甲基-β-環(huán)糊精在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】甲基-β-環(huán)糊精在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，提供一種以MβCD為有效成分，防治BmNPV入侵細(xì)胞的藥物。該藥物在深入研究病毒入侵機(jī)制、桿狀病毒感染宿主的受體研究方面有重要意義。當(dāng)MβCD濃度在8mM以上時(shí)能完全抑制病毒感染。本發(fā)明在防治膿病的蠶用藥物研發(fā)及生產(chǎn)中，具有重要的應(yīng)用推廣價(jià)值。
【專利說明】甲基-β -環(huán)糊精在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與病毒學(xué)領(lǐng)域，涉及甲基-β-環(huán)糊精(Methyl-P-cyclodextrin，簡稱 ΜβΟ)，也有表示為 MBCD，Me-β CD, MeBCD)在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶血液型膿病是養(yǎng)蠶業(yè)三大病毒病中危害最為嚴(yán)重的一種病害，其傳染性極強(qiáng)，近年來養(yǎng)蠶生產(chǎn)中較為普遍發(fā)生，并不時(shí)發(fā)生部分農(nóng)戶或一定養(yǎng)蠶區(qū)域內(nèi)絕產(chǎn)的情況。血液型胺病是由家香核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)引起的，該病毒屬桿狀病毒科、核型多角體病毒屬，是一種具有囊膜、雙鏈DNA病毒,它在病毒復(fù)制過程中會形成兩種病毒粒子，即包涵體來源病毒粒子與芽生病毒粒子，前者隨著食物進(jìn)入家蠶中腸感染部分中腸細(xì)胞，被感染中腸細(xì)胞會產(chǎn)生大量芽生病毒粒子，新生的芽生病毒粒子進(jìn)而感染其它組織導(dǎo)致細(xì)胞裂解，蟲體最終死亡。病蠶、蛹、蛾的尸體、膿汁及被之污染的蠶糞、蠶具、蠶繭，帶有大量的病毒，具有強(qiáng)烈的傳染性，是血液型膿病的主要的傳染源。
[0003]目前主要是通過抗血液型膿病家蠶品種的培育以及嚴(yán)格消毒、良桑飽食以提高蠶體抵抗性能來預(yù)防該病的發(fā)生。
[0004]在抗病育種 方面，江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所育種專家通過長期的雜交選育，培育出有高度抵抗性實(shí)用品種“華康2號”[徐安英，林昌麒，錢荷英，孫平江，張?jiān)氯A，劉明珠，李龍.耐家蠶核型多角體病毒病蠶品種“華康2號”的育成.蠶業(yè)科學(xué)，2013，(39)2:275-282];轉(zhuǎn)基因抗性育種近幾年也取得一定的進(jìn)展，已有學(xué)者將抗病毒蛋白在家蠶中腸內(nèi)過量表達(dá)，或者利用RNAi技術(shù)抑制病毒基因表達(dá)，[1.Jiang L.，et al.，Resistance toBombyx mori nucleopolyhedrovirus via overexpress1n of an endogenous antiviralgene in transgenic silkworms.Arch Virol，2012.157 (7):1323-8.2.1sobe, R.，et al.，UseofRNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms.Arch Virol, 2004.149(10):1931-40.]，但由于轉(zhuǎn)基因操作復(fù)雜、低效性導(dǎo)致研究困難，而且轉(zhuǎn)基因的品種后代不穩(wěn)定性都限制了其在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。傳統(tǒng)的抗病育種周期很長，并且目前生產(chǎn)上蠶農(nóng)飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)性狀良好的一代雜交種的血液型膿病的抗性很弱，家蠶的BmNPV抗性品種培育在近期難于滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求，還需加強(qiáng)對抗性品種培育的遺傳學(xué)、基因組學(xué)尤其是抗性相關(guān)基因與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因間的相關(guān)關(guān)系的研究，提高抗NPV品種的經(jīng)濟(jì)性狀和實(shí)用價(jià)值。
[0005]生產(chǎn)上主要是通過加強(qiáng)養(yǎng)蠶前嚴(yán)格的消毒盡量杜絕BmNPV的感染，消毒劑主要成分是氯制劑，但該類消毒劑的強(qiáng)腐蝕性、酸堿度和溶解性一直是困擾其發(fā)展的問題；還有一些復(fù)合氯制劑，溶解性得到了一定的改善，復(fù)合后溶液的消毒效果和強(qiáng)堿性的穩(wěn)定性又有減弱；生產(chǎn)上還有使用甲醛熏蒸蠶具、蠶室達(dá)到預(yù)防的效果，但是無論堿性消毒劑還是甲醛，都有強(qiáng)的刺激性，因此，在生產(chǎn)上通過使用治療藥物，解決家蠶血液型膿病的流行和暴發(fā)問題是蠶農(nóng)或部分技術(shù)人員非常迫切的期望，已有試驗(yàn)研究證明B-丙內(nèi)酯等化學(xué)物品對家蠶BmNPV感染后的發(fā)病具有明顯的抑制效果[呂鴻聲.昆蟲病毒與昆蟲病毒病[M].北京:科學(xué)出版社，1982，405-407]，我們前期大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Μβ⑶可以防治BmNPV入侵家蠶細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞過程包括吸附、進(jìn)入、復(fù)制以及病毒粒子包裝及釋放[George FRohrmann.Baculovirus Molecular B1logy:Third Edit1n.2013:Bethesda(MD)],所以病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是病毒感染的關(guān)鍵起始點(diǎn)，如果能夠限制病毒的入侵，則可以在源頭上防治家蠶膿病的發(fā)生，達(dá)到防治的效果。