專利名稱：Pigr生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)和相關(guān)配體的細(xì)胞內(nèi)化作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及將配體特異性結(jié)合到聚免疫球蛋白受體的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)區(qū)并內(nèi)化進(jìn)入到細(xì)胞中或者經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
在醫(yī)藥和生物制藥工業(yè)中最富有挑戰(zhàn)性的問題之一是將藥物在體內(nèi)運(yùn)送通過各種各樣的半透膜。特別是在大分子的情況下，使花費(fèi)有效或使治療方便的障礙經(jīng)常是由于缺乏合適的藥物運(yùn)送系統(tǒng)。而該問題指明藥物的生產(chǎn)是否是經(jīng)濟(jì)易行的。因此對于替代的運(yùn)送系統(tǒng)的研究經(jīng)常與新藥本身的研究相匹敵。
基因轉(zhuǎn)移方法可以視為是大分子藥物運(yùn)送的一個范例。這些方法可以分成三種類型物理方法(例如電穿孔、直接的基因轉(zhuǎn)移和粒子轟擊)，化學(xué)方法(例如類蛋白質(zhì)、微乳狀液和脂質(zhì)體)，和生物學(xué)方法(例如病毒產(chǎn)生的載體和受體介導(dǎo)的吸收)。生物轉(zhuǎn)移方法中，受體介導(dǎo)的吸收是特別有希望的。將配體定向于胞吞受體可作為將配體運(yùn)送到細(xì)胞中的一種方法。但是，受體介導(dǎo)的系統(tǒng)的一個缺點(diǎn)是其一般依賴于靜脈內(nèi)給藥，這嚴(yán)重限制了它的應(yīng)用。粘膜上皮細(xì)胞系是易進(jìn)入組織的細(xì)胞，例如在上呼吸道和胃腸道中發(fā)現(xiàn)的那些。這些細(xì)胞的易進(jìn)入性使其成為藥物運(yùn)送的令人注意的焦點(diǎn)。參見，例如Ferkol等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)92:2394-2400(1993)；Ferkol等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)95:493-502(1995)。已經(jīng)報道過抗體的從上皮細(xì)胞腔到基底外側(cè)表面的逆行運(yùn)輸，盡管是在非常低的水平。Breitfeld等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biology)109:475-486(1989)。在該項研究中，穿過細(xì)胞的運(yùn)動之后是將抗體結(jié)合到聚免疫球蛋白受體(pIgR)的分泌成分上。相對于基底外側(cè)至頂端運(yùn)輸?shù)乃?，Breitfeld等報道少于5％的運(yùn)輸在自然界是逆行的。正常水平逆運(yùn)輸減小了分泌成分作為將生物活性成分運(yùn)送到細(xì)胞中的方法的實(shí)用性。此外，由于腔中富含裂解的pIgR，配體與裂解的pIgR結(jié)合而不是與細(xì)胞表面完整的pIgR結(jié)合，這將減小pIgR逆運(yùn)輸作為藥物運(yùn)送機(jī)理的實(shí)用性。
因此，本領(lǐng)域所需要的是以高效率將配體運(yùn)送到細(xì)胞表面中或者運(yùn)送過細(xì)胞表面的方法。更具體地說，本領(lǐng)域所需要的是將大分子運(yùn)送到、進(jìn)入或通過胃腸道或呼吸道細(xì)胞系的方法。本發(fā)明提供這些和其它的利益。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及與細(xì)胞特異性結(jié)合的聚免疫球蛋白受體(pIgR)的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的配體，前提是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。一般情況下，該抗體只受特異性結(jié)合生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)。在一個實(shí)施方案中，該配體是一種抗體，優(yōu)選人源化的抗體。在另一個實(shí)施方案中，該配體是抗體的重組單鏈可變區(qū)片段。在又一個實(shí)施方案中，該配體與受體裂解位點(diǎn)鄰近的細(xì)胞膜的頭33個氨基酸中的胞外表位結(jié)合。
該配體可以包含結(jié)合生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的結(jié)合成分和生物活性成分，例如核酸、蛋白質(zhì)、放射性同位素、脂質(zhì)和碳水化合物。生物活性成分包括消炎藥、抗感染劑、反義寡核苷酸、抗生素和抗感染劑。在一個實(shí)施方案中，生物活性成分是編碼野生型囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白的核酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是上皮細(xì)胞，最優(yōu)選是哺乳動物的上皮細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及通過將配體與細(xì)胞的聚免疫球蛋白受體的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而將配體導(dǎo)入表達(dá)聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞中的方法，前提是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。在一個實(shí)施方案中，該配體與細(xì)胞頂端表面處的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合，在另一個實(shí)施方案中，配體被胞轉(zhuǎn)到細(xì)胞的基底外側(cè)表面，并且在基底外側(cè)表面處從生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)釋放。
另一方面，本發(fā)明涉及將配體與表達(dá)聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞結(jié)合的方法，包括配體結(jié)合受體的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的步驟，前提是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。在一個實(shí)施方案中，該配體在結(jié)合后被導(dǎo)入細(xì)胞。通過參考本發(fā)明各方面，可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的各種實(shí)施方案。
在各種體內(nèi)和體外應(yīng)用中，本發(fā)明可以用來將治療組合物或診斷組合物運(yùn)輸?shù)?、進(jìn)入或通過粘膜上皮細(xì)胞。因此本發(fā)明提供了將核酸或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入上皮細(xì)胞中的高效方便的方法。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及與細(xì)胞的聚免疫球蛋白受體(pIgR)特異性結(jié)合的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的配體，前提是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。本發(fā)明特別提供將配體結(jié)合和導(dǎo)入到表達(dá)pIgR的細(xì)胞中的方法。
運(yùn)輸?shù)缴掀ぜ?xì)胞頂端表面后，大部分pIgR裂解并釋放分泌成分。令人驚奇地和出人意料地發(fā)現(xiàn)，腔中完整pIgR的裂解留下剩余的完整pIgR胞外域(即“生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)”)；此外，生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)仍然是容易結(jié)合的，盡管蛋白水解酶一般富含于腔周圍。對與pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合的配體的結(jié)合、胞吞和胞轉(zhuǎn)的能力部分提供了這里所公開的和權(quán)利要求書所要求的本發(fā)明。
本發(fā)明具有的實(shí)用性是它可作為將治療組合物或診斷組合物運(yùn)輸給、進(jìn)入(胞吞作用)或經(jīng)過(胞轉(zhuǎn)作用)表達(dá)pIgR的細(xì)胞的方法。因此本發(fā)明可以用來運(yùn)輸生物活性成分，例如蛋白質(zhì)、核酸、或特異于pIgR表達(dá)細(xì)胞的可檢測標(biāo)記。本發(fā)明也提供從病理研究中的混合的細(xì)胞種群中標(biāo)記和區(qū)分上皮細(xì)胞的方法。此外，因?yàn)橄鄬τ谡Ｉ掀碚f，癌上皮中的pIgR表達(dá)減少，所以pIgR的標(biāo)記具有作為內(nèi)窺鏡方法或放射方法中的診斷輻助物的實(shí)用性。另外，治療配體與pIgR的結(jié)合在延長其在各種途徑的腔中的時間和提高其效力方面具有實(shí)用性。
