使用遺傳修飾的乳桿菌通過抗原的粘膜遞送治療免疫疾病的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過經(jīng)由微生物特別是乳酸乳球菌粘膜遞送分泌的免疫顯性抗原來治療自身免疫和變應性疾病。
【專利說明】使用遺傳修飾的乳桿菌通過抗原的粘膜遞送治療免疫疾病
[0001]本申請是申請日為2008年I月25日、申請?zhí)枮?00880004735.4的同名申請的分
案申請。
[0002]本發(fā)明涉及通過經(jīng)由微生物特別是乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)粘膜遞送分泌的免疫顯性抗原來治療自身免疫和變應性疾病。
發(fā)明領域
[0003]免疫系統(tǒng)具有區(qū)別自身和非自身物質(zhì)的任務。沿著呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道存在的粘膜免疫系統(tǒng)具有與豐富的細菌和無害抗原例如食物、空氣播散的抗原或共生的細菌群落共存的另外的負荷。粘膜免疫系統(tǒng)的關鍵特征是它保留對這些抗原耐受的能力，同時保留有效擊退病原體的能力。無論通過注射還是損傷，全身性引入抗原導致炎性細胞的局部浸潤和特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生。相比之下，在粘膜表面例如胃腸道和泌尿生殖道處引入的抗原引發(fā)免疫應答對于那些抗原的全身性有效抑制。通過經(jīng)由胃腸道施用抗原特異性誘導這些被調(diào)節(jié)的應答稱為口服耐受性(oral tolerance)。抗原的經(jīng)口施用可以導致全身性無應答性，并且是具有不希望有的副作用(例如類固醇)的免疫抑制醫(yī)學發(fā)明的有吸引力的替代物。本發(fā)明 特別地屬于通過持續(xù)暴露于低劑量的抗原獲得的低劑量耐受性的領域。經(jīng)由粘膜的耐受性誘導已提議作為針對自身免疫、變應性和炎性疾病的治療策略。
[0004]技術(shù)發(fā)展水平
[0005]本發(fā)明背景的下述討論僅用于幫助讀者理解本發(fā)明，并非承認其描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0006]自身免疫、變應性和炎性疾病對患者和社會造成巨大負擔，導致降低的生活質(zhì)量和巨大成本。此外，不存在具有可接受的副作用或在全社會中合適的適當治療。關于自身免疫疾病的目前治療在很大程度上是姑息性的，一般是免疫抑制或抗炎性的。非免疫治療例如在橋本氏甲狀腺炎或DMl型中的激素替代產(chǎn)生自身攻擊性應答的結(jié)果。類固醇或NSAID治療限制了許多疾病的炎性癥狀。IVIG用于CIDP和GBS。更具體的免疫調(diào)節(jié)治療例如TNFa拮抗劑依那西普已顯示在治療RA中是有用的。然而，這些免疫治療可能與增加的不良反應風險相關，例如對感染增加的易感性?？梢员碚鳛槁孕∧c炎癥的乳糜瀉(celiacdisease)僅能夠通過限制的飲食進行有效治療，這要求終生禁食包含小麥、黑麥或大麥的食物。雖然嚴格不含谷蛋白的飲食可以導致小腸治愈，但對谷蛋白的不耐受性是永久的。
[0007]也稱為口炎性腹瀉(celiac sprue)或谷蛋白敏感性腸病的乳糜瀉是慢性炎性疾病，其由針對包含谷蛋白的特別飲食谷物的免疫應答發(fā)展?？梢曰诟篂a、脂糞、腹部氣脹和絞痛、重量減輕、代謝性骨疾病、貧血的常規(guī)表現(xiàn)以及對于麥醇溶蛋白和組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)具有特異性的血清抗體(也稱為抗肌內(nèi)膜)的存在進行診斷。粘膜損傷集中于小腸的近端部分，并且特征在于絨毛萎縮、隱窩細胞增生、以及上皮和固有層的淋巴細胞性浸潤，其響應麥醇溶蛋白釋放促炎細胞因子例如IL-2和IFN-Y。乳糜瀉可以視為人中最常見的食物敏感性腸病，并且可以在個人生命中的任何時候出現(xiàn)。其流行率在西方、阿拉伯和印度人口中為1:100至1:300。除谷蛋白外，該疾病還可以在手術(shù)、病毒感染、嚴重情緒應激、妊娠或分娩后首次觸發(fā)。
[0008]因此，抗原特異性口服耐受性的誘導將是有吸引力的治療方法。盡管口服耐受性在1911年首次描述，但直到20世紀70年代末期研究者才開始致力于所涉及的機制(Mayer和Shao，2004a)。對于口服耐受性的發(fā)展已提出幾個機制，從抗特異性T細胞的缺失、超過免疫偏離和無反應性的誘導到經(jīng)由Treg的抑制(Mucida等人，2005)。大多數(shù)研究者認為，存在獲得口服耐受性的2種不同途徑，在單次高劑量抗原后獲得的高劑量耐受性，其基于無反應性和/或缺失(Friedman和Weiner, 1994),和通過反復暴露于低劑量抗原獲得的低劑量耐受性，其通過經(jīng)由CD4+T細胞的免疫應答的有效抑制介導，所述CD4+T細胞包括Foxp3+、IL-10和/或TGF-β產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細胞。重要的是，通過粘膜耐受誘導的調(diào)節(jié)T細胞已顯示介導旁觀者抑制(bystander suppression),即通過其對于一種蛋白質(zhì)特異的調(diào)節(jié)細胞抑制附近效應細胞對另一種蛋白質(zhì)的應答的過程。旁觀者抑制是抗原誘導的抑制的另一個重要特征，因為誘導器官特異性自身免疫的抗原庫大部分是未知的，并且它廢除了表位擴展(epitope spreading)現(xiàn)象。表位擴展是自身免疫和變應性疾病的并發(fā)癥,通過其起始免疫應答隨著時間擴展，以誘導對于其他抗原的應答。
[0009]用于治療和預防應用的分子的靶向和更有效遞送是醫(yī)藥工業(yè)所優(yōu)先考慮的。有效的策略應通過使分子集中于所需作用位點來減少所需劑量、增加安全性和改善功效。與注射比較，藥物和疫苗遞送的粘膜途徑提供許多后勤和生物學優(yōu)點。由于易于施用，經(jīng)口遞送是特別有吸引力的。然而，胃腸道降解和低水平的吸收一般使得這個途徑對于肽和蛋白質(zhì)藥物遞送無效?？蛇x的粘膜途徑例如鼻、直腸、肺和眼途徑也正進行研究。
[0010]因此，在本領域中 存在有效誘導抗原耐受性的問題。
[0011]發(fā)明概述
[0012]令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)在患者的粘膜位點處遞送且優(yōu)選持續(xù)存在的免疫顯性抗原誘導抗原特異性免疫耐受性。特別地，當微生物例如優(yōu)選地乳酸乳球菌(LL)(其持續(xù)表達和分泌免疫顯性抗原)在粘膜位點處每日遞送時，誘導抗原特異性免疫耐受性。觀察到與所述抗原或所述微生物的單獨粘膜遞送相比，此種抗原經(jīng)由乳酸乳球菌微生物的粘膜遞送產(chǎn)生明顯更好的抗原特異性免疫應答抑制。
[0013]我們證實本發(fā)明可以以比用單獨的抗原或?qū)φ杖樗崛榍蚓膯我化煼ǜ叩枚嗟墓πдT導口服耐受性。抗原特異性調(diào)節(jié)T細胞的體內(nèi)激活得到顯著增強。特別地，麥醇溶蛋白衍生肽的粘膜遞送誘導局部和全身性DQ8限制性T細胞應答的抑制，所述麥醇溶蛋白衍生肽對于由遺傳修飾的乳酸乳球菌產(chǎn)生的DQ8介導的T細胞應答是免疫顯性的。處理導致脾細胞和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖能力的抗原特異性減少，這決定性地依賴于IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，且與Foxp3+調(diào)節(jié)T細胞的顯著誘導相關。因為這種抗原遞送細菌方法具有甚至在確定的超敏性的背景中使得口服耐受性成為可能的能力，所以它可用于治療乳糜瀉和其他自身免疫和/或變應性疾病。本發(fā)明的功效在自身免疫或變應性疾病小鼠模型中，以及在治療的免疫滅活的背景中得到證實。
[0014]發(fā)明詳述
[0015]在本公開內(nèi)容中，各種出版物、專利和公開的專利說明書通過明確引用作為參考。這些出版物、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容通過引用在此并入本公開容內(nèi)，以更充分地描述本發(fā)明所屬領域的技術(shù)發(fā)展水平。[0016]一般技術(shù)
[0017]除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用有機化學、藥理學、分子生物學(包括重組技術(shù))、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術(shù)，所述常規(guī)技術(shù)在本領域技術(shù)人員的能力內(nèi)。此種技術(shù)在文獻中得到充分說明，例如〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual"第 2 版(Sambrook 等人，1989) /'Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait,編輯，1984)；"Animal Cell Culture" (R.1.Freshney,編輯，1987) ,Methods in Enzymology^ 系列(Academic Press, Inc.) ;"Handbook of Experimental Immunology" (D.M.Weir &C.C.Blackwell,編輯);〃Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells〃 (J.M.Miller&M.P.Calos,編輯，1987);"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel 等人，編輯，1987 和期刊);"Polymerase Chain Reaction" (Mullis 等人，編輯，1994);和"CurrentProtocols in Immunology" (J.E.Coligan 等人，編輯，1991)。
[0018]定義
[0019]如本文所使用的，某些術(shù)語可以具有下述定義的含義。如說明書和權(quán)利要求中所使用的，除非上下文明確地另有說明，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復數(shù)提及物。例如，術(shù)語“細胞”包括多個細胞，包括其混合物。類似地，除非上下文明確地另有說明，“化合物”用于如本文所描述的治療或藥劑制備的用途涉及使用本發(fā)明的一種或多種化合物用于此種治療和制備。[0020]如本文所使用的，術(shù)語“包含”意指組合物和方法包括所述元件，但不排除其他元件。“基本上由……組成”當用于限定組合物和方法時，意欲排除對于組合具有任何基本重要性的其他元件。因此，基本上由如本文限定的元件組成的組合物將不排除來自分離和純
化方法的痕量污染物和藥學上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等?！坝?.....組
成”意欲排除超過痕量的其他成分和用于施用本發(fā)明組合物的其他基本方法步驟。由這些過渡術(shù)語各自限定的實施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0021]發(fā)里
[0022]我們證實由微生物例如優(yōu)選地乳酸乳球菌分泌的免疫顯性抗原的粘膜遞送誘導局部和全身性T細胞應答的抑制。處理導致脾細胞和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖能力的抗原特異性減少，這決定性地依賴于IL-1O和TGF- β的產(chǎn)生，且與Foxp3+調(diào)節(jié)T細胞的顯著誘導相關。這種抗原遞送細菌方法具有甚至在確定的超敏性的背景中使得口服耐受性成為可能的能力。因此它可用于治療乳糜瀉和其他自身免疫和/或變應性疾病。本發(fā)明的功效在自身免疫和變應性疾病小鼠模型中，以及在治療的免疫滅活的背景中得到證實。
[0023]本發(fā)明的第一個方面是用于誘導對抗原的免疫耐受性的方法，其包括所述抗原經(jīng)由微生物的粘膜遞送。
[0024]優(yōu)選地本發(fā)明涉及分泌抗原的微生物、優(yōu)選地非病原性微生物、更優(yōu)選地乳酸細菌或酵母、更加優(yōu)選地乳酸乳球菌用于制備用于粘膜遞送以治療患者中的免疫應答相關疾病的藥劑、醫(yī)學食物或營養(yǎng)食品的用途，其中所述抗原優(yōu)選持續(xù)存在于所述患者中。
[0025]優(yōu)選地，所述抗原由抗原表達微生物遞送。優(yōu)選地所述抗原由抗原分泌或抗原展示微生物或細胞內(nèi)抗原遞送。因此，本發(fā)明包含了這樣的實施方案，其中所述抗原展示在所述抗原表達微生物的表面上，或其中所述抗原被分泌，或所述抗原在消化后是游離的。
[0026]優(yōu)選地，本發(fā)明涉及抗原表達微生物用于制備用于粘膜遞送以誘導免疫耐受性的藥劑的用途。
[0027]優(yōu)選地,所述免疫耐受性在患者中被誘導。所述患者優(yōu)選是動物。所述動物優(yōu)選是哺乳動物，且優(yōu)選選自小鼠、大鼠、豬、牛、綿羊、馬和人。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。優(yōu)選地，所述免疫耐受性是粘膜耐受性。
[0028]靈
[0029]如本文所使用的，粘膜可以是任何粘膜，例如口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、頰粘膜、肺粘膜和鼻粘膜。如本申請自始至終所使用的，粘膜遞送包含至粘膜的遞送?？谇徽衬みf送包括頰、舌下和齒齦遞送途徑。因此，本發(fā)明涉及其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送的方法。優(yōu)選地，所述粘膜遞送是經(jīng)口遞送，所述耐受性是口服耐受性。
[0030]如本申請自始至終所使用的，粘膜耐受性是動物(包括人)中對抗原的特異免疫應答性(immune responsiveness)的抑制,在所述動物已經(jīng)由粘膜途徑暴露于所述抗原后。優(yōu)選地，所述粘膜耐受性是全身耐受性?？乖暮罄m(xù)暴露可以是本領域技術(shù)人員已知的每一種暴露，例如經(jīng)由腸胃外注射、通過粘膜遞送、或例如在自身抗原的情況下通過內(nèi)源生產(chǎn)暴露?？诜褪苄允莿游?包括人)中對抗原的特異免疫應答性的抑制，在所述動物已經(jīng)由經(jīng)口途徑暴露于所述抗原后。低劑量口服耐受性是通過低劑量抗原誘導的口服耐受性，并且特征在于由環(huán)磷酰胺敏感性調(diào)節(jié)T細胞介導的有效免疫抑制，所述調(diào)節(jié)T細胞可以將耐受性轉(zhuǎn)移給首次用于實驗的宿主。高劑量口服耐受性是由高劑量的抗原誘導的口服耐受性，對環(huán)磷酰胺處理不敏感，并且經(jīng) 由無反應性和/或抗原特異性T細胞的缺失進行至T細胞低反應性的誘導。對環(huán)磷酰胺的敏感性的差異可以用于區(qū)別低劑量和高劑量耐受性(Strobel等人，1983)。優(yōu)選地,所述口服耐受性是低劑量口服耐受性,如由Mayer和Shao(2004b)描述的。
[0031]本發(fā)明因此涉及如本文所描述的方法或用途，其中相對于所述誘導之前，所述免疫耐受性的誘導是至少1.5、優(yōu)選2、更優(yōu)選3倍或更多?？蛇x地，相對于所述誘導之前，耐受所述抗原至少1.5、2、3倍或更多。免疫耐受性的誘導可以通過本領域已知的方法進行測量。優(yōu)選地，所述免疫耐受性的誘導可以通過所述動物中細胞因子水平的調(diào)節(jié)來測量。像這樣，調(diào)節(jié)可以是細胞因子水平的增加，例如相對于所述誘導之前，所述細胞因子水平的增加是至少1.5、2、3倍或更多，例如IL-1O或TGF-β。可選地，所述調(diào)節(jié)是特定細胞因子水平的減少，例如相對于所述誘導之前，所述細胞因子水平的減少是至少1.5、2、3倍或更多，例如IL-12、IL-17和IFN-Y。被調(diào)節(jié)的細胞因子可以選自任何相關細胞因子，優(yōu)選地所述細胞因子選自 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF- a、IFN- Y、IFN-a、MCP-1、TGF-β ,RANK-L 和 Flt3L。
[0032]構(gòu)律體、遞送和糖合
[0033]在本發(fā)明中，微生物在預期位點即粘膜處遞送抗原。微生物表達所述抗原，這之后抗原暴露于細胞表面或被分泌。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，微生物例如乳酸乳球菌包含表達載體，所述載體能夠細胞內(nèi)地或分泌地表達異源抗原例如用于誘導免疫耐受性的抗原和/或使得異源抗原在于預期粘膜處(例如在胃腸道中)存在的條件下暴露在細胞表面上。微生物例如乳酸乳球菌可以包含能夠細胞內(nèi)地或分泌地表達異源抗原和/或使得異源抗原暴露在細胞表面上至足以誘導免疫耐受性的程度的表達載體。設想盡可能高程度表達而不損害待處理的細胞或宿主的活力。更高的表達，更少的頻率和更低的劑量可能是耐受性目的所需的。無疑地給藥方案將不僅依賴于抗原量，還依賴于抗原類型和組合物中其他免疫原性刺激或抑制因子的存在或不存在。
[0034]通常，表達系統(tǒng)將包含基因構(gòu)建體，其包含編碼所需抗原的至少一種核苷酸序列，優(yōu)選所述序列與能夠指導序列在宿主微生物中的表達的啟動子可操作地連接。適當?shù)卮磉_的抗原可以由核酸序列編碼，所述核酸序列適合于宿主的優(yōu)選密碼子使用。構(gòu)建體可以進一步包含在所選擇的宿主中可操作的(所有)其他合適的元件，包括增強子、轉(zhuǎn)錄起始序列、信號序列、報道基因、轉(zhuǎn)錄終止序列等，如本領域技術(shù)人員已知的。構(gòu)建體優(yōu)選為適合于轉(zhuǎn)化宿主的形式和/或為可以在宿主中穩(wěn)定維持的形式，例如載體、質(zhì)?；蛭⑿腿旧w?？梢赃x擇或構(gòu)建包含用于引入微生物例如細菌內(nèi)的核酸的合適載體，適當時，其包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子片段、增強子序列、標記基因和其他序列。適當時，載體可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體或噬菌粒。關于進一步的細節(jié)，參見例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989, Cold SpringHarbor Laboratory Press。用于核酸操作，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測序、DNA引入細胞內(nèi)和基因表達、以及用于蛋白質(zhì)的分析的許多已知技術(shù)和方案在Short Protocolsin Molecular Biology,第 2 版，Ausubel 等人編輯，John ffiley&Sons, 1992 中詳細描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公開內(nèi)容通過引用并入本文。在一個優(yōu)選實施方案中，生物活性多肽和抗原的編碼序列包含在操縱子中，即用于多順反子表達的核酸構(gòu)建體中。在操縱子中，從啟動子的轉(zhuǎn)錄導致包含超過一種編碼序列的mRNA，所述編碼序列各自具有適當?shù)囟ㄎ坏暮颂求w結(jié)合位點上游。因此，超過一種多肽可以由單個mRNA翻譯。操縱子的使用使得能夠協(xié)調(diào)表達生物活性多肽和抗原。更優(yōu)選地，使用食物級別構(gòu)建體。
[0035]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的微生物，即其中編碼抗原的基因已整合到宿主的基因組內(nèi)的微生物。用于建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的微生物的技術(shù)是本領域已知的。例如，目的基因可以經(jīng)由同源重組克隆到宿主的基因組內(nèi)。優(yōu)選地，宿主的必需基因由同源重組事件破壞，例如基因缺失、導致由必需基因編碼的蛋白質(zhì)的滅活形式的一個或多個氨基酸置換、或?qū)е掠杀匦杌蚓幋a的蛋白質(zhì)的截短形式的移碼突變。在一個實施方案中，必需基因是thyA基因。優(yōu)選技術(shù)在W002/090551中描述，所述專利明確以其整體并入本文。轉(zhuǎn)化質(zhì)?？梢允侨魏钨|(zhì)粒，只要它不能補足破壞的必需基因，例如thyA基因。質(zhì)?？梢允亲晕覐椭菩唾|(zhì)粒，優(yōu)選攜帶一種或多種目的基因和一種或多種抗性標記，或者質(zhì)粒是整合質(zhì)粒。在后一種情況下，通過在必需基因的基因座例如thyA位點處引起整合，整合質(zhì)粒其自身可以用于破壞必需基因，由此必需基因例如thyA基因的功能被破壞。優(yōu)選地，必需基因例如thyA基因由盒經(jīng)由雙重同源重組替代，所述盒包含側(cè)翼于靶向序列的一種或多種目的基因，所述靶向序列使插入物靶向必需基因，例如thyA靶位點。應當理解這些靶向序列足夠長且足夠同源，以使得目的基因能夠整合到靶位點內(nèi)。
[0036] 編碼本發(fā)明抗原的基因構(gòu)建體因此可以染色體外地存在于宿主細胞內(nèi)，優(yōu)選其使用自身的復制起點自主復制，或者可以整合到微生物基因組DNA內(nèi)，例如細菌或酵母染色體，例如乳球菌屬(Lactococcus)染色體。在后一種情況下,可以整合所述核酸的單個或多個拷貝；整合可以在染色體的隨機位點處發(fā)生，或如上所述在其預定位點處發(fā)生，優(yōu)選在預定位點處發(fā)生，例如在一個優(yōu)選的非限制性例子中，在乳球菌例如乳酸乳球菌的thyA基因座中發(fā)生。
[0037]因此，在一個實施方案中，編碼本發(fā)明抗原的基因構(gòu)建體可以進一步包含經(jīng)設計以將所述基因構(gòu)建體有效插入宿主細胞的基因組例如染色體內(nèi)的序列。
[0038]在一個例子中，基因構(gòu)建體插入宿主細胞的基因組例如染色體內(nèi)的特定位點處可以通過同源重組得到促進。例如，本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以包含對于宿主細胞的基因組例如染色體內(nèi)的所述整合位點同源的一個或多個區(qū)域。在所述基因組例如染色體位點處的序列可以是天然的，即如天然存在的，或可以是通過先前的基因工程引入的外源序列。
[0039]例如，所述一個或多個同源性區(qū)域可以是至少50bp，優(yōu)選至少lOObp，例如至少200bp,更優(yōu)選至少300bp,例如至少400bp,更加優(yōu)選至少500bp,例如至少600bp或至少700bp,更加優(yōu)選至少800bp,例如至少900bp,或至少1000bp或更多。
[0040]在一個優(yōu)選例子中，可以包括2個同源性區(qū)域，一個側(cè)翼于本發(fā)明的基因構(gòu)建體中存在的相關表達單位的一側(cè)。此種配置可以使相關序列有利地插入宿主細胞內(nèi)，所述相關序列例如至少編碼且實現(xiàn)目的抗原表達的序列。執(zhí)行同源重組(特別是在細菌宿主中)和選擇重組體的方法是本領域一般已知的。