目前Μβ CD應(yīng)用于病毒及BmNPV防治方面尚無專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提供一種化學(xué)藥物_Μβ CD的新用途，可應(yīng)用于防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞，另一目的是提供使用Mβ CD用于防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞的合適濃度。
[0007]技術(shù)方案:甲基-β -環(huán)糊精在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
[0008]防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞的藥物，有效成分為甲基_ β _環(huán)糊精。
[0009]具體防治方法為:
[0010]1.Μβ CD對攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治
[0011](I)用I XPBS溶解M β⑶，配制濃度為38mM的儲存液。
[0012](2)分別在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種約15個(gè)/皿的細(xì)胞，貼壁后，用配制好的Μβ⑶儲存液加入合細(xì)胞培養(yǎng)液貼壁細(xì)胞中，使終濃度分別為4mM-20mM，孵育10_120min，孵育細(xì)胞溫度為20-29°C，以ΟπιΜΜβ⑶(即等體積1XPBS)孵育液作為對照。
[0013](3)孵育后，分別去除IXPBS和不同濃度的Μβ⑶孵育液，用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞2次，分別用MOI = 10攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV病毒感染細(xì)胞，27°C感染Ih后，用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍，放置于27°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)6h。
[0014]2.防治效果的觀察與統(tǒng)計(jì)分析
[0015]6小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)皿放置于激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量及總細(xì)胞數(shù)，T測驗(yàn)分析不同濃度Mβ CD孵育細(xì)胞后，防治病毒入侵細(xì)胞的效率。
[0016]有益效果:提供一種以Μβ⑶為有效成分，防治BmNPV入侵細(xì)胞的藥物。該藥物在深入研究病毒入侵機(jī)制、桿狀病毒感染宿主的受體研究方面有重要意義。當(dāng)Μβ CD濃度在SmM以上時(shí)能完全抑制病毒感染。本發(fā)明在防治膿病的蠶用藥物研發(fā)及生產(chǎn)中，具有重要的應(yīng)用推廣價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV重組病毒BmBac-egfp示意圖:
[0018]BmBacJS13 是一株與 BmNPV 具有相同感染特性的 Bacmid[Huang JS etal.Construct1n of the Bac—to—Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22 (3):218-225]。為了便于觀察及統(tǒng)計(jì)本專利所述的防治效果，將hsp70操縱下的報(bào)告基因egfp轉(zhuǎn)座到BmBacJS13的Tn7轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)，命名BmBac-egfp，提取DNA，轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，收獲出芽病毒后，繼續(xù)用于感染家蠶細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光，70小時(shí)后收獲病毒,終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。
[0019]圖2是利用不同濃度Μβ⑶處理細(xì)胞后病毒感染細(xì)胞熒光圖:
[0020]細(xì)胞培養(yǎng)皿中預(yù)先接種約15家蠶細(xì)胞，分別用不同濃度Μβ⑶孵育細(xì)胞30min后，對照細(xì)胞加入相應(yīng)劑量I XPBS，用MOI = 10攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV病毒感染lh，用無血清TC100培養(yǎng)基洗三遍，27°C正常培養(yǎng)，感染后6小時(shí)候觀察細(xì)胞熒光。
[0021]圖3是不同濃度Μβ⑶處理后細(xì)胞感染病毒百分率比較圖:
[0022]細(xì)胞培養(yǎng)皿中預(yù)先接種約15BmN細(xì)胞，分別用3種不同濃度Μβ⑶處理30min后，對照細(xì)胞加入相應(yīng)劑量I X PBS，用MOI = 10攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV感染lh，用無血清TC100培養(yǎng)基洗兩遍，27°C正常培養(yǎng)，感染后6小時(shí)候觀察細(xì)胞熒光變化，計(jì)算細(xì)胞被感染百分率，臺酚藍(lán)細(xì)胞染色計(jì)算細(xì)胞存活率，圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