定義在這里除非另有說明，這里所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所共同理解的含義相同的。Singleton等(1994)，微生物和分子生物學(xué)詞典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology)，第二版，John Wiley和Sons(紐約)，和Hale和Marham(1991),The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY，提供給技術(shù)人員本發(fā)明所使用的很多術(shù)語的通用詞典。氨基酸在這里可以通過IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會所建議的公知的三字母符號或一字母符號表示。類似地，核苷酸可以通過其普遍接受的單字母碼表示。為本發(fā)明目的，下文定義下面的術(shù)語。
“配體”或“配體結(jié)合部分”是指能特異性與聚免疫球蛋白受體(pIgR)結(jié)合的所有分子。配體包括但不限于抗體、蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、和碳水化合物。
“生物活性成分”是指體內(nèi)直接引起或抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、受體結(jié)合、主動或被動轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡、細(xì)胞粘連、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞形態(tài)、代謝、酶活性、細(xì)胞程序性死亡、蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)運(yùn)動(例如分泌)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或磷酸化作用等增加或減少的化合物。生物活性成分也包括使上述事件容易進(jìn)行的診斷組合物。
“結(jié)合特異性”或“特異性結(jié)合”或“被結(jié)合”或“結(jié)合”是指配體全部或部分地與帶有特定靶分子或標(biāo)記物的細(xì)胞或組織優(yōu)先結(jié)合，而不與沒有這種靶分子的細(xì)胞或組織結(jié)合。當(dāng)然可理解在分子和非靶物細(xì)胞或組織之間可能發(fā)生一定程度的非特異性相互作用。不管怎樣，根據(jù)通過靶分子特異性識別介導(dǎo)可以區(qū)別特異性結(jié)合。一般情況下，特異性結(jié)合在被運(yùn)輸?shù)姆肿优c帶有靶分子的細(xì)胞之間的結(jié)合比在結(jié)合的分子與沒有該靶分子的細(xì)胞之間的結(jié)合強(qiáng)得多。與沒有耙分子或標(biāo)記物的細(xì)胞或組織相比，特異性結(jié)合產(chǎn)生的與帶有靶分子的細(xì)胞或組織結(jié)合的配體的量的增加(每單位時間)一般大于2倍，優(yōu)選大于5倍，更優(yōu)選大于10倍，最優(yōu)選大于100倍。
“生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)”是指相應(yīng)于構(gòu)成分泌成分的pIgR片段裂解之后與細(xì)胞結(jié)合的pIgR區(qū)的聚免疫球蛋白受體(pIgR)的胞外成分。不管相應(yīng)于分泌成分的pIgR片段是否從pIgR裂解，生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)都存在。
“pIgR”或“聚免疫球蛋白受體”是指在粘膜上皮細(xì)胞中表達(dá)的受體，粘膜上皮細(xì)胞包括呼吸道上皮細(xì)胞、粘膜下腺細(xì)胞、腸細(xì)胞、鼻上皮、肺、口腔粘膜、尿道和生殖道上皮和締結(jié)組織并且參與了在二聚體免疫球蛋白A(dlgA)和/或五聚體IgM的基底外側(cè)至頂端的胞轉(zhuǎn)作用。
“基本上不結(jié)合”是指不多于15％的特異性結(jié)合靶分子的配體結(jié)合特定的非靶分子。更優(yōu)選地，不多于10％結(jié)合非靶分子，更進(jìn)一步優(yōu)選地，不多于5％，最優(yōu)選不多于1％。
“分泌成分”是指一般在基底外側(cè)至頂端胞轉(zhuǎn)之后裂解的pIgR的胞外部分。一般情況下，分泌成分包括pIgR的二聚體IgA(dIgA)結(jié)合部分。分泌成分一般釋放到腔中，其上不一定有dIgA與之結(jié)合。
“生理條件”是指具有使感興趣的細(xì)胞獲得營養(yǎng)或生長的條件(例如溫度、pH和滲透性)的胞外環(huán)境。
“抗體”是指通過體外或體內(nèi)產(chǎn)生體液應(yīng)答而獲得的免疫球蛋白分子，并且包括單克隆抗體和多克隆抗體。該術(shù)語也包括遺傳工程形式，例如嵌合抗體(例如人源化小鼠抗體)，異源接合抗體(例如雙特異性抗體)，和重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語“抗體”也包括抗體的抗原結(jié)合形式(例如Fab,F(ab)2)。
“人源化抗體”是指包括非人氨基酸序列但是其恒定區(qū)已經(jīng)被改變以減少人體的免疫原性的抗體。
“野生型囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白”是指囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的一種功能形式。Riordan等，科學(xué)，245:1066-1073(1989)。
“頂端表面”是指完整的pIgR在胞吞之后從基底外側(cè)表面胞轉(zhuǎn)到該細(xì)胞的細(xì)胞的表面。一般情況下，該細(xì)胞的頂端表面與腔相連并且其中完整的pIgR被裂解后，釋放出分泌成分。
“基底外側(cè)表面”是指一個細(xì)胞表面，完整pIgR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成之后從該細(xì)胞運(yùn)輸?shù)礁郀柣鶑?fù)合物并且通過該復(fù)合物。
“生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)表面”是指該生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的胞外區(qū)。
“釋放”是指配體全部或部分與其靶分子特異性結(jié)合中的干擾。
“胞轉(zhuǎn)”或“胞轉(zhuǎn)作用”是指通過胞內(nèi)途徑從細(xì)胞的一個質(zhì)膜到另一個的運(yùn)輸。一般情況下，胞轉(zhuǎn)作用發(fā)生在從基底外側(cè)至頂端或者從頂端至細(xì)胞的基底外側(cè)細(xì)胞質(zhì)膜。
“細(xì)胞膜近側(cè)”是指緊鄰或鄰近細(xì)胞膜。
“胞外”是指從圍繞細(xì)胞的脂質(zhì)雙層向外延展的區(qū)域。
pIgR的鑒定在多種分類學(xué)多樣性物種中已經(jīng)鑒定了聚免疫球蛋白受體的核酸和氨基酸序列。參見，Piskurich等，免疫學(xué)雜志(Joumal of Immunology)154:1735-1747(1995)。從其它物種中鑒定pIgR可以通過任何本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。例如，使用公開的pIgR序列，可以構(gòu)建對于pIgR的核酸探針。該探針一般應(yīng)該從pIgR的保守區(qū)產(chǎn)生。該探針與基因組或cDNA庫的雜交可以用來鑒定未知物種中的pIgR。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解pIgR探針的核酸序列一般應(yīng)該是與該被探測的物質(zhì)的最相關(guān)的物種。關(guān)于核酸雜交的詳細(xì)指南見Tijssen(1993)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)技術(shù)--與核酸探針的雜交，第一部分，第二章，“雜交原理和核酸探針分析策略綜述”(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes。PartI,Chapter2“Overview of principles of hybridization andstrategy of nucleic acid probe assays”),Elsevier，紐約。
在另一項研究中，pIgR或者其肽片段(例如分泌成分)可以用來產(chǎn)生篩選表達(dá)文庫的抗體。參見，例如，F(xiàn)erkol等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest),95:493-502(1995)。在下面的文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的這些方法和其它方法Berger和Kimmel，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法(Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology),152卷，學(xué)術(shù)出版社，Inc.,SanDiego,CA(Berger)；Sambrook等(1989)，分子克隆-實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第二版)，1-3卷；和分子生物學(xué)常用方法(Current Protocols in Molecular Biology),F.M.Ausubel等編著，Current Protocols,a joint venture between Greene Pubilishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(1994補(bǔ)充本)(Ausubel)。通過這些研究，根據(jù)構(gòu)建推定的pIgR蛋白質(zhì)的抗體，并且證明這些抗體結(jié)合具有pIgR特征(例如存在于上皮細(xì)胞表面，結(jié)合二聚體IgA或五聚體IgM等)的蛋白質(zhì)的能力，來證明核酸或蛋白質(zhì)編碼pIgR的性質(zhì)。