[0041]微生物的轉(zhuǎn)化方法是本領域技術(shù)人員已知的，例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔。
[0042]高程度的表達可以通過使用在微生物例如乳酸乳球菌中存在的表達載體上的同源表達和/或分泌信號來達到。合適的表達調(diào)節(jié)信號如實施例中的構(gòu)建體中存在的那些是有用的。其他表達信號對于本領域技術(shù)人員將是顯而易見的。表達載體可以對于表達進行優(yōu)化，依 賴于它摻入其中的微生物，例如乳酸乳球菌。例如，在乳球菌屬、乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)中給出足夠表達水平的特定表達載體是已知的。此外，已開發(fā)用于在非病原性、非定殖性(non-colonising)、非侵襲性食物級別細菌乳酸乳球菌中表達異源抗原的系統(tǒng)是已知的(參見通過引用并入本文的英國專利GB2278358B)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的構(gòu)建體包含PCT/NL95/00135 (W0-A-96/32487)中描述的多拷貝表達載體，其中已摻入編碼抗原的核苷酸序列。此種構(gòu)建體特別適合于在乳酸細菌特別是乳桿菌屬(Lactobacillus)中以高表達水平表達所需抗原，并且也可以有利地用于將所表達產(chǎn)物導向細菌細胞的表面。構(gòu)建體(例如PCT/NL95/00135的構(gòu)建體)的特征可以在于編碼抗原的核酸序列在5’非翻譯核酸序列后，所述5’非翻譯核酸序列包含至少核糖體識別和RNA穩(wěn)定所需的最低限度序列。這可以隨后為翻譯起始密碼子，其可以(緊)隨后為乳酸細菌基因的翻譯核酸序列的5’末端部分的至少5個密碼子的片段，或者該片段的結(jié)構(gòu)或功能等價物。該片段還可以由啟動子控制。PCT/NL95/00135的內(nèi)容包括其中公開的不同實施方案，以及該說明書中提及的所有其他文件，通過引用并入本文。本發(fā)明的一個方面提供了允許異源基因在宿主中高水平調(diào)節(jié)的表達以及表達與分泌偶聯(lián)的方法。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)W093/17117，T7噬菌體RNA聚合酶及其相關啟動子用于開發(fā)有力的表達系統(tǒng)，所述專利通過引用并入本文。優(yōu)選地表達質(zhì)粒衍生自PT1NX。
[0043]依照本發(fā)明采用的啟動子優(yōu)選地在細菌中組成型表達。本發(fā)明人觀察到與誘導型表達比較，抗原的組成型表達導致增加的免疫耐受性。此外，組成型啟動子的使用避免了提供誘導物或其他調(diào)節(jié)信號以用于表達發(fā)生的需要。優(yōu)選地，啟動子以在其下細菌宿主細胞保持存活(即保留某些代謝活性，即使生長未得到維持)的水平指導表達。有利地，此種表達可以處于低水平。例如，當表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累時，表達水平可以導致表達產(chǎn)物以小于約10%的細胞蛋白質(zhì)積累，優(yōu)選約或小于約5%，例如約1-3%。啟動子對于所采用的細菌可以是同源的，即天然在那種細菌中發(fā)現(xiàn)的啟動子。例如，乳球菌屬啟動子可以在乳球菌屬中使用。用于乳酸乳球菌(或其他乳球菌屬物種)中的優(yōu)選啟動子是衍生自乳酸乳球菌的染色體的 “PI” (ffaterf ield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W,等人(1995).The isolationof lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferasesynthesis in Lactococcus lactis.Genel65 (I),9-15)。另一種優(yōu)選啟動子是 usp45 啟動子。
[0044]—種或多種核酸構(gòu)建體可以包含分泌信號序列。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，編碼抗原的核酸可以提供所述抗原的分泌(通過使編碼信號序列的核酸序列與編碼抗原的核酸序列適當?shù)嘏悸?lián))。細菌容納核酸以分泌抗原的能力可以在體外在培養(yǎng)條件下進行測試，所述培養(yǎng)條件維持生物的活力。優(yōu)選的分泌信號序列包括在革蘭氏陽性微生物例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)和乳桿菌屬(Lactobacillus)中具有活性的那些。此種序列可以包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquetaciens)的α -淀粉酶分泌前導區(qū)，或由某些葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株分泌的葡激酶的分泌前導區(qū)，其已知在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性宿主中起作用(參見〃Gene Expression Using Bacillus",Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnologyl:21-27),或來自眾多其他芽抱桿菌屬酶或S-層蛋白質(zhì)的前導序列(參見Harwood和Cutting, "Molecular BiologicalMethods for Bacillus〃的第 341-344 頁,John Wiley & C0.1990)。優(yōu)選地，所述分泌信號衍生自 usp45 (Van Asseldonk 等人 1993Mol.Gen.Genet.240:428_434)。優(yōu)選地，所述抗原組成型分泌。
[0045]在可選實施方案中，生物活性多肽和抗原的編碼序列是同一核酸載體或分開的載體的部分，并且獨立地處于分開的啟動子的調(diào)節(jié)控制下。啟動子可以是相同或不同的。包含生物活性多肽的編碼序列和抗原的編碼序列的核酸構(gòu)建體或載體由本發(fā)明的進一步方面提供，其中每種編碼序列處于啟動子的控制下用于在非侵襲性宿主例如乳球菌中表達，無論其是否作為操縱子。
[0046]技原
[0047]編碼抗原的序列可以得自任何天然來源和/或可以使用眾所周知的DNA合成技術(shù)進行合成制備。編碼抗原的序列隨后可以(例如)摻入合適的表達載體內(nèi)，以提供本發(fā)明的基因構(gòu)建體，其隨后用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染預期宿主。因此獲得的重組體隨后可以進行培養(yǎng)，這之后收獲的細胞可以用于配制組合物，任選地在進一步的純化和/或加工步驟后，例如冷凍干燥以形成粉末。
[0048]抗原可以是本領域技術(shù)人員已知的任何抗原。如本申請自始至終所使用的，抗原優(yōu)選是當引入動物體內(nèi)時激發(fā)免疫應答的任何物質(zhì)，其中所述免疫應答可以是T細胞介導的和/或B細胞介導的應答?？乖梢园琓細胞表位和/或B細胞表位。抗原的長度無具體限制，條件是所述抗原可以在本發(fā)明的微生物中表達。抗原可以是蛋白質(zhì)或其部分，例如多肽或肽。根據(jù)本發(fā)明的抗原包括線性和/或構(gòu)象表位。T細胞介導的應答包括Thl、Th2和/或Thl7應答?？乖梢允侨魏慰乖?，例如但不限于變應原(包括食物變應原)、同種異體抗原、自體抗原、自身抗原、和誘導免疫應答的治療分子或抗原。優(yōu)選地，所述抗原涉及與疾病相關的免疫應答的誘導。更加優(yōu)選地，所述抗原涉及變應性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、食物過敏、乳糜瀉或移植物抗宿主病的誘導。
[0049]本發(fā)明人觀察到本發(fā)明的分泌的免疫顯性抗原抑制全身性炎性T細胞應答，并且這些抗原對于誘導顯著致耐受性效應是必需和足夠的。
[0050]調(diào)節(jié)T細胞(Treg)在口服耐受性的誘導和維持中起關鍵作用。Treg的誘導是幾種自身免疫疾病、變應性疾病和炎性疾病的免疫治療的主要目標。抗原特異性抑制細胞的治療誘導的目前策略面臨重大障礙，并且通常要求分離、處理和轉(zhuǎn)移足夠數(shù)目的調(diào)節(jié)細胞的嚴格技術(shù)。微生物例如乳酸乳球菌——本發(fā)明的抗原遞送系統(tǒng)避免了這些問題，且有效誘導抗原特異性Treg。在本發(fā)明中，證實Treg的誘導可以通過使粘膜免疫系統(tǒng)暴露于低劑量抗原來達到。暴露于低劑量抗原優(yōu)選是持續(xù)暴露。因此，本發(fā)明涉及誘導和/或擴展Treg細胞，優(yōu)選地⑶4+CD25+、^4+^25—和⑶8+Treg細胞的抗原。
[0051]在本發(fā)明中進一步證實，通過根據(jù)本發(fā)明的抗原誘導和/或擴展的Treg細胞通過TGF-β和/或IL-10依賴機制起作用。先前已提供TGF-β在口服耐受性中以及在外周誘導Treg的發(fā)展中起關鍵作用的證據(jù)。因此，本發(fā)明提供了刺激內(nèi)源TGF-β和/或IL-10表達的免疫顯性抗原。
[0052]此外，顯示抗原特異性TGF-β產(chǎn)生Th3細胞驅(qū)動抗原特異性Foxp3+調(diào)節(jié)細胞在外周中的分化。此外，外周⑶4+⑶25—T細胞的TGF- β依賴性轉(zhuǎn)變成⑶25+、⑶45RB-/lOT抑制細胞已得到報道。顯示由CTB綴合的Ag誘導的口服耐受性通過產(chǎn)生Foxp3+⑶25+以及Foxp3+和Foxp3_CD25_CD4+調(diào)節(jié)T細胞與TGF- β的增加相關。這些數(shù)據(jù)暗示Foxp3+‘適應性’Treg在口服耐受性的誘導和維持中的關鍵作用。還顯示顯著的粘膜Foxp3誘導。此外，‘粘膜’誘導的調(diào)節(jié)T細胞趨向于抗原特異性，因為單獨的乳酸乳球菌無法在GALT內(nèi)誘導這種Foxp3上調(diào)。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及Foxp3+Treg細胞。
[0053]本發(fā)明進一步證實通過根據(jù)本發(fā)明的抗原誘導和/或擴展的Treg細胞減少炎癥，特別是在脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞中。此外，IFN-Y和IL-12產(chǎn)生減少。因此，本發(fā)明提供了減少內(nèi)源IFN-Y和/或IL-12產(chǎn)生、和/或刺激內(nèi)源TGF-β和/或IL-10表達的免疫顯性抗原。此外，本發(fā)明涉及減少脾和/或腹股溝淋巴結(jié)細胞增殖的抗原。應當理解本發(fā)明還涉及抑制炎性抗原特異性T細胞應答的抗原。
[0054]應當理解某些HLA-DQ同種型通常與某些自身免疫疾病更相關。例如，定義乳糜瀉的慢性小腸炎癥的特征在于對攝入的谷蛋白肽的耐受性的喪失，并且與HLA-DQ2或HLA-DQ8限制性T細胞應答強相關。HLA-DQ2或HLA-DQ8的表達是乳糜瀉表達所必需的，并且在西方人口中賦予高達40 %的遺傳風險。在乳糜瀉發(fā)病機理中的最重要方面之一是T輔助I免疫應答的激活，這在表達HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈遞細胞將谷蛋白肽呈遞給⑶4+T細胞時發(fā)生。
[0055]DQ8因為其不僅與乳糜瀉還與青少年糖尿病的強關聯(lián)而突出。它還與牽涉RA的HLA-DR等位基因連接，且可能增加風險。HLA-DQ并非均勻地散布，并且某些群體處于增加的風險中；然而，這種風險通常依賴環(huán)境(谷蛋白消費)，并且某些疾病增加的流行率可以是個體從低風險環(huán)境轉(zhuǎn)移到更高風險環(huán)境的結(jié)果。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的HLA DQ8是DQAl:DQB1單元型的血清型表示(serotypicrepresentation)。DQ8 代表單元型 DQA1*0301:DQB1*0302、DQA1*0302:DQB1*0302 或DQA1*0303:DQB1*0302單元型。這些單元型與已知的最常見自身免疫疾病中的某些相關。DQA1*0301:DQB1*0302是這3種單元型中最頻繁的，并且表示約80%的總體DQ8。本發(fā)明因此涉及經(jīng)由 DQA1*0301:DQB1*0302、DQA1*0302:DQB1*0302 和 / 或 DQA1*0303:DQB1*0302單元型識別的抗原，稱為“DQ8表位”。
[0057]HLA-DQ2在超過90%的具有乳糜瀉的人中表達。HLA DR3-DQ2是HLA-DRBl =DQAl:DQBl單元型的血清型表示。DR3-DQ2主要表示DRB1*0301:DQA1*0501:DQB1*0201單元型。它在西半球中相對豐富。DQ2由與其他α等位基因組合的DQB1*02等位基因編碼。2個最常見的DQ2 0鏈是非常相似的。本發(fā)明因此涉及經(jīng)由DQB1*0201、DQB1*0202和/或DQB1*0203單元型識別的抗原，稱為“DQ2表位 ”。
[0058]本發(fā)明優(yōu)選涉及衍生自糖蛋白的抗原。優(yōu)選地所述抗原衍生自麥醇溶蛋白，優(yōu)選α-麥醇溶蛋白和/或大麥醇溶蛋白?？梢栽俜殖搔?、Υ-和ω-麥醇溶蛋白的麥醇溶蛋白和大麥醇溶蛋白是本領域眾所周知的，并且它們的序列可經(jīng)由公眾域文庫例如NCBI容易地檢索。優(yōu)選地，所述α -麥醇溶蛋白衍生自小麥屬(Triticum)，例如小麥(T.aestivum)或圓錐小麥(T.turgidum)。
[0059]本發(fā)明證實⑶4+T細胞在DQ2或DQ8背景中識別天然谷蛋白肽。
[0060]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及DQ8表位:
[0061 ] QYPSGQGSFQPSQQNPQA,對應于可經(jīng)由 UniProtKB/TrEMBL 條目 Q9M4L6 檢索的序列的殘基 203-220 (SEQ ID NO:4)。
[0062]所述天然的DQ8表位優(yōu)選由核苷酸序列5’-caa tac cca tea ggt caa ggt teattc caa cca tea caa caa aac cca caa gct-3' (SEQ ID NO:3)編石馬。
[0063]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及DQ2表位:
[0064]LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF,對應于可經(jīng)由 UniProtKB/TrEMBL 條目Q9M4L6檢索的序列的殘基57-89 (SEQ ID NO:8)
[0065]所述DQ2表位優(yōu)選由下述核苷酸序列編碼:
[0066]5' -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca caa tta cca tae cca tta cca taecca caa cca caa tta cca tae cca caa cca caa cca ttc(SEQ ID NO:7)
[0067]抗原通常通過例如內(nèi)源組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在腸中脫去酰胺基。脫去酰胺基的抗原比未脫去酰胺基的抗原更具有免疫活性且容易識別。內(nèi)源組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在在抗原由其他方式脫去酰胺基的情況下不重要。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由核苷酸序列編碼的脫去酰胺基的抗原，其中表位中的谷氨酰胺殘基的密碼子優(yōu)選由谷氨酸殘基的密碼子替換。
[0068]特別地，本發(fā)明涉及脫去酰胺基的DQ8表位:
[0069]QYPSGEGSFQPSQENPQA(SEQ ID NO:2)
[0070]所述脫去酰胺基的DQ8表位優(yōu)選由核苷酸序列5’-caa tae cca tea ggt gaa ggttea ttc caa cca tea caa gaa aac cca caa get-3'.(SEQ ID NO:1)編碼。
[0071]特別地，本發(fā)明涉及脫去酰胺基的DQ2表位
[0072]LQL QPF PQP ELP YPQ PQL PYP QPE LPY PQP QPF(SEQ ID NO:6)
[0073]所述脫去酰胺基的DQ2表位優(yōu)選由下述核苷酸序列編碼:[0074]5， -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca gaa fta cca tae cca tta cca taecca caa cca 9aa tta cca tae cca caa cca caa cca ttc(SEQ ID NO:5)
[0075]進一步證實另外的序列例如標簽的存在不影響對表位序列的免疫應答。因此，在進一步的實施方案中，所述表位可以包含進一步的氨基酸，例如50個氨基酸、43、
30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 個氨基酸。因此，本發(fā)明涉及包含至多50個另外的氨基酸的DQ8表位。在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及包含DQ8表位和e-標簽(GAPVPYPDPLEPR (SEQ ID NO:31))的氨基酸序列GAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQA (SEQ ID NO:16)
[0076]免瘡應答[0077]如本文所使用的，免疫應答相關疾病是由機體針對抗原的不希望有的免疫應答引起的疾病，由此所述抗原可以是異源抗原或自身抗原。免疫應答相關疾病包括但不限于變態(tài)反應(包括食物過敏)、乳糜瀉、變應性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化癥。免疫應答相關疾病還包括不希望有的免疫反應，例如移植物抗宿主病或藥物的免疫激活，例如針對非內(nèi)源因子VIII的抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述疾病選自變應性哮喘、食物過敏、乳糜瀉、I型糖尿病和治療的免疫失活。因此應當理解免疫應答相關疾病包括但不限于變態(tài)反應(包括食物過敏)、乳糜瀉、變應性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化癥。免疫應答相關疾病還包括不希望有的免疫反應，例如移植物抗宿主病或藥物的免疫激活，例如針對非內(nèi)源因子VIII的抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述疾病選自變應性哮喘、食物過敏、乳糜瀉、移植物抗宿主病、I型糖尿病和治療的免疫失活。
[0078]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“免疫顯性”涉及誘導免疫應答的基本抗原。
[0079]考慮到上文，因此應當理解本發(fā)明涉及如本文所描述的方法或用途，其中所述方法或用途是治療和/或預防的。
[0080]本發(fā)明的進一步方面涉及用于誘導對抗原的免疫耐受性的方法，其包括所述抗原通過微生物的粘膜遞送與免疫調(diào)節(jié)化合物產(chǎn)生微生物的粘膜遞送組合。免疫調(diào)節(jié)化合物和抗原可以通過相同微生物遞送，或它可以是不同微生物。
[0081]藥劑和施用
[0082]化合物意指生物化合物或復合物的任何化學制品，包括簡單或復雜的有機和無機分子、肽、擬肽(peptido-mimetics)、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復合物、抗體、碳水化合物、核酸或其衍生物。免疫調(diào)節(jié)化合物是修飾免疫系統(tǒng)的功能的化合物。如本文所使用的，免疫調(diào)節(jié)化合物是耐受性誘導化合物；作為非限制性例子，耐受性誘導可以通過誘導調(diào)節(jié)T細胞例如Treg、Trl或Th3、或通過使Thl/Th2平衡朝向Thl或Th2轉(zhuǎn)變、或通過抑制Thl7，以直接方式獲得，或通過激活未成熟的樹突狀細胞以耐受樹突狀細胞和/或抑制誘導Th2免疫應答的成熟樹突狀細胞上的“共刺激”因子表達，以間接方式獲得。免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制化合物是本領域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于細菌代謝產(chǎn)物例如精胍菌素，真菌和鏈霉菌屬代謝產(chǎn)物例如他克莫司、雷帕霉素或環(huán)孢素，免疫抑制細胞因子例如IL-4、IL-10、IFNa、TGFi3 (作為調(diào)節(jié)T細胞的選擇性佐劑)Flt3L、TSLP, CTB和Rank-L (作為選擇性致耐受性DC誘導物抗體和/或拮抗劑例如抗-CD40L、抗-CD25、抗-CD20、抗-1gE、抗-CD3、抗_IL_6(或IL6R)和蛋白質(zhì)、肽或融合蛋白，例如CTL-4Ig或CTLA-4激動劑融合蛋白。
[0083]因此，免疫調(diào)節(jié)化合物可以是本領域技術(shù)人員已知的任何免疫調(diào)節(jié)化合物。優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)化合物是免疫抑制化合物，更加優(yōu)選地所述化合物是免疫抑制細胞因子或抗體。優(yōu)選地，所述免疫抑制細胞因子是耐受性增強細胞因子或抗體。免疫抑制細胞因子是本領域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于IL-4、IL-10、IFN-a和TGF-β (作為調(diào)節(jié)T細胞的選擇性佐劑)，和Flt3L、TSLP, CTB和Rank-L (作為選擇性致耐受性DC誘導物)。優(yōu)選地，所述免疫抑制細胞因子選自IL-4、IL-10、IFNa和Flt3L。本領域技術(shù)人員應當理解，本發(fā)明還涉及其功能相應物(homologue)。功能相應物意指至少對于預期目的具有基本上相同或相似的功能，但在結(jié)構(gòu)上可以不同的分子。最優(yōu)選地，所述免疫抑制耐受性增強細胞因子是IL-10，或其功能相應物。優(yōu)選地，所述免疫抑制抗體選自抗-1L-2、抗-1L12、抗-11^6、抗-1?^1
[0084]如本文所使用的，遞送意指本領域技術(shù)人員已知的任何遞送方法，并且包括但不限于待遞送化合物的包被或非包被藥物制劑，包含或攜帶待遞送化合物或微生物的膠囊、脂質(zhì)體、油體、聚合物顆粒，所述微生物分泌、展示或積聚待遞送化合物，任選地在可增強粘膜遞送和/或粘膜攝取的化合物的存在下。