[0024]1.攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV的構(gòu)建
[0025]將hspTO-egfp 片段克隆至 pFastBacDual (Invitrogen)的 BamH I (Takara)和 NotI (Takara)位點(diǎn)，構(gòu)建供體質(zhì)粒pFastBacDual-hsp70_egfp,通過轉(zhuǎn)座獲得BmBac-egfp (示意圖見圖1)，將BmBac-egfp DNA轉(zhuǎn)染BmN(家蠶卵巢細(xì)胞)細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光表達(dá)。將其細(xì)胞上清用于感染BmN細(xì)胞，感染72小時(shí)后收獲病毒，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度，病毒4°C冰箱避光保存。
[0026] 2.細(xì)胞的接種及M β⑶(Sigma)的儲存液配制
[0027](I)分別在35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)中各接種約15BmN細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10% FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0028](2)27°C培養(yǎng)約12h_24h，待細(xì)胞貼壁后，用于以下實(shí)驗(yàn)。
[0029](3)M PCD(Sigma)的儲存液配制
[0030]用I X PBS配制濃度為38mM的M β CD儲存液。
[0031]3.當(dāng)Μβ⑶的終濃度為OmM，即對照組細(xì)胞，攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV對細(xì)胞感染效率
[0032](I)取各接種好15細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10% FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，分別加入210.4 μ LI XPBS與789.6 μ LlO % FBS的TC100培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)30min，移去合PBS的培養(yǎng)基，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗2遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min。
[0033](2)細(xì)胞沖洗完成后，去除沖洗液，加入MOI = 10的BmBac-egfp病毒，感染細(xì)胞27 0C Ih。
[0034](3) Ih后，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗兩遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min，去除沖洗液，加入 2mL10% FBS 的 TC100 培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng) 6h。
[0035](4)6h后，將3個(gè)皿放置于熒光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖2左上(對照組)，并統(tǒng)計(jì)帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量。[0036]實(shí)施例2
[0037]Mβ⑶的終濃度為4mM時(shí)，對攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治:
[0038](I)取各接種好15細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，移去舊的培養(yǎng)基，在3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入105.2 μ LMβ CD儲存溶液和894.8 μ LlO% FBS的TC100培養(yǎng)基，使培養(yǎng)皿中Μβ CD的終濃度為4mM，27°C培養(yǎng)30min，移去合有M β⑶的培養(yǎng)基，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗2遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min。
[0039](2)細(xì)胞沖洗完成后，去除沖洗液，加入MOI = 10的BmBac-egfp病毒，感染細(xì)胞27 0C Ih。
[0040](3) Ih后，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗兩遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min，去除沖洗液，加入 2mL10% FBS 的 TC100 培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng) 6h。
