，具有很好的使用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0054]圖1為本發(fā)明反應(yīng)方程式簡(jiǎn)圖。
[0055]圖2 為本發(fā)明制備的 Au-Ac DENPs (a)和 Au-Gly DENPs (b)的 1H NMR 譜圖。
[0056]圖3為本發(fā)明制備的Au-Ac DENPs (a)和Au-Gly DENPs (b)的紫外吸收光譜圖。
[0057]圖4 為本發(fā)明制備的 Au-Ac DENPs (a, b)和 Au-Gly DENPs (c，d)的 TEM 圖片(a,c)和粒徑分布直方圖(b，d)。
[0058]圖5為本發(fā)明制備的Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs在不同Au濃度處理的SK-0V-3細(xì)胞活力的MTT分析。
[0059]圖6 為 200 μ L 的 99niTc-Au-Ac DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，通過(guò)micro-SPECT/CT掃描檢測(cè)得到的小鼠肺部，肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱(如箭頭所示)的SPECT/CT圖片，從上至下依次為注射后30min(a)，60min(b)，120min(c)。圖7為200 μ L的99mTc-Au-Gly DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，通過(guò)micro-SPECT/CT掃描檢測(cè)得到的小鼠心臟，下腔靜脈，肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱(如箭頭所示)的SPECT/CT圖片，從上至下依次為注射后30min(a)，60min(b)，120min(c)。
[0060]圖8為200 μ L的99niTc-Au-Ac DENPs ([Au] = 0.08Μ)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，通過(guò)micro-CT掃描檢測(cè)得到的小鼠肺部，心臟，肝臟，腎臟和膀胱(如箭頭所示)的CT圖片，依次為注射前(a),注射后 30min(b), 60min(c)，120min(d)。
[0061]圖9 為 200μ L 的 99niTc-Au-Gly DENPs ([Au] = 0.08Μ)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，通過(guò)micro-CT掃描檢測(cè)得到的小鼠心臟，肝臟，腎臟以及膀胱(如箭頭所示)的CT圖片，依次為注射前(a),注射后 30min(b), 60min(c)，120min(d)。

【具體實(shí)施方式】
[0062]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0063]實(shí)施例1
[0064]如圖1 所示，制備 99niTc-Au-Ac DENPs0
[0065](I)將20.0mg第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子(G5.NH2,購(gòu)于Dendritech公司)溶解在15mL水中，并逐滴加入2mL 二乙三胺五乙酸環(huán)酸酐(cDTPAA,購(gòu)于Sigma Aldrich)的水溶液(1.lmg/mL)，在室溫下攪拌反應(yīng)8h得到G5-DTPA ;同時(shí)，在1mL mPEG-COOH的水溶液(7.69mg/mL)中加入5mLl_乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC，購(gòu)于SigmaAldrich)的水溶液(7.69mg/mL)并攪拌2h，然后將EDC活化后的mPEG-COOH(購(gòu)于上海炎怡生物科技有限公司)加入G5-DTPA溶液中，攪拌反應(yīng)l-3d，得到功能化樹(shù)狀大分子(G5-DTPA-mPEG)溶液；
[0066](2)在⑴中得到的G5-DTPA-mPEG溶液中加入2.1mL氯金酸溶液(30mg/mL)攪拌30min,溶液變成淺黃色，再加入2.8mL硼氫化鈉水溶液(10mg/mL)，溶液瞬間變成深紅色，攪拌反應(yīng)l_4h。然后加入78 μ L三乙胺攪拌30min，最后加入42 μ L乙酸酐，攪拌反應(yīng)15h。最后將反應(yīng)產(chǎn)物用纖維素透析膜(MWC0 = 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液2LX3和蒸餾水2LX3中透析3天，最后將純化后的產(chǎn)物冷凍干燥得到Au-Ac DENPs ；
[0067](3)將0.2mg步驟(2)中制備的Au-Ac DENPs溶解在0.25mL磷酸鹽緩沖液中(PBS, pH = 7.2-7.4)，加入0.05mg SnCl2，然后再加入1.5mL無(wú)菌放射性高鍀酸鹽(放射性99mTc濃度為370MBq/mL)溶液并迅速混合反應(yīng)30min，采用TO-1O脫鹽色譜柱純化分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹(shù)狀大分子(99mTc-Au-Ac DENPs)；
[0068]合成過(guò)程中對(duì)樹(shù)狀大分子表面修飾用核磁進(jìn)行表征如圖2a，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知:樹(shù)狀大分子載體表面修飾了 17.6個(gè)mPEG分子。對(duì)得到的產(chǎn)品Au-Ac DENPs進(jìn)行紫外吸收表征如圖3a，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在530nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(圖4a和4b)表明金納米顆粒直徑約3.3nm，尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進(jìn)一步以電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定產(chǎn)物中Au的含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹(shù)狀大分子的載金量為198.0個(gè)金原子。利用快速薄層層析法測(cè)試99mTc-Au-AcDENPs放射性純度高達(dá)95%，并在生理鹽水和血漿中可以穩(wěn)定6h以上。這些測(cè)試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的功能化的樹(shù)狀大分子99mTc-Au-Ac DENPs0
[0069]實(shí)施例2
[0070]如圖1 所示，制備 99niTc-Au-Gly DENPs0