[0085]本文描述的化合物或組合物可以以純的形式，與其他活性成分組合，或與藥學上可接受的無毒賦形劑或載體組合施用?？诜M合物將一般包括惰性稀釋劑載體或可食用載體?？梢园ㄋ帉W上相容的結(jié)合劑、和/或佐劑材料作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、糖錠、灌腸劑等可以包含任何下述成分，或具有相似性質(zhì)的化合物:粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑例如淀粉或乳糖，分散劑例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂；助流劑例如二氧化硅膠體；甜味劑例如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑例如薄荷油、水楊酸甲酯或橙調(diào)味劑。當劑量單位形式是膠囊時，除上述類型的材料外，它還可以包含液體載體例如脂肪油。此外，劑量單位形式可以包含改變劑量單位的物理形式的各種其他材料，例如糖包衣、蟲膠或腸內(nèi)試劑。此外，除活性化合物外，糖漿可以包含蔗糖作為甜味劑和某些防腐劑、染料、著色劑和調(diào)味劑。應當理解藥學上可接受的載體的形式和特征由它將與之組合的活性成分的量、施用途徑和其他眾所周知的變量指示。一種或多種載體從與制劑的其他成分相容且對其接受者無害的意義上說必須是“可接受的”。
[0086]用于施用的可選制劑包括無菌水性和非水性溶液、懸浮液和乳狀液。非水性溶劑的例子是二甲基亞砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和可注射有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括醇和水的混合物、緩沖介質(zhì)和鹽水。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑，例如基于林格氏右旋糖的那些等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。各種液體制劑可用于這些遞送方法，包括鹽水、醇、DMSO和基于水的溶液。
[0087]優(yōu)選地所述抗原和/或所述免疫抑制細胞因子在小鼠實驗背景中以低量優(yōu)選
0.1ug或更低/劑量施用的細菌表達，此種量將在人疾病背景中轉(zhuǎn)變。
[0088] 如本文所使用的，術(shù)語“治療”等包括發(fā)展的精神疾病或病狀的改善或消除(一旦它已建立)，或此種疾病或病狀的特征性癥狀的減輕。如本文所使用的，依賴患者的狀況，這些術(shù)語還包括預防疾病或病狀或者與疾病或病狀相關的癥狀的發(fā)作,包括在被所述疾病或病狀折磨前減少疾病或病狀或與之相關的癥狀的嚴重度。此種在折磨前的預防或減少指給患者施用本發(fā)明的化合物或組合物，所述患者在施用時未被該疾病或病狀折磨?！邦A防”還包括預防疾病或病狀或與之相關的癥狀的再發(fā)生或復發(fā)，例如在改善時期后。顯而易見的是精神病狀可能負責身體疾病。在這方面，術(shù)語“治療”還包括身體疾病或病狀的預防或者發(fā)展的身體疾病或病狀的改善或消除(一旦它已建立)，或此種病狀的特征性癥狀的減輕。
[0089]如本文所使用的，術(shù)語“藥劑”還包括術(shù)語“藥物”、“治療劑”、“飲劑”或其他術(shù)語，其在醫(yī)學領域中用于指示具有治療或預防效應的制劑。
[0090]應當理解本發(fā)明的化合物即抗原以治療有效量遞送或表達。如本文所使用的，術(shù)語“治療有效量”意指本發(fā)明的化合物或組合物的量，當根據(jù)所需治療方案施用時，其將引起所需治療或預防效應或應答。觀察到當免疫顯性抗原持續(xù)存在時，炎性抗原特異性細胞應答甚至進一步減少。與像這樣施用抗原、像這樣施用微生物或抗原的不持續(xù)存在比較，這種減少明顯更大。根據(jù)本發(fā)明術(shù)語“持續(xù)存在”指根據(jù)本發(fā)明的抗原在預期粘膜位點例如炎癥位點處的持續(xù)或不間斷存在?？乖拇嬖诳梢酝ㄟ^本領域眾所周知的技術(shù)進行測量，例如PCR、ELISA或免疫沉淀技術(shù)，例如實施例部分和上文中詳細描述的。此外，乳酸乳球菌的存在可以是抗原的存在的測量。此外，由抗原引起的效應可以是抗原的存在的測量，例如內(nèi)源TGF-β或IL-10水平的存在或增加，或IFN-Y或IL-12水平的減少，或Treg細胞的存在，例如本文描述的，或脾細胞和引流淋巴結(jié)細胞的增殖能力的減少。因此應當理解抗原的水平可以改變，而抗原仍視為持續(xù)存在。
[0091]優(yōu)選地化 合物或組合物以單位劑型例如片劑、膠囊、灌腸劑或定量氣霧劑(metered aerosol dose)提供,從而使得單個劑量施用于受試者例如患者。
[0092]活性成分可以每天施用1-6次，足以顯示所需活性。這些日劑量可以作為單個劑量每天給予I次，或可以作為2個或更多更小的劑量在每天的相同或不同時間給予，其總共給出指定日劑量。優(yōu)選地，活性成分每天施用I次或2次。例如，一個劑量可在早晨服用和一個在白天稍后服用。
[0093]在本發(fā)明的所有方面，日維持劑量可以在患者中給予臨床所需時期，例如I天直至數(shù)年(例如，對于哺乳動物的整個其余生命)；例如約(2或3或5天、I或2周、或I個月)以上和/或例如直至約(5年、I年、6個月、I個月、I周、或3或5天)。日維持劑量一般施用約3-約5天或約I周-約I年。液體制劑的其他組成成分可以包括防腐劑、無機鹽、酸、堿、緩沖劑、營養(yǎng)物、維生素、或其他藥物。
[0094]遞送抗原的微生物可以以至少IO4菌落形成單位(cfu) -1O12Cfu/天，優(yōu)選106cfu-1012cfu/天，最優(yōu)選109cfu-1012cfu/天的劑量遞送。依照如Steidler等人(Science2000)中所述的方法，例如IO9Cfu的抗原和可能地免疫調(diào)節(jié)化合物分泌為至少Ing-1OOng0通過本領域技術(shù)人員已知的ELISA,本領域技術(shù)人員可以計算與cfu的任何其他劑量相關的抗原的分泌范圍。
[0095]抗原可以以誘導低劑量應答的劑量遞送。優(yōu)選地，所述抗原以至少10fg_500y g/天、優(yōu)選lpg-250 μ g/天、更優(yōu)選100pg-200 μ g/天、或優(yōu)選lng-150 μ g、或更優(yōu)選10ng-125 μ g/天、更加優(yōu)選IOOng-1OO μ g/天、更加優(yōu)選I μ g_90 μ g/天、和最優(yōu)選10 μ g-75 μ g/ 天,例如 25 μ g、30 μ g、40 μ g、50 μ g、60 μ g 或 70 μ g/ 天的劑量遞送。
[0096]優(yōu)選地化合物或組合物以單位劑型例如片劑、溶液、膠囊或定量氣霧劑提供，從而使得單個劑量施用于受試者例如患者。[0097]依賴于施用方式，例如經(jīng)口施用、或上文描述的那些中的任何一種，技術(shù)人員了解如何限定或計算待施用于患者的實際劑量。本領域技術(shù)人員對于依賴患者、微生物、載體等等調(diào)整劑量將是在行的。
[0098]本發(fā)明的化合物也可以采用藥理學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或代謝產(chǎn)物的形式。藥理學上可接受的鹽包括無機和有機酸的堿性鹽，所述酸包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、萘磺酸、蘋果酸、乙酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、馬來酸、水楊酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸等。當本發(fā)明的化合物包括酸性官能團例如羧基時，用于羧基的合適的藥學上可接受的陽離子對是本領域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括堿、堿土、銨、季銨陽離子等。
[0099]微牛物
[0100]根據(jù)本發(fā)明的微生物可以是適合于粘膜遞送的任何微生物，包括細菌、酵母或真菌。優(yōu)選地，所述微生物是非病原性微生物、更加優(yōu)選地，所述微生物是益生微生物。益生生物是本領域技術(shù)人員已知的。益生生物包括但不限于，細菌例如乳桿菌屬物種、乳球菌屬物種和酵母例如釀酒酵母布拉酵母菌亞種(Saccharomyces cerevisiae subspeciesboulardii )。優(yōu)選地，所述細菌是乳酸細菌；更加優(yōu)選地,所述乳酸細菌選自乳桿菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、乳球菌屬、鏈球菌屬(Streptococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、四聯(lián)球菌屬(Teragenococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Weisella)。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述乳酸細菌是乳桿菌屬物種。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物是釀酒酵母，更加優(yōu)選地，所述酵母是釀酒酵母布拉酵母菌亞種。
[0101]最優(yōu)選地，所述益生微生物是乳酸細菌，因為異種蛋白質(zhì)(B卩非乳酸細菌蛋白質(zhì))通過乳酸細菌遞送到粘膜內(nèi)，包括經(jīng)口和陰道遞送，已得到描述(Steidler和Rottiers,2006 ;Liu等人，2006)，這使得這些乳酸細菌非常適合于遞送所述抗原和可能地所述免疫抑制化合物。乳酸乳球菌是非病原性、非侵襲性、非定殖性革蘭氏陽性菌。產(chǎn)生各種遺傳修飾的乳酸乳球菌菌株，用于免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的局部合成和遞送給腸粘膜。此外，建立生物學包容系統(tǒng)(containment system),其使得遺傳改造的乳酸乳球菌的臨床應用成為可行的策略。
[0102]在一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌thyA突變體。特別優(yōu)選的實施方案使用乳酸乳球菌thyA突變體，其中編碼抗原的基因已用于破壞thyA基因。
[0103]菅養(yǎng)食品和醫(yī)學食物
[0104]應當理解本發(fā)明的化合物和組合物可以用作營養(yǎng)食品、功能或醫(yī)學食物，或用作所述營養(yǎng)食品、功能或醫(yī)學食物中的添加劑。另一個實施方案提供了優(yōu)選適合于人消費的食物或飲料，其由營養(yǎng)食品和調(diào)味劑組成，其中營養(yǎng)食品由來自農(nóng)產(chǎn)品的提取物組成。
[0105]無論是液體提取物還是干組合物形式，營養(yǎng)食品都是可食用的，并且可以直接由人食用，但優(yōu)選以添加劑或營養(yǎng)補充劑的形式提供給人，例如以在保健食物店中出售的片劑種類形式，或作為可食用固體，優(yōu)選地加工食品，例如谷類食物、面包、豆腐、餅干、冰激淋、蛋糕、馬鈴薯片、椒鹽卷餅、干酪等中的成分提供，以及在可飲用液體，例如飲料，例如乳、蘇打、體育飲料和果汁中提供。因此，在一個實施方案中，通過使食物或飲料與營養(yǎng)食品以有效增強食物或飲料的營養(yǎng)價值的量混合，提供了用于增強食物或飲料的營養(yǎng)價值的方法。
[0106]另一個實施方案提供了用于增強食物或飲料的營養(yǎng)價值的方法，其包括使食物或飲料與營養(yǎng)食品混合，以產(chǎn)生營養(yǎng)上增強的食物或飲料，其中營養(yǎng)食品以有效增強食物或飲料的營養(yǎng)價值的量混合，其中營養(yǎng)食品由來自包含本發(fā)明抗原的農(nóng)作物的提取物組成，并且其中營養(yǎng)上增強的食物或飲料可以進一步包含調(diào)味劑。優(yōu)選的調(diào)味劑包括甜味劑，例如糖、玉米糖衆(zhòng)、果糖、右旋糖、maltodextrose、環(huán)己燒氨基磺酸鹽、糖精、苯丙氨酸、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇，和草本甜味劑例如甜葉菊(stevia)。
[0107]本文描述的營養(yǎng)食品預期用于人消費，并且因此用于獲得它們的過程優(yōu)選依照藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范(Good Manufacturing Practices) (GMP)和管理此種過程的任何可應用的政府條例進行。特別優(yōu)選的過程僅利用天然衍生的溶劑。本文描述的營養(yǎng)食品優(yōu)選包含相對高水平的健康增強物質(zhì)。營養(yǎng)食品可以彼此混合，以增加其健康增強效應。
[0108]與營養(yǎng)食品形成對比，所謂的“醫(yī)學食物”不意欲由普通民眾使用，并且在商店或超市無法獲得。醫(yī)學食物并非在健康飲食內(nèi)包括以減少疾病的風險的那些食物，例如減脂食物或低鈉食物，它們也不是重量減輕產(chǎn)品。當患者具有特定營養(yǎng)需求時，醫(yī)生開出醫(yī)學食物處方，以便管理疾病或健康狀況，并且患者處于醫(yī)生的護理下。標簽必須清楚闡述該產(chǎn)品預期用于管理特定醫(yī)學病癥或病狀。醫(yī)學食物的例子是設計用于向具有慢性炎癥病狀的患者提供靶向營養(yǎng)支持的營養(yǎng)上不同的醫(yī)學食物。這種產(chǎn)品的活性化合物例如是本文描述的一種或多種化合物。功能食物可以包括在健康飲食內(nèi)包含以減少疾病的風險的那些食物，例如減脂食物或低鈉食物，或重量減輕產(chǎn)品。因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)食品的食物或飲料。
[0109]本領域技術(shù)人員應當理解可以對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行眾多改變和修飾，并且可以進行此種改變和修飾而不背離本發(fā)明的精神。因此，預期附加權(quán)利要求包含在本發(fā)明的真實精神和范圍內(nèi)的所有此種等價變化。
[0110] 此外，在本發(fā)明化合物的描述中使用的所有術(shù)語具有其在本領域中眾所周知的含義。
[0111]附圖簡述
[0112]圖1:LL-0VA的經(jīng)口飼喂顯著減少DTH應答。Balb/c小鼠在第O天時通過皮下注射0VA/CFA進行致敏，并且在第21天時接受0VA/IFA的加強免疫。在第7_11、14-18、21-25和28-31天時，小鼠用BM9、LLpTREX1、LL-OVA和I μ g OVA進行經(jīng)口處理。在第31天時，小鼠用在10 μ I鹽水中的IOyg Ova在耳的耳廓中進行攻擊。DTH應答表示為攻擊后24小時時2只耳在OVA攻擊前和后的耳厚度的差異。
[0113]圖2 =LL-OVA的經(jīng)口飼喂顯著減少大量脾細胞的OVA特異性增殖(A)以及IFN- Y(B)、IL-6(C)和IL-10 (D)產(chǎn)生。Balb/c小鼠在第O天時通過皮下注射0VA/CFA進行致敏，并且在第21天時接受0VA/IFA的加強免疫。在第21-25和28-31天時，小鼠用BM9、LLpTREXl和LL-OVA進行經(jīng)口處理。在第31天時，分離大量脾細胞且在用100 μ g/ml OVA離體刺激72小時后就OVA特異性增殖進行測試，其表示為在不同OVA濃度時的平均cpm土SEM，并且就IFN- Y、IL-6和IL-10產(chǎn)生進行測試。
[0114]圖3 =LL-OVA的經(jīng)口飼喂顯著減少⑶4+脾T細胞的OVA特異性增殖。Balb/c小鼠在第O天時通過皮下注射OVA/CFA進行致敏，并且在第21天時接受OVA/IFA的加強免疫。在第21-25和28-31天時，小鼠用BM9 (A)、LLpTREXl (B)和LL-OVA (C)進行經(jīng)口處理。在第31天時，分離大量脾細胞，并且在用100 μ g/ml OVA離體再刺激90小時后，通過CFSE和⑶4-APC標記以及流式細胞術(shù)分析評估⑶4+脾T細胞的OVA特異性增殖。
[0115]圖4 =LL-OVA處理的小鼠的⑶4+T細胞將耐受性轉(zhuǎn)移給首次用于實驗的接受者。Balb/c小鼠在第O天時通過皮下注射0VA/CFA進行致敏，并且在第21天時接受0VA/IFA的加強免疫。在第21-25和28-31天時，小鼠用BM9、LLpTREXl和LL-OVA進行經(jīng)口處理。在第31天時，分離CD4+脾T細胞且就耐受性轉(zhuǎn)移能力進行測試。耐受性通過CD4+脾T細胞從LL-OVA和LL-pTREX處理的小鼠轉(zhuǎn)移至首次用于實驗的接受者通過對后者進行致敏和攻擊就DTH應答進行評估，所述DTH應答表示為攻擊后24小時時2只耳在OVA攻擊前和后的耳厚度的差異。
[0116]圖5:N0DAB° DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠在第I天時通過皮下注射在CFA中的100 μ g eDQ8d進行免疫。小鼠在第1-10天時用LL-eDQ8d或LL-pTINX進行經(jīng)口處理。對照小鼠接受BM9。在第10天時，小鼠用在10 μ I鹽水中的IOyg eDQ8d在耳的耳廓中進行攻擊。DTH應答表示為注射后24小時時平均值的增加(減去eDQ8d攻擊前的耳厚度后)。結(jié)果概括了包括6只小鼠/組的3次獨立實驗的數(shù)據(jù)。
[0117]圖6:在DTH測量后，分離BM9 (對照)、LL_pTlNX和LL_eDQ8d組的脾(A)和腹股溝淋巴結(jié)(B)，并且用50yg eDQ8d肽離體進行再刺激。大量脾細胞(p=0.048)和腹股溝淋巴結(jié)細胞(P=0.0022)的eDQ8d特異性增殖應答表示為平均cpm。
[0118]圖7:脾(A)和腹股溝淋巴結(jié)細胞(B)的上清液中的細胞因子測量在再刺激后24小時時進行。結(jié)果是代表至少2次單獨實驗的以pg/ml表示的細胞因子分泌平均值。
[0119]圖8:減少的脾eDQ8d特異性增殖依賴于IL-10和TGF- β。實施例
[0120]實施例A:通過用遺傳修飾的乳酸乳球菌將OVA遞送給OVA致敏的野生型小鼠誘導OVA特異耐受性
[0121]前言
[0122]為了這個目的，遺傳改造分泌OVA的LL (LL-OVA)，并且在自身免疫/過敏的治療模型，即OVA免疫模型中評估全身耐受性的誘導。
[0123]材料與方法
[0124]細菌和培養(yǎng)基:乳酸乳球菌MG1363 (LL)菌株進行遺傳修飾，并且在本研究自始至終使用。細菌在GM17E培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17E培養(yǎng)基由補充有0.5%葡萄糖和5 μ g/ml 紅霉素(Abbott)的 Ml7 肉湯(Difco Laboratories, Detroit, Ml)組成。LL 菌株的貯備懸浮液于_20°C貯存于在GM17E培養(yǎng)基中的50%甘油中。貯備懸浮液在GM17E培養(yǎng)基中稀釋500倍，并且于30°C溫育過夜。在16小時內(nèi)，它們達到2xl09菌落形成單位(CFU)/ml的飽和密度。細菌通過離心進行收獲，并且以21101°細菌/ml重懸浮于BM9培養(yǎng)基中。每只小鼠通過胃內(nèi)導管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0125]質(zhì)粒:編碼原雞(Gallus gallus)卵白蛋白的mRNA序列從Genbank (登記號AY223553)和公開數(shù)據(jù)中檢索。從雞子宮中分離總RNA，并且在25 μ I體積中使用2 μ g總RNA、2 μ M 寡核苷酸 dT 引物(Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands)、
0.01mM DTT (Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,The Netherlands)』.5mM dNTP (Invitrogen,Merelbeke,Belgium)、20U Rnasin(Promega Incorporation Benelux)和 IOOU superscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增OVA cDNA片段，使用下述引物:正向 5’ -GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’ (SEQ ID NO:9)和反向 5’ -ACTAGTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:10)。反應條件是 94°C 2 分鐘，隨后為94°C 45秒、62°C 30秒和72°C 90秒的30個循環(huán)。使擴增片段與乳球菌屬Pl啟動子17下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號融合。用攜帶OVA cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為分泌OVA的乳酸乳球菌(LL-OVA)。其為包含空載體pTREXl的MG1363的乳酸乳球菌-pTREXl充當對照(LL-pTREX)。
[0126]小鼠:7周大的雌性 Balb/c 小鼠得自 Charles River Laboratories (Calco,Italy)，并且在常規(guī)動物實驗室中在特定無病原體條件下進行飼養(yǎng)。動物研究由GhentUniversity 的 Ethics Committee of the Department for Molecular BiomedicalResearch 批準(檔案號 07/029)。
[0127]抗原:完整的無LPS的OVA V級別蛋白質(zhì)在所有實驗中用作抗原(SigmaAldrich)。
[0128]小鼠的免疫和口服耐受性的誘導:Balb/c小鼠在第一天時通過在尾的基部處皮下注射在 100 μ I CFA (Difco, BD Bioscience, Erembodegem, Belgium)和鹽水溶液的 I: I混合物中的IOOyg OVA進行免 疫。在第7-11、14-18、21-25和28-31天時(方案I)，以及在第21-25和28-31天時(方案2)，每天施用溶解于100 μ I ΒΜ9中的LL-OVA, LL-pTREX I或Iyg純化的0VA。對照小鼠僅接受BM9。抗原或細菌懸浮液使用18號(18-gauge)不銹鋼動物飼喂針導入胃內(nèi)。在第21天時,通過皮下注射在100 μ I IFA (Sigma-Aldrich)的1:1混合物中的100 μ g OVA給予加強免疫。通過DTH應答、細胞因子和OVA特異性增殖的測量、以及過繼轉(zhuǎn)移實驗來評估耐受性誘導。