鑒定生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種的技術(shù)鑒定。已經(jīng)鑒定了推定的識別pIgR裂解位點(diǎn)從而確定生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)氨基末端的七肽共有序列。鑒定其中Xaa是極性或帶電荷氨基酸的序列Phe-Ala-Xaa-Glu(SEQ ID NO:1)正是該推定的裂解位點(diǎn)。Piskurich等，免疫學(xué)雜志154:1735-1747(1995)。在該共有序列位點(diǎn)處的裂解釋出分泌成分并且確定其羧基端。分泌成分的羧基端可以通過第二次裂解(例如外肽酶或內(nèi)肽酶活性)而改變，如上得到第二羧基端。但是，最初確定生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)氨基端和分泌成分的羧基端的酰胺鍵可以通過序列對比和鑒定裂解共有序列來鑒定。
用于序列對比的對比方法是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選的用于對比的序列對比通過下面的方法進(jìn)行Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性規(guī)則；Needleman和Wunsch(1970)，分子生物學(xué)雜志48:443的同源性對比規(guī)則；Pearson和Lipman(1988)，美國國家科學(xué)院院刊85:2444的相似性尋找方法研究；這些規(guī)則的計算機(jī)執(zhí)行程序(包括但不限于CLUSTAL in the PC/Gene程序，Intelligenetics,Mountain View,California,GAP,BESTFIT,FASTA，和TFASTA,Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr。,Madison,Wisconsin,USA)；CLUSTAL程序由Higgins和Sharp(1988),基因，73:237-244和Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153；Corpet等(1988)，核酸研究16,10881-90；Huang等(1992)計算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用8,155-65，和Pearson等(1994)分子生物學(xué)方法24,307-31充分地說明。序列對比還經(jīng)常通過檢查和人工比較來進(jìn)行。
在另一項研究中，分泌成分可以從頂端腔里的流體中分離(例如奶液或膽汁)，并且通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的氨基酸測序方法測序，例如通過Edman降解，或者質(zhì)譜。Eiffert等，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.365:1489-1495(1984)。在通過第二次裂解確定各種第二羧基末端時，可以鑒定與裂解位點(diǎn)相鄰的羧基端氨基酸。
相應(yīng)于所選物種pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的肽包括小鼠Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser Ser-Ser-Lys (SEQ IDNO:2)大鼠Glu-Arg-Glu-Ile- Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu Asn-ArgAla-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:3)人Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ IDNO:4)牛Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:5)兔Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID NO:6)
表達(dá)pIgR的細(xì)胞本發(fā)明廣泛涉及真核生物細(xì)胞。本發(fā)明pIgR表達(dá)細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選正常分泌IgA的哺乳動物上皮細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞也可以用從一種或幾種期望的物種分離的，合成的或產(chǎn)生的編碼pIgR的核酸轉(zhuǎn)染。哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和表達(dá)基因的方法是本領(lǐng)域公知的。用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞包括，例如，在引起感染所必須的條件和濃度下，將病毒與病毒宿主范圍內(nèi)的細(xì)胞孵育。參見，例如，酶學(xué)方法，vol.185，科學(xué)出版社，Inc.,San Diego,CA(D.V.Goeddel，編著)(1990)或M.Krieger，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)--實(shí)驗(yàn)手冊，StocktonPress，紐約，NY,(1990)，以及其中所引的文獻(xiàn)。
在本發(fā)明中使用的細(xì)胞包括細(xì)胞系和來自組織或血液樣品的培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)是本領(lǐng)域公知的。Freshney(動物細(xì)胞培養(yǎng)，基礎(chǔ)技術(shù)手冊，第三版，Wiley-Liss，紐約(1994))及其中的文獻(xiàn)提供了細(xì)胞培養(yǎng)的一般性指南。編碼來自期望物種的pIgR的核酸序列可以在多種真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，包括酵母和多種高級真核細(xì)胞，例如COS、CHO和Hela細(xì)胞系和骨髓瘤細(xì)胞系以及MDCK和人結(jié)腸癌產(chǎn)生的細(xì)胞如Caco2。重組蛋白基因被可操作地連接到每一個宿主的合適的表達(dá)調(diào)控序列上。對于真核細(xì)胞，調(diào)控序列包括啟動子并優(yōu)選包括一個增強(qiáng)子，該增強(qiáng)子例如從免疫球蛋白基因SV40、巨細(xì)胞病毒等產(chǎn)生聚腺苷酸化序列，并且可以包括剪切供體和受體序列。
配體與生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合特定的與生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合的配體對本發(fā)明并不關(guān)鍵，在本發(fā)明中可以使用各種各樣的配體。有許多構(gòu)建和選擇配體的方法是本領(lǐng)域公知的，所述配體是例如具有所期望的特異性結(jié)合特征的核酸、蛋白質(zhì)或肽(統(tǒng)稱為肽)或者抗體，或者小的有機(jī)物或無機(jī)物(例如美國專利5143854；WO90/15070；WO92/10092；WO96/11878)。優(yōu)選地，本發(fā)明配體在生理條件下與生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合，而基本上不與pIgR的分泌成分結(jié)合。更優(yōu)選地，本發(fā)明配體在生理條件下只特定地與生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合。典型的生理條件隨組織的不同而不同。但是，典型的生理條件可在哺乳動物胃腸道或呼吸道中獲得，但哺乳動物不限于人。選擇配體來結(jié)合該生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)頭第6、9、12、15、18、21、24、27、30、或33膜近側(cè)氨基酸內(nèi)所包含的胞外配體結(jié)合位點(diǎn)(“表位”)。
可以構(gòu)建抗體，包括多克隆抗體，單克隆抗體，或重組單鏈Fv抗體，用作本發(fā)明中的配體。產(chǎn)生多克隆抗體和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Coligan(1991)，免疫學(xué)常用方法Wiley/Greene,NY；和Harlow和Lane(1989)抗體實(shí)驗(yàn)手冊，Cold Spring Harbor出版社，NY；Stites等(編著)基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(第4版)，Lange Medical Publications,LosAltos,CA，及其中文獻(xiàn)；Goding(1989)，單克隆抗體原理和應(yīng)用(第二版)，科學(xué)出版社，紐約，紐約州；和Kohler和Mistein(1975)，自然，256:495-497；參見，Huse等(1989)，科學(xué)246:1275-1281；和Ward等(1989)，自然341:544-546。Birch和Lennox，單克隆抗體原理和應(yīng)用，Wiley-Liss，紐約，紐約州(1995)。
