miR-509-3p表達(dá)抑制劑在制備治療多囊卵巢綜合征藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了miR-509-3p表達(dá)抑制劑在制備治療多囊卵巢綜合征藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供含有miR-509-3p表達(dá)抑制劑的多囊卵巢綜合征的藥物。在顆粒細(xì)胞中抑制表達(dá)miR-509-3p后，前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1（PTGS1）的mRNA水平上調(diào)，前列腺素合成增加，卵巢中組織型纖維蛋白溶解酶原激活因子活性增加，從而促發(fā)排卵。表明miR-509-3p表達(dá)抑制劑可通過調(diào)控PTGS1基因的表達(dá)來影響前列腺素的合成和排卵，從而起到治療PCOS排卵異常的作用。
【專利說明】miR-509-3p表達(dá)抑制劑在制備治療多囊卵巢綜合征藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及miR-509-3p表達(dá)抑制劑在制備治療PCOS藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PC0S)是育齡婦女常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，主要特征是排卵障礙，其發(fā)病率占女性的6.6~8.0%。70余年來，一直是國(guó)內(nèi)外生殖內(nèi)分泌學(xué)者關(guān)注的疾病之一。2003年ESHRE/ASRM在荷蘭鹿特丹制定了 PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)排卵或稀發(fā)排卵；②高雄激素血癥的臨床和生化特征；③超聲檢查見卵巢多囊樣改變，并排除其他雄激素過多相關(guān)疾病，如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(CAH)、庫(kù)欣綜合征、高泌乳素血癥、嚴(yán)重的胰島素抵抗綜合征、分泌雄激素的腫瘤和(或)甲狀腺功能異常等。按照這一標(biāo)準(zhǔn)我們對(duì)山東省煙臺(tái)市育齡婦女進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)煙臺(tái)PCOS的發(fā)病率為7.2%, PCOS伴不孕的發(fā)生率為9.38%，且發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)。
[0003]miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用逐漸被揭示，成熟的miRNA通過與靶標(biāo)mRNA進(jìn)行完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，引起靶標(biāo)mRNA的降解或翻譯抑制，達(dá)到調(diào)控目的基因表達(dá)的作用，從而在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化及腫瘤的發(fā)生等過程中起重要作用。有關(guān)小鼠miRNA的研究表明，miRNAs的異常表達(dá)可能與卵子發(fā)育異常和受精失敗有關(guān)。Assou S.和Moussaddykine S.等對(duì)非PCOS患者M(jìn)II卵子和顆粒細(xì)胞miRNA研究的報(bào)道，認(rèn)為miR-30，miR-103和miR-16可能在卵子成熟中起作用，而且發(fā)現(xiàn)let_7miRNA家族成員僅在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，與血管生成有關(guān)，可作為b1marker預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局。最近的研究表明，PCOS患者卵泡液中miRNAs對(duì)其靶基因的調(diào)控與PCOS的致病相關(guān)。然而，目前尚未見關(guān)于PCOS患者顆粒細(xì)胞miRNAs的相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)分離了 PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中的差異miRNAs，其中miR-509-3p調(diào)控前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶(PTGSl)的表達(dá)，從而影響到PCOS患者的排卵過程，并提供miR-509-3p表達(dá)抑制劑在制備治療PCOS排卵藥物中的應(yīng)用。
[0005]其中，所述的所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑優(yōu)選為miR-509_3p反義單鏈寡核苷酸和 / 或 miR-509_3p-sponge。
[0006]本發(fā)明中，miR-509_3p的登錄號(hào)為 MIMAT0000459 (http: //www.miRbase.0rg)。
[0007]miR-509-3p反義單鏈寡核苷酸可人工合成或直接市售獲得；miR-509-3p海綿(miR-7-sponge)可根據(jù)小RNA sponge技術(shù)構(gòu)建。
[0008]進(jìn)一步的，所述的miR-509-3p反義單鏈寡核苷酸還可經(jīng)PNA、LNA或2_0me修飾。
[0009]在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑為Ant1-miR?miR-509_3p Inhibitor,購(gòu)自 Amb1n 公司。
[0010]本發(fā)明還提供含有miR-509_3p表達(dá)抑制劑的PCOS治療藥物。
[0011]其中，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑優(yōu)選為miR-509_3p反義單鏈寡核苷酸和/或 miR-509_3p-spongeo