[0129]遲發(fā)型超敏反應:抗原特異性DTH應答通過在第31天時注射OVA進行評估。24小時后執(zhí)行DTH測量。對于抗原特異性DTH應答的測量，小鼠用在10 μ I鹽水中的IOyg OVA在耳的耳廓中進行攻擊。定義為由于攻擊引起的耳厚度增加的耳腫脹，在攻擊后24小時時使用數(shù)字測微計(Conrad，Belgium)以不知情方式進行測量。DTH應答表示為2只耳在OVA攻擊前和后的耳厚度的差異。
[0130]OVA特異性增殖和細胞因子測定:在第39天時，收獲脾，并且就OVA特異性增殖和細胞因子產(chǎn)生評估脾細胞。通過使細胞通過70-μ m細胞過濾器(Becton/DickinsonLabware)制備脾的單細胞懸浮液。通過與紅細胞裂解緩沖液一起溫育裂解細胞懸浮液中的紅細胞。使用OM+T細胞分離試劑盒和midiMACS柱(Miltenyi Biotec, Germany)富集⑶4+T細胞。
[0131]為了測定總脾細胞群體的增殖，在96孔U形底平板中在單獨或具有以
1.2-100 μ g/ml濃度加入的OVA的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基[即包含10%胎牛血清(FCS)、10U/ml 青霉素、10 μ g/ml 鏈霉素、2mML-glutamax、0, 4mM 丙酮酸鈉的 RPM1-1640]中培養(yǎng) 2xl05 細胞。增殖通過 5，6-CFSE 標記(Invitrogen, Merelbeke, Belgium)進行進一步評估。脾細胞以IOVml重懸浮于PBS中，并且以10 μ M CFSE的終濃度于37°C溫育12分鐘。在96孔U形底平板中在具有100 μ g/mlOVA的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中以2χ105細胞培養(yǎng)之前，標記的細胞用冰冷的完全培養(yǎng)基洗滌2次。在37°C和5% CO2下在加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90小時后，收獲細胞并且用別藻藍蛋白標記的抗-⑶4 (BDjiosciences)對細胞染色，并且使用流式細胞術(shù)(FACSCanto，BD Biosciences)測定增殖。
[0132]為了測定CD4+T細胞的增殖，在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中，以1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03和1/0的比例培養(yǎng)2χ105個CD4+T細胞與充當抗原呈遞細胞的絲裂霉素C處理的OVA裝載的脾細胞。細胞在37°C和5% CO2下在加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90小時。對于增殖測定，加入I μ Ci/孔[3Η]-胸苷進行最后18小時的培養(yǎng)，在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA,并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量DNA結(jié)合的放射性活性。對于細胞因子測量，在培養(yǎng)72小時后收集在不同增殖測定中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-20°C進行冷凍。細胞因子產(chǎn)生使用Mouse Flex Set CytometricBead Array (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進行定量。
[0133]過繼轉(zhuǎn)移實驗:在第39天時，從處理組中收集脾。通過切碎脾且使它們通過70-μ m細胞過濾器(Becton/Dickinson Labware)而獲得單細胞懸浮液。如上所述,細胞懸浮液就⑶4+T細胞進行富集。⑶4+富集細胞通過靜脈內(nèi)注射IxlO6⑶4+T細胞而過繼轉(zhuǎn)移給首次用于實驗的BALB/c受體小鼠。過繼轉(zhuǎn)移后I天，所有小鼠通過在尾基部處皮下注射100 μ g 0VA/25 μ I鹽水/25 μ I IFA (Sigma-Aldrich)進行致敏，并且其后5天，小鼠根據(jù)上文描述的DTH方案進行攻擊。
[0134]統(tǒng)計分析:在耳厚度和細胞因子測量中組間差異的顯著性使用單因素ANOVA進行檢驗。統(tǒng)計顯著性標示為* (p〈0.05)或** (p〈0.01)。
[0135]結(jié)果
[0136]與游離OVA比較，LL-OVA在OVA免疫模型中顯著增強耐受性誘導能力。
[0137]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述進行經(jīng)口飼喂。與致敏的對照小鼠(BM9組)以及用LL-pTREXl或I μ g純化的OVA處理的小鼠比較，給OVA致敏的BALB/c小鼠施用LL-OVA導致DTH應答的顯著減少(圖1)。
[0138]這些數(shù)據(jù)伴隨與BM9組或LL-pTREXl處理組比較，LL-OVA處理的小鼠的大量脾細胞顯著減少的增殖能力以及IFN-Y、IL-10和IL-6產(chǎn)生(圖2)。
[0139]LL-OVA經(jīng)由⑶4+T細朐增強口服耐等件。
[0140]為了評估CD4T細胞是否介導口服耐受性的誘導，研究脾細胞中的OVA特異性增殖的⑶4T細胞應答。流式細胞術(shù)證實與BM9和LL-pTREXl組中的4.5%和11.6%比較，在LL-OVA組中在OVA再刺激后僅0.8 %的⑶4+脾T細胞增殖(圖3)。此外，從LL-OVA處理組到首次用于實驗的BALB/c小鼠的過繼轉(zhuǎn)移CD4+脾T細胞證實這些細胞可以轉(zhuǎn)移耐受性，因為這些細胞在用OVA免疫且攻擊受體小鼠后能夠減少DTH應答(圖4)。
[0141]結(jié)論
[0142] 此處，證實OVA分泌乳酸乳球菌的胃內(nèi)施用經(jīng)由誘導⑶4+調(diào)節(jié)而抑制OVA特異性T細胞應答。證實這種免疫耐受性誘導比游離OVA蛋白質(zhì)更有效，并且這可以在治療背景中建立。
[0143]實施例B:通過用遺傳修飾的乳酸乳球菌將DQ8特異性免疫顯性麥醇溶蛋白表位遞送給谷蛋白致敏的II類轉(zhuǎn)基因小鼠誘導抗原特異性口服耐受性。[0144]前言
[0145]也稱為口炎性腹瀉或谷蛋白敏感性腸病的乳糜瀉是慢性炎性疾病，其由針對包含谷蛋白的特別飲食谷物的免疫應答發(fā)展。乳糜瀉是與基因強相關的復雜多基因病癥，所述基因編碼人白細胞抗原變體HLA-DQ2或HLA-DQ8。在乳糜瀉發(fā)病機理中的最重要方面之一是T輔助I免疫應答的激活。這在表達HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈遞細胞將毒性谷蛋白肽呈遞給CD4+T細胞時發(fā)生。2類谷蛋白，麥醇溶蛋白和麥谷蛋白包含結(jié)合DQ2和DQ8的肽。一般公認免疫應答例如來自谷蛋白特異性T細胞的IFN-Y產(chǎn)生觸發(fā)乳糜瀉患者的小腸中的粘膜破壞。因此，有害的免疫T細胞應答在乳糜瀉患者的腸中的激活看起來在該疾病的起始和進展中是關鍵的。
[0146]抗原特異性免疫抑制是治療乳糜瀉的有吸引力的治療目標。重組谷蛋白蛋白質(zhì)/肽通過遺傳修飾的乳酸乳球菌(LL)在腸粘膜處的有效遞送提供了用于誘導耐受性的新治療方法。為了這個目的，遺傳改造分泌脫去酰胺基的DQ8表位的LL (LL-eDQ8d)，并且在經(jīng)口補充后在谷蛋白致敏的NOD AB° DQ8II類轉(zhuǎn)基因小鼠中評估局部和全身免疫應答。
[0147]此處，證實產(chǎn)生麥醇溶蛋白肽的乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細胞而抑制麥醇溶蛋白特異性免疫應答。
[0148]材料與方法
[0149]細菌和培養(yǎng)基:乳酸乳球菌MG1363 (LL)菌株進行遺傳修飾，并且在本研究自始至終使用。細菌在GM17E培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17E培養(yǎng)基是補充有0.5%葡萄糖和5 μ g/ml 紅霉素(Abbott)的 Ml7 肉湯(Difco Laboratories, Detroit, MI)。LL 菌株的忙備懸浮液于_20°C貯存于在GM17E培養(yǎng)基中的50%甘油中。貯備懸浮液在GM17E培養(yǎng)基中稀釋200倍，并且于30°C溫育過夜。在培養(yǎng)16小時內(nèi)，達到2xl09菌落形成單位(CFU)/ml的飽和密度。細菌通過離心進行收獲，并且以2xl09細菌/100μ I在BM9接種緩沖液中進行10倍濃縮。對于處理，每只小鼠通過胃內(nèi)導管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0150]質(zhì)粒:編碼脫去酰胺基的DQ8表位的序列(編碼DQ8d:caa tac cca tea ggt gaaggt tea ttc caa cca tea caa gaa aac cca caa get (SEQ ID NO:1))從公開數(shù)據(jù)中檢索?？傊瑢ⅵ?麥醇溶蛋白肽內(nèi)的2個谷氨酰胺殘基改變成谷氨酸，以對攜帶DQ8的乳糜瀉患者刺激脫去酰胺基的免疫顯性α -麥醇溶蛋白應答，并且這個表位由這些小鼠的T細胞識別。DQ8d cDNA片段通過合成構(gòu)建(Operon, The Netherlands),并且通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增，使用下述正向和反向引物:5’ -caatacccatcaggtgaaggttc-3’ (SEQID NO:11)和 5，-cgactagttaagcttgtgggttttcttgtgat-3，(SEQ ID NO: 12)0 為了檢測目的，使e-標簽(e)與由下述序列g(shù)gt get cca gttcca tac cca gat cca ctt gaa cca cgt(SEQ ID NO:13)組成的片段附著。為了給DQ8d基因的5’末端添加e_標簽，在步驟I中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物(DQ8d)在另一 PCR中用作模板,使用寡核苷酸5’-ggtgctccagttccatacccagatccacttgaaccacgtcaatacccatca-3J(SEQ ID NO:14)和S’-cgactagttaagcttgtgggttttcttgtgat-3’(SEQ ID N0:15)。使擴增片段與乳球菌屬Pl啟動子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號融合。用攜帶eDQ8d cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為分泌eDQ8d的乳酸乳球菌(LL-eDQ8d)。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當對照。
[0151] 功能分析分泌的表位:對于分泌的eDQ8d表位的功能分析，執(zhí)行用衍生自乳糜瀉(⑶)患者的腸的人T細胞克隆的增殖測定。細菌如上所述過夜生長，1:50稀釋，且分別生長另外4或6小時。對于谷蛋白特異的T細胞克隆由得自患者S的小腸活組織檢查產(chǎn)生，患者S是已進行不含谷蛋白飲食數(shù)年的成年荷蘭人CD患者。患者給出關于該研究的知情同意書，這得到醫(yī)院倫理委員會批準。該患者血清學分型為HLA-DR3/4，DQ2/8，因此攜帶2種⑶相關DQ 二聚體。發(fā)現(xiàn)當與HLA-DQ8結(jié)合時，T細胞克隆1129響應具有最少9氨基酸核心QGSFQPSQQ的α -麥醇溶蛋白衍生肽。發(fā)現(xiàn)Pl和/或Ρ9谷氨酰胺殘基(Q)通過組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性脫去酰胺基成為谷氨酸(Ε)，顯著增強這種谷蛋白肽的T細胞刺激能力。增殖測定在150 μ I培養(yǎng)基(Iscoves)中在96孔平底平板(Falcon)中一式兩份或一式三份地進行，使用在幾個濃度的上清液不存在或存在的情況下用IO5HLA-DQ-匹配的和3000RAD輻射的外周血單核細胞刺激的IO4T細胞。48小時后，培養(yǎng)物用0.5uCi的3H-胸苷進行脈沖，其后18小時時收獲培養(yǎng)物，這之后測定3H-胸苷摻入作為增殖的量度。
[0152]小鼠:在內(nèi)源MHC I1-缺陷背景中表達HLA-DQ8的轉(zhuǎn)基因小鼠(AB° DQ8+)與NOD小鼠回交10代，并且互交以產(chǎn)生同基因型NOD AB° DQ8+小鼠。7-16周大的小鼠用于實驗。小鼠進行斷奶且維持在常規(guī)動物實驗室，直至8-12周大。[0153]抗原和抗體:合成含(GAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQA(SEQID NO:16))和不含(QYPSGEGSFQPSQENPQA (SEQ ID NO:2)) e_標簽的脫去酰胺基的DQ8表位。對于T細胞表型分型，分別地，從BD-Biosciences (San Jose, CA)購買CD4和CD25抗體，并且從eBiosciences (San Diego, USA)購買APC抗_Foxp3染色試劑盒?？?1L-10中和單克隆抗體(148/!111，克隆邛5052八5)36卩-3中和單克隆抗體(I μ g/ml，克隆1D11)和LAP中和抗體(I μ g/ml,克隆 27235)得自 R&D systems (Minneapolis, MN)。
[0154]經(jīng)口飼喂和DTH(遲發(fā)型超敏)反應:以不含谷蛋白食物為生的NOD AB° DQ8小鼠在第一天時通過在尾基部中皮下注射在100 μ 11:1CFA (購自Difco of Becton, Dickinsonand Company, San Jose, CA)鹽水溶液中的100 μ g脫去酰胺基的eDQ8肽進行致敏。用于致敏作用的肽具有與分泌的表位相同的序列。對小鼠飼喂作為陰性對照的BM9、LL-pTINX或LL-eDQ8d[全部在第1_10天時溶解于100 μ I ΒΜ9中]。通過使用18號不銹鋼管飼針胃內(nèi)施用抗原或細菌懸浮液進行飼喂。免疫后10天，評估抗原特異性DTH應答。其后24小時時執(zhí)行DTH測量。對于抗原特異性DTH應答的測量，小鼠用在10 μ I鹽水中的10 μ geDQ8d在耳的耳廓中進行攻擊。在攻擊后24小時時使用工程師的測微計(Mitutoyo，Tokyo，Japan)以不知情方式測量耳厚度的增加。DTH應答表示為在eDQ8d注射后24小時時增加的差異(減去攻擊前的耳厚度后)。隨后處死小鼠，收獲脾和淋巴結(jié)，并且就DQSd特異性增殖和細胞因子產(chǎn)生評估細胞。對于e-標簽干擾，NOD AB° DQ8小鼠在第I天時在尾基部中用在100μ 11:1完全弗氏佐劑(CFA，Difco，BD)鹽水溶液中的100 μ g含(eDQ8d)或不含E-標簽(DQSd)的脫去酰胺基的DQ8表位進行免疫。在第7天時，如上所述用對應于用于免疫的肽的IOyg含或不含e-標簽的DQ8d執(zhí)行小鼠DTH測量。
[0155]細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子產(chǎn)生測定:在實驗的第11天時通過用組織磨碎器在IXPBS中使組織均質(zhì)化制備脾和淋巴結(jié)的細胞懸浮液。通過與ACK(氯化銨/鉀(裂解緩沖液))一起溫育從脾細胞懸浮液中去除紅細胞。細胞以5x10s細胞/孔在0.2-ml體積中于37°C在RPMI1640 (1.5% HepesU% Penstrep和10% FBS)中在96孔微量滴定板中溫育，所述RPMI1640具有包含單獨的培養(yǎng)基、10 μ g Con A或50yg eDQ8d表位的補充物。在分開的實驗中，將IL-KKTGF-β、ILlO和TGF-β或LAP中和抗體加入LL_eDQ8d處理的小鼠的脾細胞中。24小時后，通過加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷進行最后24小時培養(yǎng)來評估增殖。在玻璃纖維濾器墊上收獲DNA結(jié)合的放射性活性,并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。結(jié)果表示為一式三份孔的平均cpm。對于細胞因子測量，在培養(yǎng)24小時后如上所述收集在不同增殖測定中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-20°C進行冷凍直至執(zhí)行細胞因子分析。細胞因子產(chǎn)生使用 Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences)進行定量。
[0156]流式細胞術(shù)分析:分離BM9、LL-pTINX或LL_eDQ8d處理的小鼠的脾和腸相關淋巴結(jié)組織(GALT)，如上所述進行制備，并且就⑶4、⑶25和Foxp3進行染色。根據(jù)制造商的說明書(eBiosciences, San Diego, CA)針對Foxp3執(zhí)行細胞內(nèi)染色,并且隨后使用流式細胞術(shù)在Becton Dickinson FACSCaliburs上進行測量。對于分析，細胞針對CD4+CD25+和⑶4+CD25_亞群進行門控，并且在這些群體內(nèi)，F(xiàn)oxp3直方圖用于測定平均熒光強度(MFI)。
[0157]統(tǒng)計分析:來自細胞因子測量的結(jié)果表示為平均值土SEM。eDQ8d特異性增殖、耳厚度和細胞因子測量就顯著性進行檢驗，使用單因素ANOVA隨后為斯氏t檢驗比較:2個樣品假定相等差異，以測定單獨的組間的差異。對于所有檢驗，P值〈0.05:*，〈0.01:**用于指示2種檢驗的統(tǒng)計顯著性。
[0158]結(jié)果
[0159]eDQ8d表位經(jīng)由乳酸乳球菌的粘膜遞送顯著減少DQ8d誘導的DTH應答以及大暈脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖能力。
[0160]與致敏的陰性對照小鼠比較，LL-eDQ8d在eDQ8d免疫的NOD AB° DQ8II類轉(zhuǎn)基因小鼠中的每日胃內(nèi)施用導致DTH應答的顯著減少(圖5 )。對照小鼠(飼喂BM9 )明顯對于eDQ8d免疫，但LL_eDQ8d的每日胃內(nèi)施用顯著減少DTH (13.1x10 2mm對5.1x10 2mm,p=0.0031)。與對照比較，耳腫脹在LL-pTINX處理的小鼠中也輕微減少(9.3xl(T2mm對
13.lxl(T2_ ρ=0.0343)，但程度比LL-eDQ8d處理的小鼠中小得多。非DQ8轉(zhuǎn)基因NOD AB。小鼠顯示耳厚度僅微小的增加(3.2xl0_2mm)。這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)口施用的LL_eDQ8d抑制免疫的NOD AB° DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠中的全身性炎性T細胞應答，并且分泌的抗原對于誘導顯著的致耐受性效應是必需的。這些數(shù)據(jù)伴隨脾細胞和腹股溝淋巴結(jié)細胞顯著減少的增殖能力(圖6)。減少的增殖應答伴隨IL-10的顯著上調(diào)和IL-12產(chǎn)生的下調(diào)(在脾細胞的離體eDQ8d刺激后)(圖7)。此外，與BM9和LL-pTINX處理的小鼠比較，LL_eDQ8d顯著減少在腹股溝淋巴結(jié)中的eDQ8d誘導的IFN- Y產(chǎn)生?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明LL_eDQ8d處理在eDQ8d刺激后抑制T細胞激活，并且暗示DC激活也可以進行調(diào)節(jié)。
[0161]減小的脾eDQ8d特異件增葙依賴于IL-10和TGF- β ,并目.LL_DQ8d處理顯著增加脾和GALT的Foxd3表汰
[0162] TGF-β、IL-10和LAP (膜結(jié)合TGF-β )對于eDQ8d特異性脾增殖應答的功能重要性使用中和抗體進行分析。IL-10-、TGF- β -或LAP-中和抗體未顯著干擾LL_eDQ8d處理的小鼠減少的脾增殖應答，但添加TGF- β和IL-10中和單克隆抗體的組合完全取消LL-eDQ8d處理的小鼠脾細胞減少的eDQ8d特異性增殖能力(圖8)。這些數(shù)據(jù)強烈暗示LL-eDQ8d處理在eDQ8d免疫的NOD AB° DQ8II類轉(zhuǎn)基因小鼠中能夠抑制T細胞激活，并且這種抑制依賴于IL-10和TGF-β。此外，與對照(BM9)比較，在LL-eDQ8d處理的小鼠的脾⑶4+CD25+以及⑶4+⑶25_細胞群體內(nèi)可見Foxp3的顯著上調(diào)(分別為MFI171對61和35對6)。值得注意的是，與BM9處理比較，F(xiàn)oxp3在LL-eDQ8d處理的小鼠的腸相關淋巴結(jié)組織(GALT)中的0)4+0025-群體中也是上調(diào)的(]\^173對30)，但在641^ CD4+CD25+群體中不是。LL-pTINX飼喂也誘導一定的Foxp3上調(diào)，但專有地在脾⑶4+CD25_T細胞群體中，并且程度比LL_eDQ8d低(分別為MFI15對35)。
[0163]結(jié)論
[0164]我們的數(shù)據(jù)證實對于DQ8介導的T細胞應答免疫顯性的麥醇溶蛋白衍生肽通過遺傳修飾的乳酸乳球菌的粘膜遞送，在NOD AB° DQ8II類轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導局部和全身DQ8限制性T細胞應答的抑制。處理導致脾細胞和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖能力的抗原特異性減少，這關鍵性地依賴IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，并且與Foxp3+調(diào)節(jié)T細胞的顯著誘導相關。因為這種抗原遞送細菌方法具有甚至在確定的超敏性的背景中使得口服耐受性成為可能的能力，所以它可用于治療乳糜瀉和可能地其他自身免疫和/或變應性疾病。
[0165]天然DQ8表位[0166]上述實驗用天然α-麥醇溶蛋白表位即QYPSGQGSFQPSQQNPQA(SEQ ID NO: 4)進行重復，所述表位對應于可經(jīng)由UniProtKB/TrEMBL條目Q9M4L6檢索的序列的殘基203-220。所述天然的DQ8表位由核苷酸序列5’ -caa tac cca tea ggt caa ggt tea ttc caa ccatea caa caa aac cca caa gct_3’ (SEQ ID NO:3)編碼。
[0167]用天然α-麥醇溶蛋白DQ8表位的結(jié)果基本上等同于上文對于脫去酰胺基的α -麥醇溶蛋白DQ8表位描述的結(jié)果。
[0168]使用DQ8表位在乳糜瀉患者中進行的試驗
[0169]在預備研究中，根據(jù)本發(fā)明的改造的乳酸乳球菌在具有乳糜瀉的患者的試驗中用作治療劑。我們的發(fā)現(xiàn)提供了這種方法以抗原特異性方式有效的希望。
[0170]由于LL在初次應答的位點處遞送抗原以達到直接和旁觀者耐受性的能力，乳糜瀉是這種方法的特別有吸引力的靶。