其它用于抗體或肽配體制備的合適的技術(shù)包括在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體/肽的文庫。生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)高親和性抗體和肽可以通過使用在噬菌體表面表達(dá)重組單鏈Fv(scFv)片段或肽配體的噬菌體展示方法來快速分離。簡言之，編碼噬菌體表面蛋白的基因被改變，以使在攜有該基因的噬菌體表面上被表達(dá)為融合蛋白的抗體或肽基因的插入。表達(dá)期望的抗體或肽配體的噬菌體可以通過其對于生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的親和性/親和力來選擇性地富集和分離。編碼配體的DNA被包裝在相同噬菌體中，這于是使編碼配體的基因分離。多種這樣的方法在文獻(xiàn)中有充分的討論并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如，Winter等，Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994)；Mark等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)；Vaughan等Nature Biotechnology 14:309-314(1996)，美國專利號4642334；4816397；4816567；4704692；WO86/01533；WO88/09344；WO89/00999；WO90/02809；WO90/04036；EP0324162；EP0239400。
在化學(xué)肽合成中，稱之為“分裂，偶聯(lián)和重組”(DCR)的方法已經(jīng)被用來產(chǎn)生組合肽文庫。參見，例如，F(xiàn)urka等，Int.J.Pept.Protein Res.37:487-493(1991)和Houghten等，自然354:84-86(1991)。作為對DCR的替代方法，通過直接偶聯(lián)單體混合物也制備了肽混合物。參見，例如Rutter等，美國專利5010175。有建議用這種方法來制備其它線性聚合物例如“肽類似物”的混合物。參見，Simon等，美國國家科學(xué)院院刊89:9367-9371(1992)。在寡核苷酸合成中，通過例如在合成中的特定步驟中將等摩爾單體混合物給與寡核苷酸聚合物，來制備寡核苷酸產(chǎn)物的“簡并的”或“擺動”混合物。參見，Atkinson和Smith，“寡核苷酸合成實(shí)用方法”，1984,IRL出版社，Oxford,M.Gait編著，pp.35-81。這些合成肽或寡核苷酸的方法提供用于實(shí)驗(yàn)的大量的化合物，其如果是活性的，則可以容易地鑒定。
優(yōu)選地，例如通過將配體中存在的自身(自身的)序列數(shù)目最大化來構(gòu)建配體以將宿主的免疫原性最小化。因此，優(yōu)選具有非異源基因可變區(qū)的嵌合抗體。特別優(yōu)選的是，使用其中不包括異源基因部分的抗體，或者基本上限制為人源化抗體互補(bǔ)決定區(qū)。
配體結(jié)合和試驗(yàn)配體與pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的結(jié)合(即接觸)可以在分泌成分裂解之前或之后發(fā)生；并且該配體可以在基底外側(cè)或頂端表面處結(jié)合。因此，配體可以在基底外側(cè)或頂端被胞吞，或者在頂端至基底外側(cè)，或基底外側(cè)至頂端進(jìn)行胞轉(zhuǎn)作用。配體或其任何元件的結(jié)局將會根據(jù)其物理-化學(xué)性質(zhì)而不同。因此，可以選擇或設(shè)計配體的性質(zhì)以在細(xì)胞表面、核體內(nèi)或者在胞轉(zhuǎn)之后執(zhí)行所期望的功能。例如，改變配體對蛋白酶解或還原環(huán)境的敏感性，可以用來測定結(jié)合的、內(nèi)化的、或通過細(xì)胞運(yùn)輸?shù)呐潴w的分布。如果需要，可以設(shè)計配體以在結(jié)合或胞轉(zhuǎn)之后仍然特異性地結(jié)合于細(xì)胞上，或者釋放到胞外周圍中。因此根據(jù)需要，可以設(shè)計或選擇配體所有的不同元件的性質(zhì)，以獲得不同程度的親和性、穩(wěn)定性、或者不同胞內(nèi)區(qū)室或細(xì)胞表面處的活性，這些元件包括結(jié)合成分、生物活性成分或接頭。
A．配體結(jié)合的體外試驗(yàn)配體與生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的體外結(jié)合一般通過測定哺乳動物上皮細(xì)胞中結(jié)合的配體的胞吞作用或胞轉(zhuǎn)作用來測定?！鞍套饔谩币话阒讣?xì)胞例如通過吞噬作用或胞飲作用吸收物質(zhì)的現(xiàn)象。受體介導(dǎo)的胞吞作用提供了引起細(xì)胞吸收結(jié)合到細(xì)胞表面受體上的物質(zhì)的有效方法。參見，Wu和Wu(1987)，生物化學(xué)雜志262:4429-4432；Wagner等(1990)美國國家科學(xué)院院刊87:3410-3414，和EP-A10388758。任何測定胞吞作用的已知的方法都可以用來測試結(jié)合。例如，結(jié)合、胞轉(zhuǎn)作用和內(nèi)化作用測試詳細(xì)描述于Breiftfeld等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，109:475-486(1989)。
頂端胞吞作用一般通過下面的方法測定，在4℃下，將配體例如Fab片段與Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞的頂端表面處的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合，溫?zé)嶂?7℃保持短時間(0-10分鐘)，然后將細(xì)胞冷卻到4℃，然后測定。MDCK細(xì)胞中pIgR表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的。Breitfeld等，細(xì)胞生物學(xué)方法，32:329-337(1989)。保留在表面上的Fab通過在pH2.3下剝離而去除。分子內(nèi)Fab是剝離后仍然結(jié)合于細(xì)胞上的片段，而表面結(jié)合Fab是通過酸洗而去除的那些片段。非特異性粘合的對照物包括使用沒有以pIgR轉(zhuǎn)染的免疫前Fab和/或MDCK細(xì)胞。
通過使MDCK細(xì)胞在4℃下結(jié)合頂端表面處的Fab，溫?zé)嶂?7℃保持0-240分鐘，然后測定運(yùn)輸?shù)交淄鈧?cè)基質(zhì)中的Fab的量，可以容易測定胞轉(zhuǎn)作用?；淄鈧?cè)運(yùn)輸?shù)腇ab的量相當(dāng)于保留結(jié)合在細(xì)胞(胞內(nèi)或酸剝離)上的Fab和釋放回頂端基質(zhì)中的Fab的總和?；蛘?，通過持續(xù)將細(xì)胞暴露給頂端基質(zhì)中的Fab，并且測定Fab在基底外側(cè)基質(zhì)中的累積，可以測定胞轉(zhuǎn)作用。該方法避免了冷卻細(xì)胞，但是沒有提供運(yùn)輸配體單股的動力學(xué)。在兩種方法中，通過將等份的胞轉(zhuǎn)的Fab過SDS-PAGE，并且用抗雞抗體探測Western印跡來測定Fab的降解。非特異性運(yùn)輸(例如由于液相胞吞作用和胞轉(zhuǎn)作用，或者細(xì)胞間的副細(xì)胞(Paracellular)鍵)可以通過使用沒有以pIgR和/或免疫前Fab轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞來控制。
B．配體結(jié)合的體內(nèi)試驗(yàn)體內(nèi)胞轉(zhuǎn)作用可以常規(guī)地使用沒有病原的實(shí)驗(yàn)動物例如Sprague-Dawley大鼠來測試。將標(biāo)記的配體(例如放射性碘化的抗體)施加到鼻孔中。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，“標(biāo)記”是通過分光光度的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電磁的、放射化學(xué)的或者化學(xué)的方法，例如熒光、化學(xué)熒光或者化學(xué)發(fā)光等方法可檢測的成分。通過測定由標(biāo)記的存在所決定的進(jìn)入循環(huán)的配體可以方便地測定頂端至基底外側(cè)的胞轉(zhuǎn)作用。從循環(huán)回收的配體的整合度可以通過用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對配體進(jìn)行分析來測定。
生物活性成分配體的生物活性成分可以與配體共價或非共價結(jié)合。例如，螯合劑可以用來結(jié)合各種同位素，或者核酸可以通過氫鍵結(jié)合配體。生物活性成分也可以包含在乳液、蛋白質(zhì)類似物或脂質(zhì)體中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，這樣的結(jié)構(gòu)可以通過衍生化的極性頭部基團(tuán)或者通過膜內(nèi)在蛋白與配體共價連接。配體的結(jié)合成分也可以包括生物活性成分。