[0071](I)將20.0mg G5.NH2溶解在15mL水中，并逐滴加入2mL cDTPAA的水溶液(1.1mg/mL)，在室溫下攪拌反應(yīng)8h得到G5-DTPA ;同時(shí)，在1mL mPEG-COOH的水溶液(7.69mg/mL)中加入5mL EDC的水溶液(7.69mg/mL)并攪拌2h，然后將EDC活化后的mPEG-COOH加入G5-DTPA溶液中，攪拌反應(yīng)l-3d，得到功能化樹(shù)狀大分子(G5-DTPA-mPEG)溶液；
[0072](2)在⑴中得到的G5-DTPA-mPEG溶液中加入2.1mL氯金酸溶液(30mg/mL)攪拌30min,溶液變成淺黃色，再加入2.8mL硼氫化鈉水溶液(10mg/mL)，溶液瞬間變成深紅色，攪拌反應(yīng)l_4h。然后加入84 μ L縮水甘油攪拌反應(yīng)24h。最后將反應(yīng)產(chǎn)物用纖維素透析膜(MWCO = 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液2LX3和蒸餾水2LX3中透析3天，最后將純化后的產(chǎn)物冷凍干燥得到Au-Gly DENPs ；
[0073](3)將0.2mg步驟⑵中制備的Au-Gly DENPs溶解在0.25mL PBS中，加入
0.05mgSnCl2,然后再加入1.5mL無(wú)菌放射性高鍀酸鹽(放射性99mTc濃度為370MBq/mL)溶液并迅速混合反應(yīng)30min，采用PD-1O脫鹽色譜柱純化分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹(shù)狀大分子(99mTc-Au-Gly DENPs)；
[0074]合成過(guò)程中對(duì)樹(shù)狀大分子表面修飾用核磁進(jìn)行表征如附圖2b，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知:樹(shù)狀大分子載體表面修飾了 17.6個(gè)mPEG分子。對(duì)得到的產(chǎn)品Au-Gly DENPs進(jìn)行紫外吸收表征如圖3b，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在510nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(圖4c和4d)表明金納米顆粒直徑約3.2nm，尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進(jìn)一步以電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定產(chǎn)物中Au的含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹(shù)狀大分子的載金量為198.0個(gè)金原子。利用快速薄層層析法測(cè)試99mTc-Au-GlyDENPs放射性純度高達(dá)95%，并在生理鹽水和血漿中可以穩(wěn)定6h以上。這些測(cè)試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的功能化的樹(shù)狀大分子99mTc-Au-Gly DENPs0
[0075]實(shí)施例3
[0076]用MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)研究所制備的Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs的細(xì)胞毒性。
[0077]收集對(duì)數(shù)期人卵巢癌細(xì)胞株(SK-0V-3細(xì)胞)，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μ L含細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)基使細(xì)胞密度至8000/孔；然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2, 37 0C )中孵育24小時(shí)，倒掉培養(yǎng)基并加入180μ L新鮮培養(yǎng)基，再加入含有不同濃度的Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs的20 μ L PBS緩沖液(金終濃度分別為O，2.5，5，10，20，40，80 μ Μ)，以驗(yàn)證材料對(duì)SK-0V-3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所有的試驗(yàn)組均設(shè)5個(gè)孔為一個(gè)平行組；在培養(yǎng)箱中孵育24h后，每孔加入20 μ L的MTT溶液(5mg/mL)，培養(yǎng)4h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，在每孔加入200 μ L DMS0，置搖床上避光振蕩15min，然后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm處測(cè)量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。分析結(jié)果以細(xì)胞存活率來(lái)顯示Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs對(duì)細(xì)胞的毒性作用。MTT法檢測(cè)處理后細(xì)胞的活力，參見(jiàn)圖5。從圖中可以看出，相對(duì)于未處理的SK-0V-3細(xì)胞，Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs在金濃度高達(dá)80 μ M時(shí)對(duì)細(xì)胞都不產(chǎn)生毒性，表現(xiàn)出良好的生物相容性。
[0078]實(shí)施例4
[0079]將200 μ L 實(shí)施例1 或 3 中得到的 99mTc-Au-Ac DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au]=0.08M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，用藥前5min對(duì)其通過(guò)CT掃描檢測(cè)得到對(duì)照CT圖片(圖8)，并于用藥后30min，60min，120min再分別通過(guò)SPECT/CT掃描得到小鼠膀胱和腎的CT圖片。通過(guò)micro-SPECT/CT小動(dòng)物成像儀掃描檢測(cè)得到的SPECT/CT圖片(圖6，圖8)。從圖中可以看出乙?；砻嫣幚淼?9mTc-Au-Ac DENPs材料可以實(shí)現(xiàn)小鼠的肺部特異性成像，其亮度明顯高于肝臟等其他主要器官，并同時(shí)可以看到肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱的信號(hào)增強(qiáng)，而且成像時(shí)間可以持續(xù)至少2小時(shí)，并逐漸代謝信號(hào)減弱(圖6)。證明本方法合成的99mTc-Au-Ac DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態(tài)成像效果。