[0171]使用DQ2表位在乳糜瀉患者中進行的試驗
[0172]不存在可與上文使用的HLA-DQ8小鼠比較的，在內(nèi)源MHC I1-缺陷背景中表達HLA-DQ2的轉(zhuǎn)基因小鼠。因此，上文對于DQ8表位描述的實驗在合適的小鼠模型中是不可能的。因此在具有乳糜瀉的患者中進行某些預備實驗，使用天然以及脫去酰胺基的α-麥醇溶蛋白DQ2表位。
[0173]特別地，上述實驗使用下述進行重復:
[0174]脫去酰胺基的DQ2 表位 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF(SEQ ID N0:6)，其由核苷酸序列5’ -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca gaa tta cca tac cca tta ccatac cca caa cca gaa tta cca tac cca caa cca caa cca ttc (SEQ ID NO:5)編石馬，
[0175]和天然DQ2 表位:LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID N0:8)，其由核苷酸序列5’ -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca caa tta cca tac cca tta cca taccca caa cca caa tta cca tac cca caa cca caa cca ttc (SEQ ID NO:7)編石馬。
[0176]用天然和脫去酰胺基的α-麥醇溶蛋白DQ2表位的結(jié)果基本上等同于上文對于α -麥醇溶蛋白DQ8表位描述的結(jié)果。
[0177]實施例C:在分泌所述因子的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導對凝血因子VIII和因子IX的耐受性[0178]前言
[0179]幾種治療(重組)蛋白質(zhì)，例如干擾素、因子VIII/IX和抗體(Remicade)在延長的治療期以高劑量施用。然而，與其使用相關的并發(fā)癥是蛋白質(zhì)特異性免疫應答例如抗體的發(fā)展。這些抗體(Ab)也稱為抑制劑，使得治療蛋白質(zhì)更不有效。例子包括在經(jīng)歷慢性腎衰竭的治療的患者中在血友病中的因子VIII/IX、促紅細胞生成素(Epo)的抑制劑的形成，和在經(jīng)歷多發(fā)性硬化癥的治療的患者中IFN-的抑制劑的形成。此處，證實因子VIII (和因子IX)通過乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細胞而抑制所述因子的抑制劑形成。
[0180]材料與方法
[0181]細菌和質(zhì)粒:乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細菌在GM17培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories,Detroit,MD0所有菌株的貯備懸浮液于_20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進行溫育。它們在16小時內(nèi)達到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。本研究自始至終，使用混合的細菌懸浮液。因此，混合的細菌通過離心進行收獲，并且2種細菌培養(yǎng)物的沉淀在BM9培養(yǎng)基(Schotte，Steidler等人2000)中進行10倍濃縮。對于處理，每只小鼠通過胃內(nèi)導管接受100 μ I這種懸浮液。
[0182]代表FVIII和FIX特異性CD4+T細胞表位的人FVIII和FIX cDNA或cDNA片段進行擴增，并與乳球菌屬Pl啟動子下游的紅霉素抗性PTlNX載體的Usp45分泌信號融合。
[0183]用攜帶人FVIII (和/或表位片段)、FIX (和/或表位片段)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為分泌FVII1、FIX的乳酸乳球菌LL-FVII1、LL-FIX。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當對照。
[0184]FVIII和FIX的定量:分別來自LL-FVIII和LL-1X的FVIII或FIX使用人FVIII和FIX特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進行測定，所述ELISA先前已得到描述(Chuah等人，2003)。重組蛋白質(zhì)也通過蛋白質(zhì)印跡分析以及COATests和aPTT測定進行分析,如所描述的(Chuah等人,2003 ;VandenDriessche等人，1999)。這種蛋白質(zhì)的NH2-末端通過自動化埃德曼(Edman)降解進行測定。因為FVIII和FIX通常在肝中表達，在其中它們經(jīng)歷廣泛的翻譯后修飾，所以由改造的乳酸乳球菌產(chǎn)生的凝血因子可能是無生物學活性的。然而，這些翻譯后差異將可能對這些乳酸乳球菌產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)誘導免疫耐受性的能力不具有影響。事實上，迄今為止已詳細表征的大多數(shù)抑制劑一般識別氨基酸殘基(Villard等人，2003),而不是糖基化部分。
[0185]動物:使用如由Bi等人，(1995)和Wang等人，(1997)描述的在ES細胞中的同源重組，通過敲除鼠類FVIII或FIX基因獲得的血友病A或B小鼠在實驗室中進行培育。在CFA存在下用純化的重組FVIII或FIX抗原進行攻擊時，這些接受小鼠產(chǎn)生中和抗體(Mingozzi等人，2003)。抑制劑狀態(tài)可以使用Bethesda測定或抗-FVIII/抗-FIX特異性ELISA隨著時間過去進行監(jiān)控。用FVIII或FIX (+CFA)攻擊的接受小鼠一般在抗原攻擊后2_3周發(fā)展抑制劑。
[0186] 實驗設置:4-6周大的小鼠接受 FVII1、FIX、LL-FVIII, LL-FIX 或 LL-pTINX 或LL-OVA (無關抗原)(I或10yg)。作為耐受性誘導的陽性對照，用從肝細胞特異性啟動子表達FIX的腺伴隨病毒載體(AAV)注射小鼠。接受動物發(fā)展FIX特異性免疫耐受性，其在用FIX+CFA后續(xù)攻擊后阻止抗-FIX抗體的誘導。
[0187]在預防背景中，單獨的FVII1、FIX、LL-FVII1、LL-FIX使用胃導管經(jīng)口施用于血友病A或B小鼠，使用不同的處理間隔和劑量。這些接受小鼠隨后在CFA的存在下用純化的重組FVIII和FIX抗原進行攻擊(Mingozzi等人，2003)。使對照動物暴露于LL-pTINX和LL-0VA。通過眶后采血收獲血漿。針對FVIII或FIX的抗體的發(fā)展使用Bethesda測定(Kasper 等人，1975)或使用改良的抗-FVIII 或抗-FIX 特異性 ELISA (VandenDriessche等人，1999)以不同時間間隔進行評估。
[0188]在治療背景中，如所述的(Mingozzi等人，2003)，血友病A或B小鼠首先用FVIII或FIX進行免疫。抑制劑狀態(tài)使用Bethesda測定或抗-FVIII/抗-FIX特異性ELISA隨著時間過去進行監(jiān)控。具有低或高抑制劑滴度的小鼠隨后用單獨的FVII1、FIX、LL-FVII1、LL-FIX進行處理，使用不同的處理間隔和劑量，并且抑制劑滴度隨著時間過去進行測定?？赡艿拿庖吣褪苄缘奶禺愋酝ㄟ^用無關抗原(破傷風類毒素或Ova)攻擊接受單獨的FVII1、FIX、LL-FVII1、LL-FIX的小鼠進行評估。
[0189]細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定:通過使細胞通過70 μ m細胞過濾器(Becton/Dickinson Labware)制備脾和淋巴結(jié)的單細胞懸浮液。通過與紅細胞裂解緩沖液一起溫育從脾細胞懸浮液中去除紅細胞。
[0190]對于總脾細胞群體的增殖測定，2xl05細胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨或具有純化的FVIII或FIX、并且含有或不含抗-1L-10或抗-TGF-β中和單克隆抗體。FVIII和FIX以1-100 μ g/ml的濃度加入。中和抗體以1、0.1和0. 01 μ g/ml加入。對于⑶4+T細胞和⑶4+⑶25_T細胞群體的增殖測定，0.2χ105個⑶4+Τ細胞或⑶4+CD25_T細胞在96孔U形底平板中與充當抗原呈遞細胞的IxlO5經(jīng)輻射的⑶4_細胞，和FVIII或FIX (O或100μ g/ml) —起在含或不含中和抗體的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時后，通過加Λ IuCi/孔[3H]-胸苷來評估增殖。在16-18小時后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer,Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
[0191]對于細胞因子測量，在培養(yǎng)24、48和72小時后收集在不同增殖測定中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-20°C進行冷凍直至執(zhí)行細胞因子分析。細胞因子產(chǎn)生使用MouseInflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進行定量。
[0192]體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測定:為了測試小鼠中抗體形成的有效抑制，將從不同實驗乳酸乳球菌處理的組中分離的脾細胞、珠純化的⑶4+T細胞、⑶4+⑶25_或⑶4+⑶25+T細胞過繼轉(zhuǎn)移給首次用于實驗的C3H/HeJ小鼠。未處理的小鼠用作對照。轉(zhuǎn)移細胞的數(shù)目對于整體脾細胞、亞群耗盡的脾細胞、或陽性選擇的CD4+細胞以及CD4+CD25_和CD4+CD25+T細胞是107。接受小鼠(n=4-5/實驗群組)在過繼轉(zhuǎn)移后36小時時用在cFA中的5 μ g hF.1X進行皮下注射。血漿中的抗hF.1X IgG滴度在免疫后2.5周進行測量。
[0193]結(jié)果
[0194]與游離FVIII或FIX比較，LL-FVIII和LLzIX顯著增強血友病A或B小鼠的耐等性誘導能力
[0195]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。LL-FVIII或LL-FIX的添加顯著增強針對FVIII和FIX的耐受性誘導，因為與對照以及游離FVIII和FIX組比較，脾細胞的因子特異性增殖應答在這個組中顯著減少。
[0196]LL-FIIIV和LL-FK增強與響應所沭閔子的減小的FVII1-和FK特異件滴度和IFN-Y以及更多的ILlO和TGF-β產(chǎn)生相關的口服耐受性。
[0197]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。脾細胞和淋巴結(jié)中響應所述因子的FVIII和FIX特異性抗體以及細胞因子產(chǎn)生如上所述進行定量。與對照和游離FVIII/IX組比較，在LL-FVIII/FIX組中抑制劑形成和促炎細胞因子IFN- Y的產(chǎn)生強烈減少，并且免疫抑制細胞因子IL-10和TGF- β顯著增加。
[0198]LL-FVI11/FIX經(jīng)由CD4+T細朐增強口服耐等件
[0199]為了評估CD4+T細胞是否介導口服耐受性的誘導，因子特異性增殖CD4+T細胞應答在脾細胞和淋巴結(jié)中進行研究。因此，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂，并且因子特異性CD4+T細胞增殖如細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定中所述進行測定。與對照和游離FVIII/IX組比較，LL-FVIII/FIX組中的因子特異性⑶4Τ細胞應答顯著減少。
[0200]在LL-FVIII/FIX處理后抗原誘導的T調(diào)節(jié)細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護避免抑制劑碰
[0201]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測試抗體形成的有效抑制，如上所述(體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測定)過繼轉(zhuǎn)移來自不同處理組的脾細胞。與對照和游離FVIII/IX組比較，抗因子IgG形成在LL-FVIII/FIX組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)⑶4+Τ細胞激活。
[0202]結(jié)論
[0203]我們的數(shù)據(jù)證實分泌重組FVIII或FIX的乳酸乳球菌的粘膜遞送在抑制血友病A和B小鼠中的FVII1-和FIX-特異性抑制劑的形成中分別比游離FVIII或FIX更有效。
[0204]實施例D:在分泌所述變應原的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導對變應原Der pi的耐受性
[0205]前言
[0206]變應性哮喘是氣道的慢性炎性病癥。它的特征在于可逆的氣道阻塞、變應原特異性免疫球蛋白E升高的血清水平、粘液分泌過多和對ronchospasmogenic刺激的氣道高應答性(AHR)。它的癥狀通過暴露于患者已對其致敏的變應原(例如，樹、草和雜草花粉、粉塵和塵螨、霉菌、動物毛屑)而變得更糟。2型T-輔助(Th2)淋巴細胞在疾病的起始、進展和持續(xù)中起關鍵作用。目前數(shù)據(jù)暗示對變應原的Th2應答通常由調(diào)節(jié)T細胞抑制。此外，由這個亞集進行的抑制在過敏個體中減少。此處，證實變應原經(jīng)由乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細胞而抑制哮喘樣應答。
[0207]材料與方法
[0208]模擬人疾病的2種變應性哮喘小鼠模型是Ova變應原模型和人源化SCID模型。
[0209]Ova變應原模型:0VA致敏的小鼠用OVA氣溶膠進行吸入攻擊，這導致Th2細胞因子依賴性 嗜酸性粒細胞性氣道炎癥、支氣管高反應性和IgE產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出人變應性哮喘的高度特征(Brusselle, 1994, Clin Exp Allergy24:73 ;Kips 等人 1996, Am J RespirCrit Care Medl53:535 ;Brusselle 等人 1995，Am J Respir Cell Mol Bioll2:254)。
[0210]細菌:乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細菌在GM17培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories,Detroit,MI)?所有菌株的貯備懸浮液于_20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋500倍，并且于30°C進行溫育。它們在16小時內(nèi)達到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細菌通過離心進行收獲，并且在BM9培養(yǎng)基中進行10倍濃縮。對于處理，每只小鼠通過胃內(nèi)導管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0211]質(zhì)粒:編碼原雞卵白蛋白的mRNA序列從Genbank (登記號AY223553)中檢索。從雞子宮中分離總RNA，并且在25 μ I體積中使用2 μ g總RNA、2 μ M寡核苷酸dT引物(Promega Corporation Benelux,Leiden,The Netherlands)』.0lmM DTT(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht, The Netherlands)』.5mM dNTP (Invitrogen, Merelbeke, Belgium)、20U Rnasin (Promega Incorporation Benelux)和 100U superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增OVA cDNA片段,使用下述條件:94°C 2分鐘，隨后為94°C 45秒、62°C 30秒和72°C 90秒的30個循環(huán)，使用下述正向和反向引物 5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3，(SEQ ID NO: 17)和 5’-ACTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’ (SEQ ID NO: 18)。
[0212]使擴增片段與乳球菌屬Pl啟動子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號融合。
[0213]用攜帶OVA cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的M G1363菌株命名為LL-0VA。其為包含空載體的MG1363 的 LL-pTREXl 充當對照。
[0214]OVA的定量:來自LL-OVA的OVA使用內(nèi)部開發(fā)的OVA特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進行測定。重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生也通過蛋白質(zhì)印跡分析進行評估。
[0215]小鼠:BALB/c小鼠(6-8 周大)購自 Charles River Laboratories(Calco, Italy)。小鼠在特定無病原體條件下維持。
[0216]小鼠的免疫:小鼠用在Img氫氧化鋁(alum)中的10 μ g OVA (V級別；Sigma-Aldrich)進行腹膜內(nèi)免疫。這種免疫在21天后進行重復(在第O和21天時)。對照小鼠接受鹽水注射代替OVA/alum溶液。免疫后26天，致敏的小鼠吸入在PBS中溶解的I %OVA的氣溶膠化溶液10分鐘。OVA吸入連續(xù)進行3天(第47、48和49天)。對照小鼠在用于實驗組的相同條件下吸入單獨的PBS。
[0217]口服耐受性的誘導:小鼠在第0-4、7-11、14_18和21-25天時接受LL-0VA、LL-pTREXlU μ g OVA或BM9。作為口服耐受性誘導的陽性對照，小鼠通過胃內(nèi)導管飼喂30mg0VA，其減少支氣管嗜酸性粒細胞增多和氣道高應答性，其中高劑量飼喂比低劑量飼喂更有效。
[0218]氣道高應答性(AHR)的測量:最后吸入后24小時(第50天)，氣道高應答性通過乙酰甲膽堿誘導的氣流阻塞進行評估。小鼠暴露于霧化生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical)之^分鐘^逭后為增加劑量^^。!^/!^)的霧化乙酰甲膽堿。在噴霧作用后將這些小鼠置于整體體積描記器中2.5分鐘，并且使用Biosystem XA WBP系統(tǒng)(Buxco Electronics)測量增強的間歇(Penh)?！癙enh”代表肺氣流阻塞并且使用下式進行計算:Penh= ((Te-Tr)/(Tr xPEF/PIF))，其中Penh=增強的間歇(無量綱的)，Te=呼氣時間(秒)，Tr=松弛時間(秒)，PEF=呼氣流量峰值(毫升/秒)，和PIF=吸氣流量峰值(毫升/秒)。Penh約每5秒進行測量且求平均值，并且累積值平均為每個時間點的Penh值。氣道高應答性表示為PC200Mch(乙酰甲膽堿的200%激發(fā)濃度)，這是雙倍基線Penh值的乙酰甲膽堿濃度。
[0219]支氣管肺泡灌洗液(BALF)分析:在氣道高應答性測量后，獲得支氣管肺泡灌洗樣品。小鼠通過腹膜內(nèi)注射過量氯胺酮和賽拉嗪實施安樂死，隨后肺用0.5ml鹽水灌洗4次。將灌洗液離心，并且使細胞重懸浮于具有1% BSA的Iml鹽水中。使用血球計數(shù)器計數(shù)總細胞數(shù)目。通過使懸浮液在300rpm下離心5分鐘制備Cytospin樣品。為了明確區(qū)分嗜酸性粒細胞與嗜中性粒細胞，應用3種不同染劑:Diff-Quick、May-Griinwald-Giemsa和Hansel(曙紅)染劑。基于標準形態(tài)學標準通過光學顯微鏡檢查區(qū)分至少300個白細胞。BALF中的IL_13、IL_4 和 IL-5 水平通過 Cytometric Bead Assay (BD Biosciences,Mountain View,CA，USA)根據(jù)制造商的說明書進行檢測。
[0220]血清總IgE和OVA特異性Ig的測量:在第50天時，在麻醉下從眶后竇獲得血樣。在樣品已完全凝固后，將它們離心，并且收集血清且貯存于_80°C直至使用?？侷gE通過ELISA使用配對Ab (BDPharmingen)根據(jù)制造商的說明書進行測定。為了測量血清中的 OVA 特異性 IgE、IgGl 和 IgG2a，用 2 μ g/ml OVA 包被微量滴定板(Maxisorp，Nunc, VffRInternational, Haasrode, Belgium)。隨后,用在PBS中的0.1 %酪蛋白封閉孔,這之后使平板與在包含0.1 %酪蛋白和0.05% Tween20的PBS (PBS-CT)中以1:10-1:20480稀釋的小鼠血清樣品一起溫育，使用山羊抗小鼠IgG2a_HRP [SouthernBiotechnology Associates(SBA), Imtec ITK Diagnostics, Antwerpen,Belgium, 1:5000 稀釋]、山羊抗小鼠 IgGl-HRP或山羊抗小鼠IgE-HRP (SBA, 1:5000稀釋)。洗滌后，向每個孔中加入底物[3，3，，5，5’四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物試劑，Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]。最后，通過向孔中加入IM H2SO4來終止反應。吸光度在450nm處讀取。ELISA得分表示為滴度，其是仍具有比計算的截止值更高的OD45tl的最高稀釋度的倒數(shù)。截止值計算為伴隨3倍SD增加的5只非免疫小鼠的平均0D45Q。
[0221]肺組織的組織學檢查:獲得支氣管肺泡灌洗樣品后，使肺充滿生理鹽水并且從小鼠中切除。用中和緩沖的福爾馬林使肺固定，并且在石蠟中進行包埋。切片(3-μπι厚)用Η&Ε或過碘酸-希夫(PAS)進行染色。肺中的組織學改變強度用4級得分進行評估(0，無炎癥；1，輕度/弱；2，中等；和3，重度)，根據(jù)下述發(fā)現(xiàn)的分布和強度:I)上皮脫落或支氣管上皮細胞核的波動(undulation)，2)杯形細胞數(shù)目的增加，3)炎性細胞從血管到支氣管和支氣管周間質(zhì)的粘膜和粘膜下層區(qū)域內(nèi)的浸潤，和4)平滑肌細胞層的肥大和增厚。