生物活性成分包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為消炎藥、細(xì)胞因子、抗感染劑、酶活化劑或抑制劑、異構(gòu)修飾劑、或抗生素的多種化合物。因此，生物活性成分包括這樣的化合物，如核酸、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸或衍生物、糖基蛋白、放射性同位素、脂質(zhì)、碳水化合物或重組病毒。術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，包括天然核苷酸已知的類似物。核酸包括反義核酸、用于與單鏈或雙鏈體DNA共價交聯(lián)的衍生化的寡核苷酸、三鏈形式的寡核苷酸或者編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸。核酸也包括用于基因治療的，例如編碼野生型囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白的那些。
生物活性成分與配體結(jié)合生物活性成分與配體結(jié)合的方法根據(jù)該成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)而不同。一般情況下，配體含有多種功能基團(tuán)，其可與生物活性分子上的合適的功能基團(tuán)反應(yīng)，以結(jié)合那里的試劑。或者，配體和/或生物活性成分可以衍生化以暴露或結(jié)合另外的反應(yīng)功能基。衍生化作用可以包括任何各種分子，例如從PierceChemical Company,Rockford lllinois購得的那些接頭分子。這里所使用的是指用來共價或非共價地連接配體和生物活性成分的分子。合適的接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于直鏈或支鏈的碳接頭，雜環(huán)碳接頭，或者肽接頭。參見，例如，Birch和Lennox，單克隆抗體理論和應(yīng)用，第4章，Wiley-Liss，紐約，紐約州(1995)；美國專利5218112,5090914；Hermanson，生物接合技術(shù)(Bioconjugate Techniques)，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego,CA(1996)。
在兩個分子都是多肽時，接頭可以通過其側(cè)基與組成氨基酸連接(例如，通過二硫鍵與半胱氨酸連接)。具有一個與特定生物活性成分上的基團(tuán)反應(yīng)的功能基和另一個與配體反應(yīng)的功能基的雙功能接頭可以用來生成期望的接合物?；蛘撸苌饔每梢园ǔ煞值幕瘜W(xué)處理；例如糖蛋白抗體的糖基部分用高碘酸鹽進(jìn)行乙二醇裂解(glycol cleavage)，以產(chǎn)生游離的醛基?？贵w上游離的醛基可以與試劑上的游離的胺或肼基反應(yīng)，以結(jié)合那里的試劑。(參見美國專利4671958)?？贵w或抗體片段上的游離的巰基的產(chǎn)生方法也是已知的(參見美國專利4659839)。用于各種化合物包括放射性核素金屬螯合物，毒素和藥物與蛋白質(zhì)例如抗體結(jié)合的很多方法和接頭分子是已知的。參見，例如歐洲專利申請No.188256；美國專利4671958,4659839,4414148,4699784；4680338；4569789；和4589071；和Borlinghaus等，癌癥研究，47:4071-4075(1987)。
有時希望當(dāng)?shù)竭_(dá)靶位點(diǎn)時釋放接合的分子。因此，可以使用包括在靶位點(diǎn)附近可裂解的鍵的接合物。從抗體釋放生物活性成分的鍵的裂解可以通過酶活性或接合物在靶細(xì)胞內(nèi)或在靶細(xì)胞位點(diǎn)周圍的條件來促進(jìn)。當(dāng)靶位點(diǎn)是腫瘤時，可以使用在腫瘤位點(diǎn)的條件(例如當(dāng)暴露給腫瘤相關(guān)的酶或酸性pH時)下可裂解的接頭。使用順-烏頭酸間隔臂對于核內(nèi)體釋放生物活性成分是有用的。類似地，二硫鍵在核內(nèi)體的還原環(huán)境中是可裂解的。
多種不同的可裂解接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見，美國專利4618492；4542225和4625014。試劑從這些接頭基團(tuán)釋放的機(jī)理包括，例如，對光不安的鍵的紫外線照射和酸催化水解。美國專利5141648公開了包括特定化學(xué)結(jié)構(gòu)接頭的免疫接合物，其中鍵在體內(nèi)裂解，從而釋放結(jié)合的化合物(放射療劑，藥物，毒素等)。該接頭易在溫和酸性pH下裂解，并且相信在運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞細(xì)胞質(zhì)期間裂解，從而在靶細(xì)胞中釋放生物活性化合物。美國專利4671958包括對含有接頭的免疫接合物的描述，這些接頭在體內(nèi)在靶位點(diǎn)處通過患者互補(bǔ)系統(tǒng)的蛋白酶裂解。根據(jù)已經(jīng)大量報道的關(guān)于與配體結(jié)合各種各樣的放射診斷化合物，放射治療化合物、藥物、毒素和其它成分的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定給定成分與本發(fā)明配體結(jié)合的合適方法。
配體從核內(nèi)體輸出本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法可以用來將配體，或者其任何部分運(yùn)輸出核內(nèi)體。
與特異性結(jié)合生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合的聚-L-賴氨酸/核酸復(fù)合物可以用于有效轉(zhuǎn)染。Ferkol等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.),92:2394-2400(1993)；和Ferkol等，臨床研究雜志，95:493-502(1995)。
在另一項研究中，聚-L-賴氨酸可以例如通過基因融合或化學(xué)接頭與特異性結(jié)合pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的配體連接。接著，該復(fù)合物可以與有缺陷的腺病毒連接。Curiel及其同事證明與已經(jīng)連接有缺陷的腺病毒的變體的聚-L-賴氨酸或聚-L-賴氨酸-運(yùn)鐵蛋白靜電結(jié)合的裸質(zhì)粒DNA可以運(yùn)輸給細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率達(dá)90％。腺病毒-聚-L-賴氨酸-DNA接合物與正常的腺病毒受體結(jié)合，并且接著通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)在化。這種方法已使得基因治療載體表達(dá)量增加了1000倍。皰疹病毒具有類似的性質(zhì)。
Curiel等(1991)，美國國家科學(xué)院院刊88:8850-8854；Cotten等(1992)美國國家科學(xué)院院刊89:6094-6089；Curiel等(1992)Hum GeneTher 3:147-154；Wagner等(1993)J.Boil.Chem.268:6866-6869；Curiel等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.6:247-252，以Harris等(1993)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.9:441-447；Gao等(1993)Hum.Gene.Ther.4:17-24；Curiel等美國專利申請序列號07/768,039。
在另一項使用流感病毒的研究中，血凝素中的疏水性肽在低pH可以作為融合肽起作用來進(jìn)行病毒與核內(nèi)體膜的融合，并且將病毒運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。該肽已經(jīng)在用于使用運(yùn)鐵蛋白受體的基因轉(zhuǎn)移的運(yùn)鐵蛋白/肽/聚-L-賴氨酸/DNA復(fù)合物中使用，并且大大提高了表達(dá)效率。Wagner等，美國國家科學(xué)院院刊89:7934-7938(1992)。該肽可以經(jīng)基因工程進(jìn)入配體，用來將配體或其部分運(yùn)出核內(nèi)體。
另一項研究可以使用蓖麻毒蛋白A。蓖麻毒蛋白A鏈能穿出核內(nèi)體并且進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。Beaumell等，生物化學(xué)雜志，268:23661-23669(1993)。本發(fā)明配體可以通過例如基因融合或化學(xué)接頭與蓖麻毒蛋白A連接。
盡管本發(fā)明為了清楚理解的目的，通過詳細(xì)說明和實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是顯而易見在權(quán)利要求書范圍內(nèi)是可以實(shí)施一些變化和改變的。
實(shí)施例1實(shí)施例1描述了特異性結(jié)合兔pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)區(qū)的雞抗體和Fab片段的產(chǎn)生和測定方法。
兔pIgR跨膜片段在位置630處的纈氨酸開始。位于跨膜片段之前的兔pIgR的24個胞外殘基序列是607-AspProAlaSerGlySerArgAlaSerValAspAlaSerSerAlaSerGlyGlnSerGlySerAlaLys-629(SEQ ID NO:7).