[0012]進(jìn)一步的，所述的所述的miR-509_3p反義單鏈寡核苷酸還可經(jīng)PNA、LNA或2_0me修飾。
[0013]在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑為Ant1-miR?miR-509-3pInhibitor,購(gòu)自 Amb1n 公司。
[0014]采用基因芯片技術(shù)篩選PCOS患者和正常婦女卵巢顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，共篩選到差異表達(dá)的 miRNAsl7 個(gè)，包括 miR_1273e，miR-135b_5p，miR-152, miR-193a-3p, miR-194_5p, miR-196a_5p, miR-200b_3p，miR-423_3p, miR-454_3p, miR-455_5p, miR-4659a_3p, miR-509-3_5p，miR-509_3p，miR-513b, miR-652_5p, miR-95, miR-Hl。
[0015]通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-509_3p的靶基因?yàn)榍傲邢偎貎?nèi)過氧化物合成酶(PTGSl)，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證，PCOS組的熒光素酶活性均下降(P〈0.05)，說明miR-509-3p可以通過與 PTGSl的3' UTR區(qū)相互作用發(fā)揮功能。
[0016]比較PCOS患者及正常婦女卵巢顆粒細(xì)胞中PTGSlmRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)較正常婦女卵巢顆粒細(xì)胞中該基因的表達(dá)下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.95±0.04vs3.6±0.26，ρ〈0.01)。
[0017]通過電轉(zhuǎn)染的方法，分別轉(zhuǎn)染Pre-miR? miR-509_3pPrecursor、Ant1-miR?miR-509_3p Inhibitor、Pre-miR? miRNAPrecursors-Negative Control、Ant1-miR?miRNA Inhibitors-NegativeControl至PCOS患者的原代卵巢顆粒細(xì)胞中，結(jié)果Pre-miR?miR-509-3p Precursor能夠在原代顆粒細(xì)胞中有效過表達(dá)miR-509_3p, Ant1-miR?miR-7Inhibitor能夠在原代顆粒細(xì)胞中有效抑制表達(dá)miR-509_3p。
[0018]在原代顆粒細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-509-3p后，PTGSl的mRNA水平相應(yīng)下調(diào)或上調(diào)，前列腺素的合成相應(yīng)增強(qiáng)或減弱，說明在人的顆粒細(xì)胞中，miR-509-3p能夠直接抑制PTGSl的表達(dá)水平，并能夠抑制前列腺素的合成，而抑制表達(dá)miR-509-3p后能促進(jìn)PTGSl的表達(dá)水平，并能夠促進(jìn)前列腺素的合成。
[0019]PCOS患者miR-509_3p的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照，表明PCOS患者高表達(dá)miR-509-3p參與PCOS的發(fā)病。另一方面，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中PTGSl的表達(dá)低于健康對(duì)照，表明PCOS患者低表達(dá)PTGSl參與PCOS的發(fā)病。本發(fā)明證明PTGSl是miR-509-3p的靶基因，而PTGSl調(diào)控著前列腺素的合成，前列腺素與排卵過程相關(guān)，表明PCOS患者高表達(dá)miR-509-3p，抑制了前列腺素的合成，從而抑制排卵。因此，miR-509_3p表達(dá)抑制劑能夠通過糾正PCOS患者PTGSl的低表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺素的合成而起到治療PCOS排卵障礙的作用。通過將miR-509-3p表達(dá)抑制劑，如miR-509-3p反義單鏈核苷酸和/或miR-509-3p-sponge直接注射給患者,使miR-509_3p抑制劑與體內(nèi)miR-509_3p結(jié)合,而阻斷miR-509-3p對(duì)其靶基因的作用，進(jìn)而起到治療的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1PC0S患者及正常婦女顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)學(xué)差異。[0021]圖2PC0S患者及正常婦女顆粒細(xì)胞中miR-509_3p的差異表達(dá)。
[0022]圖3所示為PCOS患者及正常育齡婦女的卵巢顆粒細(xì)胞中靶基因PTGSlmRNA的表達(dá)。
[0023]圖 4 所示為轉(zhuǎn)染 Pre-miR? miR-509_3p Precursor、Pre-miR? miRNAPrecursors-Negative Control、Ant1-miR? miR-509-3pInhibitor、Ant1-mi R? mi RNAInhibitors-Negative Control 后，qRT-PCR 檢測(cè) miR-509_3p 的表達(dá)。
[0024]圖5所示為熒光定量PCR法(Taqman探針法)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中miR-509_3p的表達(dá)。
[0025]圖6所示為在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-509-3p后，PTGSl的mRNA水平的變化。