[0222]用于分析肺中的細胞因子和趨化因子基因表達的RT-PCR:在用生理鹽水灌注后摘除肺，并且根據(jù)制造商的說明書使用ISOGEN (Nippon Gene)提取總RNA?？俁NA (IOyg)使用寡核苷酸(dT)15 引物(Promega)和 Superscript II RNA 酶 H-逆轉(zhuǎn)錄酶(InvitrogenLife Technologies)于42°C逆轉(zhuǎn)錄2小時。為了確保每個樣品包含相同量的cDNA，使用β-肌動蛋白特異性引物首先測定每種樣品的β_肌動蛋白cDNA濃度。使這些樣品擴增合適的循環(huán)數(shù)目，從而使得PCR產(chǎn)物量保持在擴增曲線的線性部分上。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并且通過溴化乙啶染色進行顯現(xiàn)。IL-13、eotaxin、IL-10、IFN-Y和TGF-β的水平使用下述特定引物組進行測定。
[0223]用于 β-肌動蛋白的有義引物 5’ -ACGACATGGAGAAGATCTGG-3’ (SEQ ID NO:19),和
[0224]反義引物5’ -TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3’(SEQ ID NO:20)。
[0225]用于IL-13 的有義引物 5’ -TCTTGCTTGCCTTGGTGGTCTCGC-3’ (SEQ ID NO:21)，和
[0226]反義5’ -GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3’(SEQ ID NO:22)。
[0227]用于eotaxin 的有義引物 5’ -GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3’ (SEQ ID NO:23),和
[0228]反義引物5’ -CACTTCTTCTTGGGGTCAGC-3’(SEQ ID NO:24)。
[0229]用于IL-10 的有義引物 5’ -TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3’ (SEQ ID NO:25)，和
[0230]反義5’ -GCATAGAAGCATACATGATG-3’ (SEQ ID NO:26)。
[0231]用于IFN-Y 的有義引物 5’ -CATAGATGTGGAAGAAAAGA-3’ (SEQ ID NO:27)和
[0232]反義5’ -TTGCTGAAGAAGGTAGTAAT-3’ (SEQ ID NO:28)。
[0233]用于TGF-β 的有義引物 5’ -CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3’ (SEQ ID Ν0:29)，和
[0234]反義5’ -CAGGAGCGCACAATCATGTT-3’ (SEQ ID NO:30)。
[0235]細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定:最后吸入后I天(第50天)，通過使細胞通過70-μ m細胞過濾器(Becton/Dickinson Labware)制備脾和縱隔淋巴結(jié)的單細胞懸浮液。通過與紅細胞裂解緩沖液一起溫育從脾細胞懸浮液中去除紅細胞。⑶4+T細胞和⑶4+⑶25_T細胞分別使用CD4+T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)或CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,Germany),以及MACS 柱(midiMACS ；Miltenyi Biotec)進行富集。
[0236]對于大量脾細胞和LN群體的增殖測定，2xl05細胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中單獨或與純化的OVA —起進行培養(yǎng)。OVA以1-100 μ g/ml的濃度加入。對于⑶4+T細胞和⑶4+⑶251細胞群體的增殖測定，2xl05個⑶4+T細胞或^4+^251細胞在96孔U形底平板中與絲裂霉素處理的脾細胞一起，以⑶4+T細胞或⑶4+⑶25-T細胞/APC1/1U/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，所述脾細胞裝載有l(wèi)mg/ml OVA,充當抗原呈遞細胞。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時后，通過加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來評估增殖。在18小時后在玻璃纖維濾器墊(PerkinElmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性,并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
[0237]對于細胞因子測量，在培養(yǎng)24、48和72小時后收集在不同增殖測定中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進行冷凍直至執(zhí)行細胞因子分析。細胞因子產(chǎn)生使用MouseInflammation Cytometric Bead Array (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進行定量。
[0238] 體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測定:最后吸入后I天(第21天)，經(jīng)處理的小鼠的脾用0.1%膠原酶(Sigma-Aldrich)于37°C消化20分鐘。在某些實驗中，制備整體脾細胞的單細胞懸浮液，并且與Con Α(2 μ g/ml ;Sigma_Aldrich)—起培養(yǎng)48小時。收集細胞，并且將IO7細胞靜脈內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移到首次用于實驗的BALB/c小鼠內(nèi)。對于陰性選擇，根據(jù)制造商的說明書，使用具有生物素化的抗小鼠⑶4、⑶8、⑶11c、⑶19和⑶lib mAb (BD Pharmingen)的磁珠(MACS ；Miltenyi Biotec)使 CD4+、CD8+、CDllc+、CD19+ 或 CDllb+ 細胞從整體脾細胞中耗盡。通過流式細胞術(shù)檢查耗盡的效率(>99%)。⑶4+、⑶4+⑶25_細胞使用⑶4+T細胞分離試劑盒、調(diào)節(jié)T細胞分離試劑盒遵循制造商的說明書進行純化。使用流式細胞術(shù)檢查陽性選擇的細胞的純度。對于細胞轉(zhuǎn)移實驗，緊在它們用OVA/alum進行第一次免疫前或進行第二次免疫后，細胞從尾靜脈轉(zhuǎn)移到BALB/c小鼠內(nèi)。轉(zhuǎn)移細胞的數(shù)目對于整體脾細胞、亞群耗盡的脾細胞、或陽性選擇的CD4+細胞和CD4+CD25_細胞是107。
[0239]在人源化的SCID (hu-SCID)模型中(如由Duez等人，2000 ;Hammad等人，2000描述的)
[0240]在這個模型中，可以研究對房塵螨(HDM)變應原Der pi的變應性免疫應答。此種hu-SCID小鼠用來自HDM過敏患者的PBMC進行腹膜內(nèi)重構(gòu)，并且隨后暴露于HDM的氣溶膠，從而產(chǎn)生人IgE，發(fā)展由活化T細胞和DC組成的肺浸潤，并且響應支氣管收縮劑顯示AHR(Pestel 等人 1994, J Tmmunol , 153:3804 ；Duez 等人，Am J Respir Crit Care Med,第 161卷，第 200-206 頁，2000)。
[0241]細菌
[0242]乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細菌在GM17培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌株的貯備懸浮液于-20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進行溫育。它們在16小時內(nèi)達到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細菌通過離心進行收獲并且在BM9培養(yǎng)基中進行10倍濃縮。對于處理，每只小鼠通過胃內(nèi)導 管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0243]質(zhì)粒
[0244]Der pi, 222個氨基酸殘基的球狀糖蛋白，是來自屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus) (Dpt)的主要變應原之一。合成編碼Der pi蛋白質(zhì)的具有最佳乳酸乳球菌密碼子使用的DNA序列，進行擴增且將其與乳球菌屬Pl啟動子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號融合。用攜帶鼠類Der pl、Der plaa52_71和Der plaall7_133cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的 MG1363 菌株命名為 LL-Derpl、LL-Derplaa52-71 和 LL_Derplaall7_133。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當對照。
[0245]Der pi 的定量
[0246]來自LL-Derpl的Der pi使用內(nèi)部開發(fā)的Der pi特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進行測定。重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生也通過蛋白質(zhì)印跡分析進行評估。
[0247]患者
[0248]從對房塵螨敏感或不敏感的供體中收集血液。過敏患者呈現(xiàn)房塵螨致敏的通常特征。針對屋塵螨(Dpt)變應原的皮膚點刺測試(StallergSnes, Fresnes, France)(直徑≥IOmm)是陽性的，并且所有患者具有血清特異性IgE抗體?？侷gE濃度超過150IU/ml(150-1600IU/ml)。健康供體作為陰性對照進行測試(總IgE水平小于150IU/ml，并且它們針對通常吸入的變應原具有陰性的皮膚點刺測試)。
[0249]人外周血單核細胞制備
[0250]在離心(120x g，15分鐘)后獲得富含血小板的血漿且棄去。血細胞隨后在RPMI1640 (Life Technologies, Paisley, Scotland)(體積 / 體積)中進行稀釋，并且在Ficoll 梯度(Pharmacia, Uppsala, Sweden)上分層。離心(400x g，30 分鐘)后，在界面處收獲PBMC，并且在轉(zhuǎn)移前在無菌RPMI培養(yǎng)基中洗滌3次。[0251]小鼠
[0252]C.B.-17SCID小鼠(6_8周大)維持在特定動物實驗室中的具有無菌墊層的隔離器中。SCID集落通過ELISA就小鼠血清免疫球蛋白的不存在進行定期檢查。
[0253]在SCID小鼠中的外周血單核細胞轉(zhuǎn)移:PBMC hu-SCID小鼠
[0254]SCID小鼠在細胞轉(zhuǎn)移時為6-8周大。小鼠通過經(jīng)由23號針腹膜內(nèi)注射在400 μ IRPMI中的來自過敏患者或健康供體的IOxlO6單核細胞進行重構(gòu)。在同一天，它們腹膜內(nèi)接受2指數(shù)反應性(index reactivity) [IR]單位Dpt。細胞重構(gòu)后4天,使SCID小鼠每天暴露于包含100IR單位Dpt (100IR單位等價于包含在Dpt提取物中的約200 μ g蛋白質(zhì))的變應原氣溶膠，進行連續(xù)4天(第O天-第4天)。對照組不暴露于Dpt。氣道應答性測量前I天(第35天和第60天)，使hu-SCID小鼠暴露于另一個100IR單位Dpt溶液的氣溶膠。
[0255]實驗設置
[0256]小鼠接受經(jīng)改造以表達Der pi或作為陰性對照的無關抗原(OVA)的乳酸乳球菌。
[0257]改造的乳酸乳球菌細菌使用胃導管經(jīng)口施用于SCID小鼠，在PBMC重構(gòu)后I天開始且使用不同處理間隔和劑量。通過測量人血清IgE抗體、分析肺浸潤、測量AHR以及分析在BALF中的細胞群 和細胞因子產(chǎn)生來評估口服耐受性的誘導。此外，耐受性的誘導通過分析針對Derpl的增殖T細胞應答進行評估。
[0258]氣道應答性(AHR)的評估
[0259]氣道應答性(表示為引起肺阻力增加50%的氨甲酰膽堿的激發(fā)劑量)在第35天或第60天時進行測量，如由Duez等人2000描述的。
[0260]人IgE測量
[0261]用人細胞移植后數(shù)天，小鼠在麻醉下從眶后竇進行采血?？?cè)薎gE通過雙位點免疫放射測定方法進行研究，使用對于ε -鏈特異的2種不同小鼠mAb (ImmunotechInternational, Luminy,France)ο在一式兩份的測試中使用至少20 μ I血清。該方法的靈敏度允許檢測 0.1IUiml (0.24ng/ml)。
[0262]抗Dpt變應原的特定IgE Ab通過ELISA進行定量。簡言之，塑料管(MaxisorbStartube, Nunc, Denmark)用在0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的Dpt變應原于4°C包被過夜，并且用在0.1M PBS (pH7.4)中的1% BSA在室溫下飽和2小時。洗滌后，管與在包含BSA (1%)和Tween (0.01 %)的PBS中稀釋的Hu-SCID小鼠血清在室溫下溫育2小時，并且于4°C溫育過夜。充分洗滌后，加入HRP標記的抗人IgE Ab。洗滌后，向每個孔中加入底物[3,3，,5,5，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物試劑，Pharmingen, Becton Dickinson,Erembodegem, Belgium] ?最后，通過向孔中加入IM H2SO4來終止反應。吸光度在450nm處讀取。
[0263]肺的組織學檢查
[0264]肺在第35天時進行切除，并且在低聚甲醛中進行固定，并且進行加工以用于石蠟包埋。石蠟組織切片進行染色以檢測人⑶45+細胞，這之后鼠類肺切片上的人細胞通過組織學評分進行定量，如由Duez等人2000描述的。
[0265]支氣管肺泡灌洗液(BALF)的分析
[0266]BALF如OVA變應原模型中所述進行分析。
[0267]細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定:[0268]通過使細胞通過70 μ m細胞過濾器(Becton/Dickinson Labware)制備脾的單細胞懸浮液。通過與紅細胞裂解緩沖液一起溫育從脾細胞懸浮液中去除紅細胞。CD4+T細胞和CD4+CD25_T細胞分別使用人CD4+T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)或人CD4+CD25+調(diào)節(jié) T 細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)以及 MACS 柱(midiMACS ；Miltenyi Biotec)進行富集。
[0269]對于大量脾細胞的增殖測定，2xl05細胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨或具有純化的Der p1、并且含或不含抗-1L-1O或抗-TGF-β中和單克隆抗體。Der pi以1-100 μ g/ml的濃度加入。中和抗體以1、0.1和0.01 μ g/ml加入。對于人⑶4+T細胞和人⑶4+⑶25—T細胞群體的增殖測定，2xl05個⑶4+T細胞或⑶4+⑶25_T細胞在96孔U形底平板中與絲裂霉素處理的人PBMC —起，以⑶4+Τ細胞或CD4+CD25-T細胞/APC1/1U/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，所述培養(yǎng)基含或不含中和抗體，所述人PBMC裝載有l(wèi)mg/ml Der pl，充當抗原呈遞細胞。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時后，通過加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來評估增殖。在18小時后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
[0270]對于細胞因子測量，在培養(yǎng)24、48和72小時后收集在不同增殖測定中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進行冷凍直至執(zhí)行細胞因子分析。細胞因子產(chǎn)生使用HumanInflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進行定量。 [0271]結(jié)果
[0272]LL-OVA和LL-Der pl分別在哮喘的0VA-和huSCID小鼠樽型中顯著增強耐等件誘導能力。
[0273]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。LL-OVA/Derpl的添加顯著增強針對0VA/Derpl的耐受性誘導，因為與對照以及游離0VA/Derpl組比較，脾細胞的變應原特異性增殖應答在LL-OVA/Derpl組中顯著減少。
[0274]LL-OVA/Derpl增強與響應所述變應原的減少的AHR，嗜酸性粒細胞性浸潤，血 清I迚水平，以及減少的IL-13、IL-4和IL-5細胞因子產(chǎn)生相關的口服耐受性。
[0275]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。響應所述抗原的AHR、嗜酸性粒細胞性BALF浸潤、IgE滴度以及細胞因子產(chǎn)生如上所述進行測定。與對照和游離0VA/Derpl組比較，在LL-OVA/Derpl組中AHR、嗜酸性粒細胞性BALF浸潤、IgE滴度顯著減少，并且IL-13、IL-4和IL-5顯著降低。
[0276]LL-OVA/Derpl經(jīng)由CD4+T細朐增強口服耐等件。
[0277]為了評估CD4T細胞是否介導口服耐受性的誘導，變應原特異性增殖CD4T細胞應答在脾細胞和淋巴結(jié)中進行研究。因此，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂，并且變應原特異性CD4+T細胞增殖如細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定中所述進行測定。與對照和游離0VA/Derpl組比較，LL-OVA/Derpl組中的變應原特異性⑶4T細胞應答顯著減少。
[0278]在LL-OVA處理后抗原誘導的T調(diào)節(jié)細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護避免哮喘樣應答
[0279]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測試哮喘樣應答的有效抑制，如上所述(體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測定)過繼轉(zhuǎn)移來自不同處理組的脾細胞。與對照和游離OVA組比較，哮喘樣應答在LL-OVA組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)CD4+T細胞激活。
[0280]結(jié)論
[0281]我們的數(shù)據(jù)證實分泌變應原的乳酸乳球菌的粘膜遞送比游離變應原更有效地經(jīng)由誘導抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細胞來誘導變應原特異性免疫耐受性，即使在建立的超敏性的背景中。
[0282]實施例E:在分泌所述變應原的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導對BLG食物變應原的耐受性
[0283]前言
[0284]食物過敏是影響約2 % -5 %人口的疾病。在人類中，升高的IgE抗體以及產(chǎn)生IL_4的、抗原特異性T淋巴細胞的存在暗示Th2傾斜(Th2-skeWed)機制。此處，證實食物變應原通過乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細胞而抑制變應原特異性免疫應答。[0285]實施例的材料與方法
[0286]細菌和質(zhì)粒
[0287]乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細菌在GM17培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌株的貯備懸浮液于-20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進行溫育。它們在16小時內(nèi)達到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細菌通過離心進行收獲并且在BM9培養(yǎng)基中進行10倍濃縮。對于處理，每只小鼠通過胃內(nèi)導管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0288]牛β -乳球蛋白cDNA進行擴增，且與乳球菌屬Pl啟動子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號融合。
[0289]用攜帶鼠類BLG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為LL-BLG。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當對照。
[0290]牛β -乳球蛋白(BLG)的定量
[0291]來自LL-BLG的BLG使用內(nèi)部開發(fā)的BLG特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡分析進行測定。
[0292]實驗設置
[0293]用于研究乳酸乳球菌的保護效應的食物過敏鼠類模型是食物誘導的IgE型應答的小鼠模型，如由 Frossard 等人(J Allergy Clin Immunol 113:958-964, 2004)描述的。小鼠接受LL-BLG或作為陰性對照的無關抗原(0VA)。作為耐受性誘導的陽性對照，小鼠接受在飲用水中的高劑量BLG，其在用BLG經(jīng)口攻擊后使小鼠免于過敏反應(anaphylaxis)。