合成了代表pIgR的胞外膜近側(cè)16和23個氨基酸的兩個肽(Immuno-Dynamics,Inc.,La Jolla,CA)。為接合目的而加入C-末端半胱氨酸。第一個肽的肽序列是(單字母碼)DPA SGS RAS VDA SSA SGQ SGSAKC(SEQ ID NO:8)；第二個肽是ASV DAS SAS GQS GSA KC(SEQ IDNO:9)。每個肽的量的一半接合匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)(Immuno-Dynamics,Inc提供)。
KLH-接合的肽被送到Lampire Biological Laboratories(Pipersville,PA)，以使得每種肽在兩只雞中都產(chǎn)生雞抗體。對雞免疫的Lampire’標(biāo)準(zhǔn)方法之后收集免疫前蛋和免疫前試驗(yàn)血樣；在方案開始時用弗氏完全懸浮液肌內(nèi)注射2mg肽；第1周用弗氏不完全懸浮液肌內(nèi)注射0.5mg肽；第2周用弗氏不完全懸浮液肌內(nèi)注射0.25mg肽；第3周不注射；第4周用弗氏不完全懸浮液肌內(nèi)注射0.25mg肽；第5周不注射，第6周取血樣。在第6周左右開始每天收集雞蛋，并且每月取血樣。每月運(yùn)輸雞蛋。
到達(dá)后，小心從蛋白中分離蛋黃，保存在4℃50-80m1/蛋黃的堿性緩沖液(0.01M磷酸鈉，pH7.5,0.1M氯化鈉，0.01％疊氮化物)中，直到用于提取雞抗體(“IgY”)。根據(jù)Polson等的方法，免疫學(xué)通訊(ImmunolCommun.)9:475(1980)，通過一系列PEG沉淀后的一系列硫酸銨沉淀，從批量貯存的蛋黃中提取IgY。簡要地說，向堿性緩沖液中的蛋黃加入固體PEG(聚乙二醇，MW8000)，達(dá)到PEG重量與稀釋的蛋黃的體積之比為3。5％，并在室溫下攪拌直到溶解。溶液在20℃以14000g離心10分鐘，并且通過疏松地鋪有一層吸收劑棉網(wǎng)的漏斗傾析。向澄清的濾液中加入更多的PEG，達(dá)到最終PEG濃度為12％，以沉淀IgY。通過在20℃以14000g離心10分鐘沉積沉淀物后，將蛋黃將沉淀物溶解于60ml/蛋黃的堿性緩沖液中，并且加入等體積24％堿性緩沖液中的PEG以再生成沉淀。沉淀物在20℃以14000g再離心10分鐘兩次，以去除所有的殘余PEG溶液。將小丸溶解于30ml/蛋黃堿性緩沖液中，然后通過緩慢加入等體積飽和的硫酸銨并且通過在4℃下攪拌過夜，使蛋白質(zhì)在50％飽和的硫酸銨中沉淀。沉淀在4℃以14000g離心10分鐘，并且用等體積冷的50％硫酸銨洗滌小丸，沉淀再次在4℃以14000g離心10分鐘，溶解于沒有鈣或鎂，pH7.5的PBS中，并且在PBS中透析以去除所有的硫酸銨。通過SDS-PAGE(大約90-95％)證實(shí)IgY制劑的純度，通過測定280nm處的吸收值并使用1.3消光系數(shù)來估計IgY的量。
首先將肽與SULFOLINK偶聯(lián)凝膠(Pierce Chemical Company)共價連接，這產(chǎn)生了對疏基例如該肽C-端半胱氨酸上的巰基的特異性結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)從注射有第一肽SEQ ID NO:8的雞親和純化。根據(jù)產(chǎn)品說明，用3mg肽制備3ml柱子。簡要地說，用6柱體積的50mM Tris,5mM EDTA,pH8.5平衡3ml柱子，然后將3ml 50mM Tris,5mM EDTA,pH8.5中的3mg肽SEQ ID NO:8加入到柱中，室溫下混合15分鐘。在不攪拌的情況下，將柱凝膠和肽再孵育30分鐘。從凝膠中排出肽緩沖液并留下以備后來進(jìn)行試驗(yàn)證明偶聯(lián)的效率，試驗(yàn)時使用檢測巰基的Ellman試劑(DTNB(5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))，Pierce Chemical Company)。肽SEQ ID NO:8不含有任何芳香氨基酸基團(tuán)，不可能用分光光度法或者通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)測試技術(shù)例如Bradford分析來測定。使用Ellman試劑，根據(jù)產(chǎn)品說明，比較與凝膠結(jié)合之前或之后的肽溶液樣品，證明100％結(jié)合效率。用3柱體積50mMTris,5mM EDTA,pH8.5沖洗凝膠柱子，然后在室溫下與3ml 50mM Tris,5mM EDTA,pH8.5中的半胱氨酸溶液混合15分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，然后在不攪拌的情況下再封閉30分鐘。排空柱子，并且用16柱體積1M氯化鈉沖洗后用16柱體積脫氣的0.05％疊氮化鈉沖洗。
根據(jù)Rosol等，獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫生理學(xué)，35:321-337,1993的改進(jìn)的方法，在這種肽連接的SULFOLINK凝膠上親和純化IgY。一旦處于室溫下，就將柱子用10柱體積PBS沖洗。IgY在柱子上循環(huán)2小時。然后用10柱體積PBS沖洗柱子，然后用10柱體積磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)及0.5M氯化鈉沖洗柱子。用500mM甘氨酸，pH2.5洗脫肽特異性IgY，并用1M TrispH9.5中和。使用UV分光光度計和繪圖儀器跟蹤沖洗和蛋白質(zhì)從柱上的洗脫。在OD280nm處有信號的樣品在centriprep 30(Amicon)中濃縮至500-600μl體積。
根據(jù)產(chǎn)品說明和改進(jìn)的Akita和Nakai的免疫學(xué)方法雜志，162:155-164,1993的方法，由親和純化的IgY與固定的胃蛋白酶(PierceChemical Company)孵育，制備Fab片段(“Yab片段”)。用16倍體積的50mM乙酸鈉緩沖液pH4.2將胃蛋白酶漿狀物沖洗兩次，并且懸浮于2倍體積的乙酸鈉緩沖液中。親和純化的IgY與固定的胃蛋白酶在37=BOC處孵育，并且混合5小時。加入1摩爾Tris-HCl pH8.0，使最終pH為7.5。胃蛋白酶混合物以1000g離心5分鐘，并且將含有該片段的上清液加入到CENTRICON 10過濾器(Amicon)中，以去除小的Fc片段。通過SDS-PAGE證明完全裂解。
通過ELISA對來自連續(xù)試驗(yàn)血樣的雞血清和從集中的蛋黃批量提取的IgY進(jìn)行測試以證明識別該肽。通過蛋白質(zhì)印跡對親和純化的IgY和Fab’片段(“Yab”)測定其識別完整pIgR的能力。根據(jù)Breitfeld等(細(xì)胞生物學(xué)方法，32:329-337(1989))的方法，使用含有1μg/ml蛋白水解酶抑制劑和苯基甲基磺?；?PMSF)的10％NP40裂解緩沖液，從Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞和用兔pIgR(“pWe”)轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物。細(xì)胞裂解產(chǎn)物在還原條件下過10％凝膠柱，并轉(zhuǎn)移到PVDF(聚二氟乙烯)膜(Millipore,Bedford,MA)上。對pIgR細(xì)胞質(zhì)部分的小鼠單克隆抗體，SCl66(Solari等，細(xì)胞，36:61-71(1984))，被用作正對照抗體，從免疫前蛋黃分離的IgY被用作負(fù)對照。HRP-接合的兔抗-雞IgY(JacksonImmunochemicals)和HRP-接合的兔抗-小鼠(Biorad)被用作第二抗體。來自用第一肽注射的雞的IgY和來自用亞序列肽注射的雞的IgY識別完整的pIgR，但是來自用亞序列抗體注射的雞的IgY則不能識別。MDCK和pWe細(xì)胞在蓋玻片上生長，用4％多聚甲醛固定并用皂草苷滲透的對于IgY和Yab片段(來自用第一肽注射的雞)的免疫熒光研究顯示出pIgR-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更特異的染色(從Jackson Immunochemicals獲得FITC-接合的兔抗-雞和抗-小鼠抗體)。固定細(xì)胞和滲透細(xì)胞的細(xì)胞ELISA(M Hahne等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，121:655-64,1993的改進(jìn)的方法)表明Yab片段染色用pMe細(xì)胞比MDCK細(xì)胞快5-倍。這些數(shù)據(jù)證明我們成功地獲得了抗兔pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)肽的多充隆抗體，并且其識別完整的pIgR。
實(shí)施例2實(shí)施例2描述了通過噬菌體展示(phage display)對人重組單鏈可變區(qū)片段(scFv)抗體的選擇。
通過噬菌體展示對scFv的選擇需要可溶的生物素化抗原或固定在固相載體上的抗原。因?yàn)橥ㄟ^噬菌體展示選擇的scFv趨向于是低親和性的結(jié)合劑并且因?yàn)槿芙獾目乖梢赃x擇較高親和性的scFv(R Schier等，分子生物學(xué)雜志255:28-43,1996)，所以選擇了溶解的抗原選擇方法。以產(chǎn)品說明中描述的方法為基礎(chǔ)，使用生物素-BMCC((1-生物素酰氨-4-(4’[馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-甲酰胺)丁烷)(Pierce Chemical Company,Roekford,IL))，使實(shí)施例1中描述的相應(yīng)于兔pIgR的膜近側(cè)胞外部分23個氨基酸的pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)第一肽通過半胱氨酸殘基的巰基與生物素接合。為了保證肽沒有通過巰基二聚體化，首先用1％0.1M Tris 5mM EDTA pH8.0中的硼氫化鈉將肽還原。通過加入1N鹽酸將溶液pH降低至pH5。一旦溶液不再產(chǎn)生氣體，則加入1M Tris重新達(dá)到pH7。通過將生物素化試劑溶解于DMSO中來制備8.5mM生物素-BMCC溶液。將5倍摩爾過量的生物素-BMCC加入到還原的肽中，并在4℃下孵育過夜。通過C18柱，用10-50％CH3CN梯度范圍進(jìn)行HPLC 30分鐘，以215nmUV檢測，從而從游離的生物素中分離生物素化的肽。通過電噴射和LSIMS(液體第二離子質(zhì)譜)用質(zhì)譜鑒定相應(yīng)于生物素化的肽的正確峰。