[0026]圖 7 所不為轉(zhuǎn)染 Pre-miR? miR-509_3p Precursor> Pre-miR? miRNAPrecursors-Negative Control、Ant1-miR? miR-509-3p Inhibitor、Ant1-miR? miRNAInhibitors-Negative Control后,顆粒細(xì)胞的前列腺素合成量的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0028]共采集20例PCOS患者，為煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2009~2011年門診初治患者，均符合2003年ESHRE/ASRM在荷蘭鹿特丹制定了 PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)排卵或稀發(fā)排卵；②高雄激素血癥的臨床和生化特征超聲檢查見卵巢多囊樣改變，并排除其他雄激素過多相關(guān)疾病，如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(CAH)、庫(kù)欣綜合征、高泌乳素血癥、嚴(yán)重的胰島素抵抗綜合征、分泌雄激素的腫瘤和(或)甲狀腺功能異常等。正常對(duì)照20例來自健康志愿者，年齡、性別與病例匹配，同時(shí)不得具備PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任何一條。
[0029]實(shí)施例1PC0S患者及正常育齡婦女的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)學(xué)差異
[0030]PCOS患者，尤其是伴有肥胖的PCOS患者的卵母細(xì)胞形態(tài)異常、卵母細(xì)胞的胞漿顆粒較粗、透明帶厚薄不均勻，導(dǎo)致受精率低，受精后胚胎卵裂球大小不均勻、碎片較多、卵裂速度慢或胚胎發(fā)育停滯，得不到優(yōu)質(zhì)胚胎，嚴(yán)重影響這部分患者的治療結(jié)局(圖1)。
[0031]實(shí)施例2PC0S患者及正常婦女顆粒細(xì)胞中miR-509_3p的差異表達(dá)。
[0032]用Trizol法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用實(shí)時(shí)定量PCR法擴(kuò)增測(cè)定miRNA表達(dá)。采用TaqMan探針法，試劑為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)商品化的引物及試劑盒(反轉(zhuǎn)試劑盒:名稱 FG, Taqman (r)microRNA RT Kit200rxns，貨號(hào) 4366596 ；PCR 試劑盒:名稱 TaqMan Gene
Express1n Master Mix,貨號(hào) 4369016 ;反轉(zhuǎn)引物及 PCR 引物:名稱 TaqManΛ MicroRNA
Assays50RT+150PCR，貨號(hào)貨號(hào) 4427975)。
[0033]收集初治PCOS患者和正常婦女各8例，檢測(cè)顆粒細(xì)胞中miR-509_3p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCOS患者miR-509-3p的表達(dá)顯著高于正常婦女，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(4.6±0.13vsl.0±0.03，ρ〈0.01)(圖 2)。
[0034]實(shí)施例3雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的miR-7的靶基因
[0035]通過Targetscan、PicTar及miRanda三個(gè)軟件對(duì)miR_7的祀基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)這些靶基因的生物學(xué)功能是否與激素合成及排卵機(jī)制相關(guān)，選取PTGSl作為miR-509-3p的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。[0036]克隆miR-509_3p預(yù)測(cè)的靶基因PTGSl的3’ -UTR序列，并在引物兩端加上酶切位點(diǎn) XbaI (5，-TCTAGA-3，)和 NotI (5，-GCGGCCGC-3’)。引物序列如下:
[0037]
【權(quán)利要求】
1.miR-509-3p表達(dá)抑制劑在制備治療PCOS藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑為miR-509-3p反義單鏈寡核苷酸和/或miR-509_3p海綿。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miR-509-3p反義單鏈寡核苷酸經(jīng)PNA、LNA 或 2-0me 修飾。
4.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑為Ant1-miR?miR-509-3p Inhibitor。
5.含有miR-509-3p表達(dá)抑制劑的PCOS治療藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑為miR-509-3p反義單鏈寡核苷酸和/或miR-509_3p海綿。
7.如權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述的miR-509-3p反義單鏈寡核苷酸經(jīng)PNA、LNA 或 2-0me 修飾。
8.如權(quán)利要求5或6所述的藥物，其特征在于，所述的miR-509-3p表達(dá)抑制劑為Ant1-miR?miR-509-3p Inhibitor。
【文檔編號(hào)】A61P15/08GK104027819SQ201410185452
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】黃鑫, 郝翠芳, 包洪初, 叢建香 申請(qǐng)人:煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院