[0294]在預防背景中，產(chǎn)生BLG的經(jīng)改造的乳酸乳球菌細菌使用胃導管經(jīng)口施用于小鼠，使用不同的處理間隔和劑量。隨后，這些接受小鼠在霍亂毒素的存在下用純化的BLG抗原進行經(jīng)口攻擊。使對照動物暴露于用不表達BLG (但表達0VA)的對照載體改造的乳酸乳球菌。通過測量血清和糞便中的BLG特異性IgGl、IgG2a和IgE滴度，通過測定脾和PP中的抗體分泌細胞數(shù)目，通過分析MLN、PP和脾中的T細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生，在胃內(nèi)抗原攻擊后分析過敏反應，從而評估耐受性的誘導。[0295]為了評估針對BLG的免疫耐受性的誘導是否可以通過乳酸乳球菌增強，對小鼠施用 LL-BLG 或 I μ g 游離 BLG。
[0296]BLG的經(jīng)口致敏。
[0297]4-5周大的雌性C3H/He0uJ小鼠(Charles River)在第O、7、14和21天時通過用在 0.2mol/L NaHCO3 中的購自 List Biological Laboratories 的 20mg BLG (Sigma)和IOug CTX胃內(nèi)管飼(gavage)進行免疫。陽性對照組(耐受的小鼠)隨意接受在其飲用水中的0.8mg/mL BLG，進行4周。給予的蛋白質(zhì)總量(22.4mg)類似于給予致敏小鼠的BLG總量。為了證實耐受操作也持久地激活外周以及粘膜免疫系統(tǒng)，耐受小鼠組在第28和42天時用吸附于Img alum的80 μ g ip BLG注射2次。
[0298]抗原攻擊
[0299]在第28天時，所有小鼠通過用在0.4mL0.2mol NaHC03中的IOOmg BLG胃內(nèi)管飼進行攻擊。觀察到過敏反應，并且通過使用其他地方詳細描述的(Frosssard等人,2001)反應得分(0，無反應，至3，嚴重反應或死亡)進行分級。核心體溫在攻擊前和管飼后30分鐘在耳處通過紅外線進行測量。處死動物，并且血液通過心臟穿刺收集到含EDTA的管內(nèi)，并且獲得血衆(zhòng)以用于通過商業(yè)ELISA試劑盒(Immunotech,MarseiIle,France)進行的組胺測量。
[0300]細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定:
[0301]脾、腸系膜淋巴結(jié)和PP的單細胞懸浮液如由Frossard等人(2004)所述進行制備。CD4+T細胞和CD4+CD25-T細胞分別使用CD4+T細胞分離試劑盒(MiItenyi Biotec，Germany )或 CD4+CD25+ 調(diào)節(jié) T 細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)以及 MACS 柱(midiMACS ；Miltenyi Biotec)進行富集。
[0302]對于大量脾細胞和LN群體的增殖測定，2xl05細胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨或具有純化的BLG，并且含有或不含抗-1L-1O或抗TGF-β中和單克隆抗體。BLG以1-100 μ g/ml的濃度加入。中和抗體以1、
0.1和0.01 μ g/ml加入。對于⑶4+T細胞和⑶4+⑶25飛細胞群體的增殖測定，2xl05個⑶4+T細胞或⑶4+⑶25_T細胞在96孔U形底平板中與絲裂霉素處理的脾細胞一起，以⑶4+Τ細胞或⑶4+⑶25_Τ細胞/APC1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在含或不含中和抗體的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，所述脾細胞裝載有l(wèi)mg/ml BLG，充當抗原呈遞細胞。于37 °C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時后，通過加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來評估增殖。在18小時后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
[0303]對于細胞因子測量，在培養(yǎng)24、48和72小時后收集在不同增殖測定中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進行冷凍直至執(zhí)行細胞因子分析。細胞因子產(chǎn)生使用MouseInflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進行定量。
[0304]體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測定
[0305] 為了測試抗體形成在小鼠中的有效抑制，將從不同實驗乳酸乳球菌處理的組中分離的脾細胞、珠純化的⑶4+T細胞、⑶4+⑶25_或⑶4+⑶25+T細胞過繼轉(zhuǎn)移給首次用于實驗的C3H/He0uJ小鼠。未處理的小鼠用作對照。轉(zhuǎn)移細胞的數(shù)目對于整體脾細胞、亞群耗盡的脾細胞、或陽性選擇的⑶4+細胞以及⑶4+CD25_和⑶4+⑶25+T細胞是107。如果牽涉TregJP么這些小鼠用BLG抗原的后續(xù)攻擊應阻止針對BLG的體液免疫應答的誘導和過敏反應。
[0306]用于BLG特異性血清和糞便抗體的酶聯(lián)免疫測定。
[0307]在第0、7、14、21和28天時通過尾部采血獲得血清。同時獲得糞便，并且重懸浮于補充有 0.lmg/mL 的胃酶抑素(P印statin) 1:1000 (Fluka)的 PBS 加 I % FCS (Lifetechnologies)中。樣品進行機械解聚，并且潤旋2分鐘，隨后2次于4°C在14，OOOrpm下離心20分鐘。
[0308]血清和糞便通過從Adel-Patient等人(2000, J.1mmunol Methods)改良的方法就BLG特異性IgE、IgGl、IgG2a和/或IgA抗體水平進行測定。簡言之，MaxiSorp微量滴定板(Nunc)在室溫下用250ng/孔鏈霉抗生物素蛋白(Fluka)包被18小時，隨后用300 μ L聚乙烯吡咯烷酮K25(Fluka)溶液包被過夜。I微克生物素化的BLG溫育3小時，并且在0.5 μ g/mL山羊抗小鼠IgA、大鼠抗小鼠IgGl或抗小鼠IgG2a過氧化物酶標記的抗體(SouthernBiotechnologies)的存在下,一式兩份地加入在PBS加10%馬血清中的稀釋血清(1:6666和 1:2222 用于 IgGlU:666 和 1:222 用于 IgG2a、l:66 和 1:22 用于 IgE)或糞便(1:3、1:10和1:33)，溫育2小時。對于IgE測量，加入單克隆大鼠抗小鼠IgE Ab (克隆R35-72，BDPharmingen),隨后加入過氧化物酶偶聯(lián)的抗大鼠Ab (Caltag)。光密度在490nm處進行測量。結(jié)果表示為任 意單位，且來自BLG加alum免疫的小鼠的混合血清用作參考血清。
[0309]抗原特異性抗體產(chǎn)生通過ELISP0T方法進行測量。
[0310]淋巴集結(jié)(Peyer’s patches)機械地從腸切除，并且在補充有5mmol EDTA (LifeTechnologies)的HBSS培養(yǎng)基中溫育30分鐘。類似地，將淋巴集結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)輕輕壓碎，并且通過70-μ m尼龍濾器進行過濾。脾細胞在Tris緩沖的NH4Cl中預溫育5分鐘以去除紅細胞。淋巴母細胞在PercollGO1^ /66%梯度(Amersham)上進行分離。
[0311]對于BLG特異性IgGU IgG2a和IgA抗體的測量，ELISP0T平板(Millipore)用鏈霉抗生物素蛋白于37°C包被過夜，隨后添加Iyg生物素化的BLG并溫育3小時。在Percoll60% /66 %梯度上分離的淋巴母細胞以2個不同濃度(I和2X106)重懸浮于Iscove's改良的Dulbecco’ s培養(yǎng)基中并于37°C溫育24小時,所述培養(yǎng)基補充有青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺、慶大霉素、多粘菌素B和5% FCS，隨后與抗-1gA、抗-1gGl和抗-1gG2a抗體(Southern Biotechnology)—起于4°C溫育過夜。加入氨基乙基咔唑100 μ L/孔并溫育10分鐘，并且通過使用KS ELISP0T4.2.1Software (Zeiss)自動計數(shù)斑點，且將其表示為細胞形成單位/IO6細胞(CFU)。
[0312]LL-BLG在食物過敏鼠類模型中顯著增強BLG的耐受性誘導能力
[0313]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。LL-BLG的添加顯著增強針對BLG的耐受性誘導，因為與對照以及游離BLG組比較，脾細胞的變應原特異性增殖應答在LL-BLG組中顯著減少。
[0314]LL-BLG增強與響應所述變應原的減少的BLG特異性抗體應答和降低的IL_4細胞因子產(chǎn)生相關的口服耐受性。
[0315]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。響應所述因子的BLG特異性抗體應答和細胞因子產(chǎn)生如上所述進行測定。與對照和游離BLG組比較，BLG特異性抗體水平和IL-4在LL-BLG組中顯著減少。[0316]結(jié)果
[0317]LL-BLG經(jīng)由CD4+T細朐增強口服耐等件。
[0318]為了評估CD4T細胞是否介導口服耐受性的誘導，變應原特異性增殖CD4T細胞應答在脾細胞和淋巴結(jié)中進行研究。因此，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂，并且變應原特異性CD4+T細胞增殖如細胞培養(yǎng)、增殖和細胞因子測定中所述進行測定。與對照和游離BLG組比較，LL-BLG組中的變應原特異性⑶4T細胞應答顯著減少。
[0319]在LL-BLG處理后抗原誘導的T調(diào)節(jié)細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護避免過敏樣應答
[0320]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測試過敏樣應答的有效抑制，如上所述(體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測定)過繼轉(zhuǎn)移來自不同處理組的脾細胞。與對照和游離BLG組比較，過敏樣應答在LL-BLG組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)CD4+T細胞激活。
[0321]結(jié)論
[0322]我們的數(shù)據(jù)證實分泌變應原的乳酸乳球菌的粘膜遞送比游離變應原更有效地經(jīng)由誘導抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細胞來誘導變應原特異性免疫耐受性。
[0323]實施例F:在分泌所述自身抗原的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導對胰島素的耐受性
[0324]前言
[0325]自身免疫的特征在于由對自體抗原的耐受性的喪失導致的自發(fā)性炎性組織損害和損傷的生理功能。它與部分過度活躍的免疫系統(tǒng)相關，所述免疫系統(tǒng)特征在于過量的T輔助(Th)細胞。誘病因素例如易感基因和環(huán)境因素難以影響，因此，開發(fā)免疫治療的近期努力集中于重新建立病原性效應細胞和免疫調(diào)節(jié)T細胞之間的功能平衡(通過耗盡前者和/或增強后者)。胰島β細胞的自身免疫破壞是I型糖尿病(TlD)的主因。這種破壞與針對幾種β細胞自身抗原的細胞和體液免疫應答相關，這兩種應答可以在疾病的臨床發(fā)作之前。
[0326]此處，證實自身抗原遞送乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細胞而抑制糖尿病特異性免疫應答。
[0327]材料與方法
[0328]細菌和質(zhì)粒
[0329]乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細菌在GM17培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補充有0.5%葡萄糖的Μ17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌株的貯備懸浮液于-20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進行溫育。它們在16小時內(nèi)達到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細菌通過離心進行收獲并且在BM9培養(yǎng)基中進行10倍濃縮。對于處理，每只小鼠通過胃內(nèi)導管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0330] 合成編碼人胰島素原II B24-C36肽(hpllp)、豬胰島素和免疫顯性肽InsB9_23(B9-23在許多物種包括人、大鼠和小鼠中基本上相同)的具有最佳乳酸乳球菌密碼子使用的DNA序列，進行擴增且將其與乳球菌屬Pl啟動子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號融合。
[0331]用攜帶鼠類hpllp、胰島素、InsB9_23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為LL_hpIIp、LL-胰島素、LL-1nsB9_23。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當對照。這些蛋白質(zhì)的表達使用抗原特異性ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析進行測定。
[0332]小鼠
[0333]非肥胖雌性和雄性糖尿病(NOD)小鼠和NOD嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID) (Balb/c背景)小鼠購自Jackson實驗室。Balb/c野生型(WT)小鼠購自Charles River Italy。小鼠維持于特定無病原體中心動物實驗室中。小鼠依照機構(gòu)指導進行處理和使用。
[0334]實驗設置
[0335]在預防背景中，LL-hpIIp、LL_胰島素、LL-1nsB9_23從第21天大時(斷奶)開始經(jīng)口施用于NOD小鼠，使用最佳飼喂方案或直至100天大時(此時大多數(shù)小鼠發(fā)展糖尿病)。此外，LL-pTINX作為陰性對照進行經(jīng)口施用。對于陽性(耐受)對照組，3周大的NOD小鼠用0.8mg人胰島素/hpIIp/InsB9_23進行經(jīng)口處理,每周3次,進行2或4周。糖尿病的發(fā)展通過每周3次連續(xù)監(jiān)控尿糖水平進行測定，并且在糖尿的情況下監(jiān)控血糖水平。在12-23周時以及在實驗結(jié)束時(35周)收集胰腺，并且連續(xù)切片用蘇木精/曙紅染色以對單核細胞浸潤評分，或通過免疫組織化學以分析T細胞浸潤。
[0336]在治療背景中，LL-hpIIp、LL-膜島素、LL_InsB9_23經(jīng)口施用于顯不穩(wěn)定糖尿和聞血糖癥的糖尿病NOD雌性(12-23周)。此外，LL-pTINX作為陰性對照進行經(jīng)口施用。對于陽性(耐受)對照組，糖尿病NOD小鼠如Bresson等人2006中所述進行處理。完全緩解定義為糖尿的消失和回復正常血糖。
[0337]在同基因島移植背景中，具有近期發(fā)作的糖尿病的雌性NOD小鼠用LL-hpIIp、LL-胰島素、LL-1nsB9_23或用作為陰性對照的LL-pTINX經(jīng)口處理3周。3周后，將來自非糖尿病NOD小鼠的500個新近分離的胰島移植給糖尿病NOD小鼠。血糖隨后每周監(jiān)控3次，直至糖尿病復發(fā)或直至移植后15周時。具有連續(xù)2次葡萄糖水平> 250mg/dL的動物視為患有糖尿病，并且隨后將其處死用于血清收集和移植物的組織學分析。
[0338]耐受性誘導的精確機制在用特定自身抗原再攻擊NOD小鼠后通過將T細胞過繼轉(zhuǎn)移到NOD-SCID小鼠內(nèi)在體外、在體內(nèi)進行分析。
[0339]糖尿病的檢測:
[0340]葡萄糖監(jiān)控:尿糖通過使用Diastix (Miles)進行測量，并且通過血糖測量用血糖監(jiān)控系統(tǒng)OneTouch Ultra (LifeScan Inc.)加以證實。糖尿病定義為連續(xù)2次血糖值超過 250mg/dl。
[0341]胰島炎:通過CO2窒息殺死小鼠，并且胰腺在10%福爾馬林中固定過夜，在石蠟中進行包埋，并且連續(xù)5μπι切片用蘇木精和曙紅進行染色。胰島炎得分(平均值土SD)通過用顯微鏡將10-15個島/小鼠中的細胞浸潤程度如下分級進行測定:0，無可見的島浸潤標志；1，島周圍浸潤；2,〈50%浸潤；3, >50%浸潤。
[0342]島分離和移植:通過在劇烈振蕩過程中用在Hanks’平衡鹽溶液中的膠原酶消化胰腺進行無菌去除后分離無胰島炎和糖尿病的14-21天大的供體NOD小鼠的島。通過在立體顯微鏡下的直接人工挑選進行島分離。糖尿病受體NOD小鼠通過腹膜內(nèi)注射阿佛丁(0.02ml/g BWT)進行麻醉，經(jīng)由腰部切開暴露左腎，并且在腎小囊下給予500個新近分離的
島O
[0343]免疫組織化學[0344]為了檢測在胰腺β細胞中的胰島素、⑶4和⑶8表達，將一抗(來自Dako的豚鼠抗豬胰島素[稀釋度1:300]、來自BD Biosciences的抗-CD4RM4.5和抗_CD8a IHC[稀釋度1:50])應用于冷凍組織切片，如Christen等人,2004中所述。
[0345]體外增殖測定
[0346]制備脾、腸系膜LN(MLN)和PLN的單細胞懸浮液。對于總脾細胞群體的增殖測定，2xl05細胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨或具有分級濃度(1-100 μ g/ml)的純化的人胰島素、或?qū)τ冖?T細胞(InsB9_23, H-2dB8g限制的)或?qū)τ贑D8T細胞(InsB15_23，Kd限制的)特異的肽(Sigma)、并且含有或不含抗-1L-10或抗-TGF-β中和單克隆抗體。中和抗體以1、0.1和0.01 μ g/ml加入。對于總⑶3+T細胞、⑶8+T細胞、⑶4+T細胞和⑶4+⑶25-T細胞群體的增殖測定，0.2xl05個T細胞在96孔U形底平板中與來自WT Balb/c小鼠的IxlO5經(jīng)輻射的脾細胞一起，在含或不含中和抗體的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述脾細胞裝載有胰島素或GAD65或者對于CD4+或⑶8+Τ細胞特異的肽。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時后，通過加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來評估增殖。在16-18小時后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。使用0)3+、0)4+或0)8+分離試劑盒(MACS ；Milteny Biotec, Auburn, CA),通過磁珠分離經(jīng)由陰性選擇從PLN或脾中純化T細胞。CD4+T細胞作為總細胞使用，或使用CD25+分離試劑盒(Milteny Biotec)通過MACS進一步分離成CD25+和CD25'細胞群體的純度(>90% )通過流式細胞術(shù)分析進行測定。
[0347]對于細胞因子測量，在培養(yǎng)72小時后收集在如上所述的不同增殖測定(抗原特異性刺激)中使用的細胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進行冷凍直至執(zhí)行細胞因子分析。細胞因子產(chǎn)生使用 Mouse Infla mmation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, MountainView，CA，USA)進行定量。純化的⑶3+T細胞、⑶4+Τ或⑶8+Τ細胞進行培養(yǎng)，并且用抗-⑶3/抗-CD28混合物(各I μ g/ml)在體外非特異性刺激24小時，或它們保持未刺激作為對照。收獲上清液，并且使用在 BD FACSArray Bioanalyzer 上的 BD? Cytometric Bead Arrayflex set 使用 FCAP 陣列軟件(BD Biosciences)就 IL-10、IL-4, IL-5 和 IFNy 產(chǎn)生進行分析。捕獲ELISA實驗使用Quantikine試劑盒(R&D Systems)進行,用于測定TGF-β I。
[0348]體外T細胞增殖抑制測定
[0349]在來自WT Balb/c小鼠的T細胞耗盡的經(jīng)輻射的胰島素或肽裝載的2xl04脾細胞的存在下，從最近的糖尿病雌性NOD (8-12周)中分離的2xl04純化的總脾⑶4+CD25—T細胞與不同數(shù)目的CD8+T細胞、CD4+T細胞和CD4+CD25—T細胞群體進行共培養(yǎng)，所述細胞群體從來自不同實驗組的脾、MLN或PLN中分離。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時后，通過加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來評估增殖。在16-18小時后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer,Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)上測量胸苷摻入。
[0350]體外細胞毒性測定
[0351]所使用的淋巴母細胞靶是來自BALB/c小鼠的Con A-激活的脾細胞?？偣睮O6靶細胞用 100 μ Ci51Cr (Amersham International,Buckinghamshire,U.K)于 37°C標記 90 分鐘，洗滌3次，隨后與I μ g/ml肽(InsB15_23或無關肽)于37°C溫育I小時。將靶細胞洗滌2次，并且以IO4細胞/孔進行接種。以各種效應物:靶(Ε:T)的比例向每個孔中一式三份地加入從脾、MLN和PLN中分離的⑶8+Τ細胞。平板在500rpm下離心2分鐘，并且于37°C溫育4小時。溫育后，收集上清液用于測定51Cr釋放[裂解％ =IOOx (測試cpm-自發(fā)cpm) /(總cpm-自發(fā)cpm)]。對于間接殺死測定,在與效應物一起溫育前，⑶8+T細胞與5 μ g/ml抗-0)3 抗體(克隆 145-2C11, Pharmingen) 一起溫育。
[0352]糖尿病的過繼轉(zhuǎn)移