將生物素化的第一肽與編碼多種不同人scFv(大約1010)的噬菌體文庫孵育。該噬菌體文庫根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的描述來制備(JD Marks等，分子生物學(xué)雜志，222:581-97,1991；JD Marks等，生物/技術(shù)10；779-783,1992；JD Marks等，生物/技術(shù)11:1145-1149,1993；AD Griffths等，EMBO J12:725-734,1993)。根據(jù)Marks等的描述(分子生物學(xué)222:581-97,1991)和下面的改進(jìn)，在大腸桿菌抑制因子菌株TG-1中一共進(jìn)行4輪選擇、噬粒補(bǔ)救和擴(kuò)展。已知所使用的噬菌體文庫含有幾種鏈酶抗生物素蛋白結(jié)合劑，這樣頭3輪選擇包括預(yù)清除步驟，用鏈酶抗生物素蛋白瓊脂糖(Sigma)孵育噬菌體30分鐘兩次。然后噬菌體與5μg生物素化的肽孵育1小時。為了使生物素化的肽與接觸的噬菌體結(jié)合，肽-噬菌體溶液與抗生物素蛋白磁珠孵育，分別在第一輪孵育15分鐘，在第三輪孵育5分鐘，并與鏈酶抗生物素蛋白磁珠分別在第二輪孵育10分鐘，在第四輪孵育5分鐘。把從第四輪選擇中補(bǔ)救的噬菌體感染到大腸桿菌非抑制因子菌株HB2151中，用IPTG誘導(dǎo)各個噬?？寺‘a(chǎn)生溶解的scFv片段，如Marks等(分子生物學(xué)雜志，222:581-97,1991)所述。
對來自各個克隆的細(xì)菌上清液在點(diǎn)印跡分析中分析溶解的scFv片段的表達(dá)，并在ELISA測定中分析與生物素化的第一肽的結(jié)合(Finnem等，免疫學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)，102:566-574,1995)。但是ELISA測定用下面的方法改進(jìn)在4℃下用抗生物素蛋白(10μg/ml，于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中)包被96孔微孔平板(Immulon-4)過夜，用PBS沖洗3次，用PBS中2％的牛奶封閉，并用生物素化的肽(5μg/ml，于PBS中)結(jié)合。用TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液(Kirkegaard和Perry)作為底物(100μl/孔)，在450nm波長處在ELISA讀數(shù)器中讀到顏色反應(yīng)之前用0.18M H2SO4終止反應(yīng)。點(diǎn)印跡分析表明，用自第4輪選擇選出的噬菌體感染的96個補(bǔ)救HB2151菌落中的66％產(chǎn)生scFv。ELISA測定表明96個菌落中的43個產(chǎn)生結(jié)合肽的scFv。
通過PCR篩選測定所有陽性克隆的多樣性。重鏈和輕鏈的scFv插入片段首先通過引物L(fēng)MB3和fd-Seq1(Marks等，分子生物學(xué)雜志，222:581-97,1991)擴(kuò)增，然后用限制酶BstN1消化。用SequiTherm Lone-Read循環(huán)測序試劑盒(Epicentre Technologies)和Licor機(jī)，對具有不同DNA指紋圖案的克隆測定序列。鑒定了5種單一序列。
為了獲得大量的純化的scFv用于進(jìn)一步表征和應(yīng)用，將5個單一序列scFv亞克隆到表達(dá)載體pUC119 Sfi-NotmycHis，其在scFv的C-末端加入一個六組氨酸標(biāo)記物(Schier等，分子生物學(xué)雜志，255:28-43,1996)。
實(shí)施例3實(shí)施例3描述了以Ferkol等，臨床研究雜志，92:2394-2400(1993)；和Ferkol等，臨床研究雜志，95:493-502(1995)中描述的方法的變化方法，將野生型囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)基因定向于表達(dá)pIgR的哺乳動物細(xì)胞中，所引用的兩篇文獻(xiàn)在此用作參考。
通過例如實(shí)施例1所公開的技術(shù)制備與pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)區(qū)反應(yīng)的Fab片段并純化。根據(jù)Ferkol等(1993)的方法，使用異雙功能交聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)，使Fab與聚-(L-賴氨酸)(MW20000道爾頓)連接。
包含CFTR基因的質(zhì)粒與巨細(xì)胞病毒早期啟動子連接，并插入到載體pCB6中。Thomas等生物化學(xué)雜志，268:3313-3320(1993)。通過將質(zhì)粒DNA與3M氯化鈉中的Fab-聚賴氨酸結(jié)合來制備Fab-聚賴氨酸-DNA復(fù)合物。
通過將復(fù)合物溶解于0.1ml磷酸緩沖鹽水中，并且將其放入用甲氧氟烷吸入麻醉劑輕微麻醉的無病原Sprague-Dawley大鼠(250-300克)的鼻孔中。用微移液管將100μl PBS中的質(zhì)粒直接施加到人為制約后處于仰臥位置的大鼠鼻孔中來導(dǎo)入復(fù)合物。大鼠保持這種位置直到溶液被吸入。已經(jīng)證明該技術(shù)可使得將樣品有效施加到鼻粘膜上。Shahin等，感染和免疫60:1482-1488(1992)；Gizurarson等，疫苗，10:101-106(1992)。轉(zhuǎn)染的基因的轉(zhuǎn)錄通過產(chǎn)生CFTR蛋白質(zhì)的免疫熒光測試來測定。
實(shí)施例4實(shí)施例4描述了體內(nèi)將外源蛋白質(zhì)定向于表達(dá)pIgR的細(xì)胞中的方法。
使蛋白質(zhì)自核內(nèi)體外出的有效方法是使用與腺病毒偶聯(lián)的蛋白質(zhì)-Fab復(fù)合物。該方法已經(jīng)對多種受體系統(tǒng)使用，它導(dǎo)致表達(dá)量增加多至1000倍。Curiel等，J.Respir.Cell Mol.Biol.6:247-252(1992)；Curiel等，美國國家科學(xué)院院刊88:8850-8854(1991),Gao等，Hum.Gene Ther.4:17-24(1993)，各文獻(xiàn)在此用作參考。偶聯(lián)通過腺病毒和Fab/聚-賴氨酸的生物素化接著用抗生物素蛋白交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)。得到的復(fù)合物和實(shí)施例4一樣給藥。
實(shí)施例5實(shí)施例5描述了特異性結(jié)合生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的抗體從包含pIgR的MDCK(Madin Darby犬腎)細(xì)胞的頂端至基底外例膜的胞轉(zhuǎn)作用。
根據(jù)實(shí)施例1的說明制備與pIgR反應(yīng)的Yab片段。通過Goldsein等(酶學(xué)方法，96:241-249)的一氯化碘方法將抗-pIgR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)Yab片段放射性碘標(biāo)記。放射性碘標(biāo)記的IgA被用作對照配體。向在12mm直徑，0.4μm孔大小細(xì)胞培養(yǎng)插入物(Transwells,Costar)上以極化方法生長4天的MDCK和pWe細(xì)胞的頂端表面加入放射性碘標(biāo)記的Yab片段或IgA(107cpm于100μl/孔)。Breitfeld等，細(xì)胞生物學(xué)方法32:329-337(1989)。在有和沒有與蛋白酶抑制劑，亮抑酶肽，50μl/ml預(yù)孵育2小時情況下，向細(xì)胞中加入放射性標(biāo)記的Yab片段。在37℃頂端吸收20分鐘后，用MEM(極限必需培養(yǎng)基)/BSA(牛血清白蛋白)快速沖洗未結(jié)合的放射性標(biāo)記的配體3次，一次沖洗5分鐘，兩次沖洗更快。在7、15、30、60和120分鐘時間點(diǎn)收集和變化頂端和基底外側(cè)培養(yǎng)基。以在γ計數(shù)器(Beckman InstrumentsPalo Alto,CA)中定量。在120分鐘切下細(xì)胞培養(yǎng)插入片段用于γ計數(shù)器中的定量，并計算放射性總的初始提入量。從pWe細(xì)胞的攝入量減去MDCK背景攝入以計算放射性標(biāo)記的配體的特異性再循環(huán)和胞轉(zhuǎn)作用。結(jié)果表明Yab片段的13-18％從用亮抑酶肽預(yù)處理的細(xì)胞的頂端表面胞轉(zhuǎn)到基底外側(cè)表面，相反IgA是5-6％。
該說明書中提到的所有的公開物和專利在此引入說明書作為參考，同樣地，被具體地和個別地指出的各個公開物或?qū)＠苍谶@里用作參考。
序列表(1)基本資料(ⅰ)申請人(A)名稱The Regents of the University of Califomia(B)街道300 Lakeside Drive,22nd Floor(C)城市Oakland(D)州California(E)國家美國(F)郵編(ZIP):94612-3558(G)電話(510)748-6600(H)電傳(I)電報(ⅱ)發(fā)明名稱PIGR生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)和相關(guān)配體的細(xì)胞內(nèi)化作用(ⅲ)序列數(shù)目11(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Townsend and Townsend and Crew LLP(B)街道Two Embarcadero Center,Eighth Floor(C)城市San Francisco(D)州California(E)國家美國(F)ZIP:94111-3834(ⅴ)計算機(jī)可讀形式(A)軟磁盤(B)計算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟盤PatentIn Release#1.0，版本#1.3(ⅵ)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)枦]有登記WO(B)申請日沒有登記(C)分類
(ⅶ)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S60/018958(B)申請日1996年6月4日(ⅷ)代理人/事務(wù)所信息(A)名稱Weber,Kenneth A.