[0041](4) 6h后，將3個(gè)皿放置于熒光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(見圖2右上)，統(tǒng)計(jì)帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量，并運(yùn)用T測驗(yàn)和對照組細(xì)胞熒光做比較見圖3。結(jié)果顯示4πιΜΜβ⑶處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV的感染細(xì)胞比率僅為對照的69%。
[0042]實(shí)施例3
[0043]Mβ⑶的終濃度為6mM時(shí)，對攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治:
[0044](I)取各接種好15 細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，移去舊的培養(yǎng)基，在3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入157.8 μ L M β CD儲存溶液和842.2 μ LlO% FBS的TC100培養(yǎng)基，使培養(yǎng)皿中M β CD的終濃度為6mM，27°C培養(yǎng)30min，移去合有M β⑶的培養(yǎng)基，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗兩遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min。
[0045](2)細(xì)胞沖洗完成后，去除沖洗液，加入MOI = 10的BmBac-egfp病毒，感染細(xì)胞27 0C Ih。
[0046](3)感染Ih后，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗兩遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min，去除沖洗液，加入2mL10% FBS的TC100培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)6h。
[0047](4) 6h后，將3個(gè)皿放置于熒光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(見圖2左下)，并統(tǒng)計(jì)帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量，并運(yùn)用T測驗(yàn)和對照組細(xì)胞熒光做比較見圖3。結(jié)果顯示6mM Μβ⑶處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染的細(xì)胞效率僅為對照4.8%。
[0048]實(shí)施例4
[0049]Mβ⑶的終濃度為8mM時(shí)，對攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治:
[0050](I)取各接種好105細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，移去舊的培養(yǎng)基，在3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入210.4 μ LM β⑶儲存溶液與789.6 μ LlO % FBS的TC100培養(yǎng)基，使培養(yǎng)皿中M β CD的終濃度為8mM，27°C培養(yǎng)30min，移去合有M β⑶的培養(yǎng)基，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗兩遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min。
[0051](2)細(xì)胞沖洗完成后，去除沖洗液，加入MOI = 10的BmBac-egfp病毒，感染細(xì)胞27 0C Ih。
[0052](3) Ih后，用無血清的TC100培養(yǎng)基洗兩遍，輕輕晃動(dòng)，每次3min，去除沖洗液，加入 2mL10% FBS 的 TC100 培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng) 6h。
[0053](4) 6h后，將3個(gè)皿放置于熒光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(見圖2右下)，并統(tǒng)計(jì)帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量，運(yùn)用T測驗(yàn)和對照組細(xì)胞熒光做比較見圖
3。結(jié)果顯示8πιΜΜβ⑶處理細(xì)胞時(shí)，無熒光表達(dá)，表明BmNPV的感染完全被抑制了。[0054]最后應(yīng)當(dāng)說明的是:以上所述的實(shí)施例和實(shí)施方式所述的M β CD濃度和處理時(shí)間僅用于說明性目的而非限制，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在細(xì)胞狀態(tài)或者細(xì)胞培養(yǎng)基理化性質(zhì)比如酸堿度等等微小的差異，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍，并被包括在本申請的精神和范圍之 內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.甲基-β-環(huán)糊精在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
2.防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞的藥物，其特征在于有效成分為甲基-β-環(huán)糊精。
【文檔編號】A61P31/20GK104027347SQ201410226494
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】黃金山, 郝碧芳, 沈興家, 程晨, 梁飛 申請人:江蘇科技大學(xué)