[0353]8-10周大的NOD-SCID小鼠用2xl07脾細胞進行靜脈內(nèi)注射或用5xl06脾細胞進行腹膜內(nèi)注射，所述脾細胞從糖尿病雌性NOD小鼠(6周、12周和18周)中分離，與或不與分級數(shù)目的從不同實驗乳酸乳球菌處理的組中分離的珠純化的⑶3+T細胞、⑶8+T細胞、⑶4+T細胞、⑶4+CD25_或⑶4+⑶25+T細胞組合。未處理的小鼠用作對照。糖尿病的發(fā)展通過每周3次連續(xù)監(jiān)控血糖水平進行測定。
[0354]結(jié)果
[0355]在同基因島移棺后，LL_hpIIp、LL-膜島素、LL_InsB?！?，延遲糖尿病復發(fā)
[0356]為了評估LL-hpIIp、LL-膜島素和LL-1nsB (9-23)是否誘導口服耐受性，研究在同基因島移植后的糖尿病復發(fā)。因此，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂，并且如(島分離和移植)所述的移植胰島。與對照比較，糖尿病復發(fā)在LL-hpIIp/胰島素/InsB9_23組中延遲。
[0357]LL-hpIIp、LL_胰島素和LL_InsB9_23在非肥胖糖尿病小鼠中顯著增強游離hpllp、胰島素或InsB9_23的耐受性誘導能力
[0358]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。LL-hpIIp、LL-胰島素和LL-1nsB9_23的添加顯著增強針對自身抗原的耐受性誘導，因為與對照以及游離hpllp/胰島素/InsB9_23組比較，脾細胞的自身抗原特異性增殖應答在LL-hpIIp/胰島素/InsB9^23組中顯著減少。
[0359]LL-hpIIp、LL-胰島素和LL_InsB9_23增強與減少的胰島炎、減少的β細胞破壞率和脾細胞增加的IL-10產(chǎn)生相關的口服耐受性。
[0360]為了研究口服耐受性的誘導，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂。響應所述自身抗原的胰島炎的存在、β細胞破壞率和細胞因子產(chǎn)生如上所述進行測定。組織學分析顯示與對照以及游離hpllp/胰島素/InsB9_23組比較,在LL-hpIIp/胰島素/InsB9_23組中顯著降低程度的胰島炎和β細胞破壞以及增加的IL-10產(chǎn)生。
[0361]LL-hpIIp、LL-胰島素和LL-1nsBg^經(jīng)由CD4+T細胞增強口服耐受性
[0362]為了評估CD4T細胞是否介導口服耐受性的誘導，自身抗原特異性增殖CD4T細胞應答在脾細胞和淋巴結(jié)中進行研究。因此，小鼠如上所述(實驗設置)進行經(jīng)口飼喂，并且自身抗原特異性CD4+T細胞增殖如所述的(體外增殖測定)進行測定。與對照以及游離hpllp/胰島素/InsB9_23組比較，LL-hpIIp/胰島素/InsB9_23組中的自身抗原特異性CD4T細胞應答。
[0363]實施例F5:在LL-1nsB，處理后，自身攻擊性CD8+應答在NOD小鼠中被抑制
[0364] 為了檢查我們的組合方法是否誘導抑制性⑶4+T細胞，所述⑶4+T細胞能夠通過旁觀者抑制機制調(diào)節(jié)糖尿病，我們分析對CD8+自身攻擊性T細胞的作用?？乖禺愋宰陨砉粜寓?+細胞的百分比和/或活性在LL-1nsB9_23處理后強烈減少。[0365]在LL-1nsB^處理后抗原誘導的T調(diào)節(jié)細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護避免自身免疫樣歷
[0366]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測試糖尿病樣應答的有效抑制，如上所述(糖尿病的過繼轉(zhuǎn)移)過繼轉(zhuǎn)移來自不同處理組的脾細胞。與對照和游離InsB9_23組比較，糖尿病樣應答在LL-1nsB9_23組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)⑶4+T細胞激活。
[0367]結(jié)論
[0368]證實自身抗原遞送乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細胞來抑制糖尿病特異性免疫應答。
[0369]討論
[0370]總的來說，上文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，即使在致敏受試者中，分泌抗原的遺傳修飾的乳酸乳球菌的經(jīng)口補充也可以減少由該抗原誘導的全身性炎癥。有利地，乳球菌屬介導的抑制通常看起來比游離抗原的粘膜施用后的抑制更有效。潛在地，該抑制可以通過誘導Foxp3+調(diào)節(jié)T細胞來介導。[0371]本申請涉及下述實施方案:
[0372]1.用于粘膜遞送以治療患者中的免疫應答相關疾病的分泌抗原的微生物，其中所述免疫應答相關疾病選自變應性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、食物過敏或乳糜瀉。
[0373]2.用于粘膜遞送以治療、預防和/或減輕患者中的免疫應答相關疾病的組合物，所述免疫應答相關疾病選自變應性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、食物過敏或乳糜瀉，所述組合物的特征在于其包含至少分泌抗原的微生物。
[0374]3.根據(jù)項目I使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2使用的組合物，其中所述微生物是乳酸細菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LL)。
[0375]4.根據(jù)項目I或3中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2或3中任一項使用的組合物，其中所述抗原組成型分泌。
[0376]5.根據(jù)項目1、3或4中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2、3或4中任一項使用的組合物，其中所述微生物每天進行施用。
[0377]6.根據(jù)項目I或3-5中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_5中任一項使用的組合物，其中所述抗原誘導調(diào)節(jié)T細胞(Treg)。
[0378]7.根據(jù)項目6使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目6使用的組合物，其中所述Treg細胞是Foxp3+Treg細胞。
[0379]8.根據(jù)項目I或3-7中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_7中任一項使用的組合物，其中所述抗原是免疫顯性的脫去酰胺基的抗原。
[0380]9.根據(jù)項目I或3-8中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2-8中任一項使用的組合物，其中所述抗原在HLA-DQ2或-DQ8的背景中被識別。
[0381]10.根據(jù)項目I或3-9中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2-9中任一項使用的組合物，其中所述抗原是α -麥醇溶蛋白或大麥醇溶蛋白。
[0382]11.根據(jù)項目10使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目10使用的組合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2、4、6或8，或由SEQ ID NO:2、4、6或8組成。
[0383]12.根據(jù)項目I或3-11中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_11中任一項使用的組合物，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖。
[0384]13.根據(jù)項目I或3-12中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_12中任一項使用的組合物，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細胞應答。
[0385]14.根據(jù)項目I或3-13中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_13中任一項使用的組合物，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
[0386]15.根據(jù)項目I或3-14中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_14中任一項使用的組合物，其中遞送所述微生物至少I周、更優(yōu)選至少I個月或I年。
[0387]16.根據(jù)項目I或3-15中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_15中任一項使用的組合物，其中所述微生物每天遞送至少I次，優(yōu)選每天2次。
[0388]17.根據(jù)項目I或3-16中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_16中任一項使用的組合物，其中所述微生物以至少10毫微微克-1OOmg/天,例如IOOfg-1Omg/天、或 Ipg-1mg/ 天、或 IOpg-1OO μ g/ 天、或 IOOpg-1O μ g/ 天、或 Ing-1 μ g/ 天、或 IOng-1OOmg/天的劑量進行遞送。
[0389]18.根據(jù)項目I或3-17中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_17中任一項使用的組合物，其中所述微生物通過噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠進行施用。
[0390]19.根據(jù)項目I或3-18中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_18中任一項使用的組合物，其中所述微生物或組合物配制為藥劑、醫(yī)學食物或營養(yǎng)食品。
[0391]20.用于治療、預防和/或減輕患者中的免疫應答相關疾病的方法，其包括粘膜遞送包含表達抗原的微生物的組合物，其中所述抗原被分泌，并且其中所述組合物每天進行遞送。
[0392]21.根據(jù)項目20的方法，其中所述微生物是乳酸細菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LL)。
[0393]22.根據(jù)項目20或21中任一項的方法，其中所述疾病選自變應性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、食物過敏或乳糜瀉。
[0394]23.根據(jù)項目20-22中任一項的方法，其中所述分泌是組成型的。
[0395]24.根據(jù)項目20-23中任一項的方法，其中所述抗原誘導調(diào)節(jié)T細胞(Treg)。
[0396]25.根據(jù)項目24的方法，其中所述Treg細胞是FoXp3+Treg細胞。
[0397]26.根據(jù)項目20-25中任一項的方法，其中所述抗原是免疫顯性的脫去酰胺基的抗原。
[0398]27.根據(jù)項目20-26中任一項的方法，其中所述抗原在HLA-DQ2或-DQ8的背景中被識別。
[0399]28.根據(jù)項目20-27中任一項的方法，其中所述抗原是α -麥醇溶蛋白或大麥醇溶蛋白。
[0400] 29.根據(jù)項目28的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2、4、6或8，或由SEQ IDNO:2、4、6 或 8 組成。
[0401]30.根據(jù)項目20-29中任一項的方法，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖。
[0402]31.根據(jù)項目20-30中任一項的方法，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細胞應答。
[0403]32.根據(jù)項目20-31中任一項的方法，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
[0404]33.根據(jù)項目20-32中任一項的方法，其中遞送所述微生物至少I周、更優(yōu)選至少I個月或I年。
[0405]34.根據(jù)項目20-33中任一項的方法，其中所述微生物每天遞送至少I次，優(yōu)選每天2次。
[0406]35.根據(jù)項目20-34中任一項的方法，其中所述微生物以至少10毫微微克-1OOmg/ 天,例如 IOOfg-1Omg/ 天、或 Ipg-1mg/ 天、或 IOpg-1OO μ g/ 天、或 IOOpg-1O μ g/天、或Ing-1 μ g/天、或IOng-1OOmg/天的劑量進行遞送。
[0407]36.根據(jù)項目20-35中任一項的方法，其中所述微生物通過噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠進行施用。
[0408]37.包含微生物的組合物，其中所述微生物組成型分泌抗原，所述抗原涉及變應性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、食物過敏或乳糜瀉的誘導。
[0409]38.根據(jù)項目37的組合物，其中所述微生物是乳酸細菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LU。
[0410]39.根據(jù)項目37或38中任一項的組合物，其中所述微生物以至少10毫微微克-1OOmg,例如 100fg-10mg、或 lpg-lmg、或 IOpg-1OO μ g、或 IOOpg-1O μ g、或 Ing-1 μ g、或IOng-1OOmg的劑量存在。
[0411]40.產(chǎn)品，其包含項目37-39中任一項的組合物。
[0412]41.項目40的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠。
[0413]42.用于治療、預防和/或減輕涉及免疫應答相關疾病的疾病或病癥的藥劑、醫(yī)學食物或營養(yǎng)食品，其包含至少微生物，其中所述微生物組成型分泌抗原，所述抗原涉及變應性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、類風濕性關節(jié)炎、食物過敏或乳糜瀉的誘導。
[0414]43.根據(jù)項目42的藥劑、醫(yī)學食物或營養(yǎng)食品，其中所述微生物是乳酸細菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LL)。
[0415]44.根據(jù)項目I或3-19中任一項使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項目2_19中任一項使用的組合物，其中所述抗原被制備以在所述患者中持續(xù)存在。
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【權(quán)利要求】
1.用于粘膜遞送以治療、預防和/或減輕受試者中的過敏的分泌抗原的微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原涉及受試者中過敏的誘導。
4.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述微生物是乳酸細菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原誘導調(diào)節(jié)T細胞(Treg)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6 使用的分泌抗原的微生物,其中所述Treg細胞是Foxp3+Treg細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原是Derpi或β_乳球蛋白(BLG)肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖。
10.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細胞應答。
11.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
12.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述分泌是組成型的。
13.用于粘膜遞送以治療、預防和/或減輕受試者中的過敏的組合物，所述組合物的特征在于其包含至少分泌抗原的微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
15.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原涉及受試者中過敏的誘導。
16.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述微生物是乳酸細菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原誘導調(diào)節(jié)T細胞(Treg)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18使用的組合物,其中所述Treg細胞是Foxp3+Treg細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原是Derpi或β-乳球蛋白(BLG)肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖。
22.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細胞應答。
23.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
24.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述分泌是組成型的。
25.表達抗原的微生物在制備用于粘膜遞送以治療、預防和/或減輕過敏的組合物中的用途，其中所述抗原被分泌。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原涉及受試者中過敏的誘導。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述微生物是乳酸細菌。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原誘導調(diào)節(jié)T細胞(Treg)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用途,其中所述Treg細胞是Foxp3+Treg細胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原是Derpi或β -乳球蛋白(BLG)肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細胞的增殖。
34.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細胞應答。
35.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
36.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述分泌是組成型的。
37.包含微生物的組合物，其中所述微生物組成型分泌抗原，所述抗原涉及過敏的誘導。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述微生物是乳酸細菌。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述微生物以至少10飛克-1OOmg的劑量存在。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以IOOfg-1Omg/天的劑量存在。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以Ipg-1mg/天的劑量存在。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以IOpg-1OOμ g/天的劑量存在。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以IOOpg-1Oyg/天的劑量存在。
46.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以Ing-1μ g/天的劑量存在。
47.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物,其中所述微生物以IOng-1OOmg/天的劑量存在。
48.權(quán)利要求37的組合物，其中所述組合物選自噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠。
49.用于治療、預防和/或減輕過敏的藥劑，其包含至少乳酸細菌，其中所述乳酸細菌組成型分泌異源抗原，所述抗原涉及過敏的誘導。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的藥劑，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的藥劑，其中所述乳酸細菌是乳酸乳球菌(LL)。
52.用于治療、預防和/或減輕過敏的醫(yī)學食物，其包含至少乳酸細菌，其中所述乳酸細菌組成型分泌異源抗原，所述抗原涉及過敏的誘導。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的醫(yī)學食物，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
54.根據(jù)權(quán)利要求52的醫(yī)學食物，其中所述乳酸細菌是乳酸乳球菌(LL)。
55.用于治療、預防和/或減輕過敏的營養(yǎng)食品，其包含至少乳酸細菌，其中所述乳酸細菌組成型分泌異源抗原，所述抗原涉及過敏的誘導。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的營養(yǎng)食品，其中所述過敏是變態(tài)反應、變應性哮喘或食物過敏。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的營養(yǎng)食品，其中所述乳酸細菌是乳酸乳球菌(LL)。
【文檔編號】A61K39/35GK103933563SQ201410145481
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2007年1月25日
【發(fā)明者】P·羅迪爾斯, V·斯努克 申請人:阿克圖杰尼斯公司