(B)登記號31677(C)參考/記錄號02307E-067910PC(ⅸ)電訊信息(A)電話(415)576-0200(B)電傳(415)576-0300(2)SEQ ID NO:l的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名詞/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它/注=“Xaa=極性或帶電荷的氨基酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:
Phe Ala Xaa Glul(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Glu Arg Glu Ile Gln Asn Val Arg Asp Gln Ala Gln Glu Asn Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Asp Ala Gly Ser Ala Asp Gly Gln Ser Arg Ser Ser Ser Ser20 25 30Lys(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Glu Arg Glu Ile Gln Asn Ala Gly Asp Gln Ala Gln Glu Asn Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Asn Ala Gly Ser Ala Gly Gly Gln Ser Gly Ser Ser Lys20 25 30(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Glu Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala1 5 10 15Ser Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg20 25 30(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Glu Ser Val Lys Asp Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Pro1 5 10 15Gly Arg Pro Thr Gly Tyr Ser Gly Ser Ser Lys20 25(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度40個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Leu Ala Glu Val Ala Val Gln Ser Ala Glu Asp Pro Ala Ser Gly Asp1 5 10 15Pro Ala Ser Gly Ser Arg Ala Ser Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu20 25 30Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ser Lys35 40(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Asp Pro Ala Ser Gly Ser Arg Ala Ser Val Asp Ala Ser Ser Ala Ser1 5 10 15Gly Gln Ser Gly Ser Ala Lys20(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Asp Pro Ala Ser Gly Ser Arg Ala Ser Val Asp Ala Ser Ser Ala Ser1 5 10 15Gly Gln Ser Gly Ser Ala Lys Cys20(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Ala Ser Val Asp Ala Ser Ser Ala Ser Gly Gln Ser Gly Ser Ala Lys1 5 10 15Cys(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度61個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu1 5 10 15Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu Lys20 25 30Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser Val35 40 45Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg50 55 60
(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度61個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu1 5 10 15Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu Lys20 25 30Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser Val35 40 45Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg50 55 60
權(quán)利要求
1．一種特異性結(jié)合細(xì)胞聚免疫球蛋白受體(pIgR)的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的配體，條件是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。
2．權(quán)利要求1的配體，其中配體是抗體。
3．權(quán)利要求1的配體，其中配體是人源化抗體。
4．權(quán)利要求1的配體，其中配體是抗體的重組單鏈可變區(qū)片段。
5．權(quán)利要求1的配體，其與受體裂解位點(diǎn)細(xì)胞膜近側(cè)頭33個氨基酸內(nèi)的胞外表位結(jié)合。
6．權(quán)利要求1的配體，其與選自下組的肽結(jié)合小鼠Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:2)大鼠Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:3)人Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ IDNO:4)牛Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:5)兔Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID NO:6)。
7．權(quán)利要求1的配體，其進(jìn)一步定義為具有選擇性結(jié)合受體生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的結(jié)合成分和其中生物活性成分選自核酸、蛋白質(zhì)、放射性同位素、脂質(zhì)和碳水化合物的生物活性成分。
8．權(quán)利要求7的配體，其中核酸編碼野生型囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白。
9．一種通過將配體與細(xì)胞聚免疫球蛋白受體的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合而將配體引入表達(dá)聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞的方法，條件是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。
10．權(quán)利要求9的方法，其中配體是抗體。
11．權(quán)利要求9的方法，其中配體是人源化抗體。
12．權(quán)利要求10的方法，其中配體是抗體的重組單鏈可變區(qū)片段。
13．權(quán)利要求9的方法，其中配體與受體裂解位點(diǎn)細(xì)胞膜近側(cè)頭33個氨基酸內(nèi)的胞外表位結(jié)合。
14．權(quán)利要求9的方法，其中配體與選自下組的肽結(jié)合小鼠Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(SEQ ID NO:2)大鼠Glu-Arg-Glu-lle-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:3)人Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ IDNO:4)牛Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:5)兔Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID NO:6)。
15．權(quán)利要求9的方法，其中配體進(jìn)一步定義為具有選擇性結(jié)合受體生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的結(jié)合成分和其中生物活性成分選自核酸、蛋白質(zhì)、放射性同位素、脂質(zhì)、和碳水化合物的生物活性成分。
16．權(quán)利要求15的方法，其中核酸編碼野生型囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白。
17．權(quán)利要求1的配體，其進(jìn)一步定義為具有選擇性結(jié)合受體生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)的結(jié)合成分和其中生物活性成分選自消炎藥、反義寡聚物、抗生素、和抗感染劑的生物活性成分。
18．權(quán)利要求9的方法，其中細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
19．權(quán)利要求18的方法，其中細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
20．權(quán)利要求9的方法，其中配體與細(xì)胞頂端表面處的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合。
21．權(quán)利要求20的方法，其中配體被胞轉(zhuǎn)到細(xì)胞的基底外側(cè)面。
22．權(quán)利要求21的方法，其中配體從細(xì)胞基底外側(cè)表面處的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)釋放。
23．權(quán)利要求9的方法，其中配體與細(xì)胞基底外側(cè)表面處的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合。
24．權(quán)利要求9的方法，其中配體只特異性結(jié)合生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)。
25．權(quán)利要求1的配體，其中配體只特異性結(jié)合生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)。
26．一種把配體與表達(dá)聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞結(jié)合的方法，包括配體與受體的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)結(jié)合的步驟，前提是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。
27．權(quán)利要求26的方法，其中配體在結(jié)合后胞吞到細(xì)胞中。
28．權(quán)利要求l的配體，其與具有下面序列的肽結(jié)合Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-Ile-Glu-Asn-Lys-Ala-Ile-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID NO:10)。
29．權(quán)利要求9的配體，其與具有下面序列的肽結(jié)合Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-Ile-Glu-Asn-Lys-Ala-Ile-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID NO:11)。
全文摘要
與細(xì)胞的聚免疫球蛋白受體(pIgR)的生物大分子特征性高級結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的成分和方法,條件是該配體在生理條件下基本上不結(jié)合pIgR的分泌成分。該配體可以定靶到、進(jìn)入或通過細(xì)胞,并且可以包含生物活性成分。
文檔編號A61K39/385GK1221428SQ97195238
公開日1999年6月30日 申請日期1997年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月4日
發(fā)明者基思·E·莫斯托夫, 賈尼絲·理奇曼－埃森斯塔特 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會