[0080] 實(shí)施例5
[0081 ]將 200 μ L 實(shí)施例1 或 3 中得到的 99niTc-Au-Gly DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au]=0.08M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，用藥前5min對(duì)其通過(guò)CT掃描檢測(cè)得到對(duì)照CT圖片(圖9)，并于用藥后30min，60min, 120min再分別通過(guò)SPECT/CT掃描得到小鼠膀胱和腎的CT圖片。通過(guò)micro-SPECT/CT小動(dòng)物成像儀掃描檢測(cè)得到的SPECT/CT圖片(圖7，圖9)。從圖中可以看出羥基化表面處理的99mTc-Au-Gly DENPs材料可以在血液中停留較長(zhǎng)的時(shí)間，完成心臟，腎臟，腹主動(dòng)脈等血池造影，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，材料可以代謝進(jìn)入脾臟，膀胱和肝臟(圖7)。證明本方法合成的99mTc-Au-Gly DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態(tài)成像效果。兩種材料的體內(nèi)成像結(jié)果表明所合成的不同表面修飾的造影劑具有顯著不同的體內(nèi)代謝分布行為，可以完成不同的組織器官特異性造影功能。
【權(quán)利要求】
1.一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑，其特征在于:以聚乙二醇化修飾的第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子作為高分子載體材料，通過(guò)共價(jià)接枝將二乙三胺五乙酸連接在樹(shù)狀大分子表面，通過(guò)原位合成的方法包裹金納米顆粒，并將表面剩余氨基進(jìn)行乙?；蛘吡u基化，標(biāo)記"mTc，即得。
2.一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，包括: (1)將G5.NH2溶解在水中，并加入二乙三胺五乙酸環(huán)酸酐cDTPAA的水溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)8-12h得到G5-DTPA，再加入EDC活化后的mPEG_COOH，攪拌反應(yīng)l_3d，得到功能化樹(shù)狀大分子G5-DTPA-mPEG溶液； (2)在G5-DTPA-mPEG溶液中加入氯金酸溶液攪拌20_40min，再加入硼氫化鈉溶液，攪拌反應(yīng)l_4h ； (3)加入三乙胺攪拌20-40min，隨后加入乙酸酐，攪拌反應(yīng)12_24h或者加入縮水甘油，攪拌反應(yīng)12_24h ;將反應(yīng)液透析，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到Au-Ac DENPs或Au-Gly DENPs ； (4)將上述Au-AcDENPs或Au-Gly DENPs溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入SnCl2，然后再加入無(wú)菌放射性高鍀酸鹽溶液并混合，柱層析分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹(shù)狀大分子 99niTc-Au-Ac DENPs 或 99niTc-Au-Gly DENPs。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中65.見(jiàn)12和cDTPAA的摩爾比為1:5-10 ；mPEG-COOH和EDC的摩爾比為1:8-15，活化時(shí)間為2-4小時(shí)；G5_DTPA和mPEG-COOH的摩爾比為 1:15-25。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的mPEG-COOH的分子量為5000。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中G5-DTPA-mPEG和氯金酸的摩爾比為1:150-250 ；G5-DTPA-mPEG 和硼氫化鈉的摩爾比為 1:750-1250。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中G5-DTPA-mPEG和三乙胺的摩爾比為1:400-800 ;G5-DTPA-mPEG和乙酸酐的摩爾比為1:350-750 ;G5-DTPA_mPEG和縮水甘油的摩爾比為 1:500-1000。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的透析的具體工藝為:采用透析袋先在PH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析，透析袋為纖維素透析膜，截留分子量為8000-14000。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟⑷中的Au-Ac DENPs和SnCl2的質(zhì)量比% 1:0.1-0.5 -M-Kc DENPs 和放射性高鍀酸鹽的比例為 Img: 1850_3700mBq ；Au-GlyDENPs和SnCl2的質(zhì)量比為1:0.1-0.5 ;Au_Gly DENPs和放射性高鍀酸鹽的比例為Img:1850_3700mBqo
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中的磷酸鹽緩沖液的pH = 7.2-7.4。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種功能化的基于樹(shù)狀大分子的SPECT-CT雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中柱層析分離的具體工藝為:采用ro-1o脫鹽色譜柱純化目標(biāo)產(chǎn)物，除去游離99mTc和未反應(yīng)物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61K51/06GK104162175SQ201410271238
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】史向陽(yáng), 溫詩(shī)輝, 趙晉華, 趙凌舟 申請(qǐng)人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院