一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，該方法綜合采用了病毒粒子洗脫法，二級(jí)純化法，重復(fù)洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了PCV2的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品制備的疫苗相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同時(shí)，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)便、成本較低，具有突出的推廣前景。
【專利說(shuō)明】一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒純化方法，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)可能引起的一系列疾病，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemiewasting syndrome,PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephrophathysyndrome, PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex, PRDC)。
[0003]1997年，Clark等首次分離到豬圓環(huán)病毒2型。在2008年第20屆國(guó)際豬病大會(huì)上，圓環(huán)病毒病被列為當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號(hào)疫病。我國(guó)在2000年證實(shí)豬群中存在PCV2感染，2002年由PCV2感染的引起的PWMS在全國(guó)呈暴發(fā)流行。豬圓環(huán)病毒病造成豬只生長(zhǎng)慢，飼料報(bào)酬低，機(jī)體免疫力下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重威脅和巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)調(diào)查，PCV2在我國(guó)的陽(yáng)性率已經(jīng)達(dá)到80%以上。[0004]疫苗是預(yù)防該病的主要方法之一。目前，我國(guó)商品化的豬圓環(huán)病毒2型疫苗主要是全病毒滅活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原純凈性，滅活工藝及佐劑等因素的影響。商品化疫苗如果直接以細(xì)胞繁殖的病毒液進(jìn)行成品苗的生產(chǎn)，會(huì)受到細(xì)胞破碎產(chǎn)物，培養(yǎng)基成分，細(xì)胞代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)的影響，致使疫苗免疫動(dòng)物后易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質(zhì)量基本途徑。
[0005]中空纖維膜過(guò)濾技術(shù)屬于切向流過(guò)濾技術(shù)(Tangential Flow Filtration, TFF)的范疇，又稱錯(cuò)流過(guò)濾(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過(guò)膜到透過(guò)端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會(huì)被膜截留，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級(jí)分離。
[0006]和傳統(tǒng)的平板膜包相比，中空纖維膜具有纖維管狀的開(kāi)放式流道結(jié)構(gòu)，無(wú)篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無(wú)規(guī)則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護(hù)病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時(shí)有助于雜蛋白的透過(guò)和去除。
[0007]目前，對(duì)于豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的中空纖維純化及濃縮工藝尚無(wú)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有豬圓環(huán)病毒2型疫苗副反應(yīng)率高、均一性差、免疫效果差等技術(shù)問(wèn)題，提供一種使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒2型純化方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，該方法通過(guò)微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，過(guò)程如下:
[0011]I系統(tǒng)的組裝[0012]無(wú)菌條件下，將微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)按照組裝要求進(jìn)行組裝。在微濾澄清純化系統(tǒng)中可安裝無(wú)菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整無(wú)損的中空纖維微濾膜,在超濾濃縮純化系統(tǒng)中可安裝無(wú)菌100KD或300KD、完整無(wú)損的中空纖維超濾膜。
[0013]2系統(tǒng)完整性檢測(cè)
[0014]壓力保持法檢測(cè)系統(tǒng)的完整性。
[0015]3系統(tǒng)的處理
[0016]3.1清洗及滅菌
[0017]將0.5M NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進(jìn)料罐，浸泡處理20min，開(kāi)啟循環(huán)泵300rpm，進(jìn)行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。
[0018]3.2水洗及通量檢測(cè)
[0019]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無(wú)囷超純水注?兩系統(tǒng)的進(jìn)料--!，開(kāi)啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0020]3.3PBS 處理
[0021]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進(jìn)料罐，開(kāi)啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0022]上述所述技術(shù)方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進(jìn)行系統(tǒng)滅菌。
[0023]一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，該方法通過(guò)微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟:
[0024]I)將無(wú)菌吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液中，振蕩處理；
[0025]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開(kāi)啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過(guò)液待用；
[0026]3)以1:1 (v/v)的比例將無(wú)菌的0.1M PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過(guò)液，得到第一洗濾液待用；
[0027]4)以1:1 (v/v)的比例將無(wú)菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過(guò)液，得到第二洗濾液待用；
[0028]5)以1:1 (v/v)的比例將無(wú)菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過(guò)液，得到第三洗濾液待用；
[0029]6)將上述透過(guò)液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0030]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，經(jīng)100~300KD中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾處理，棄去透過(guò)液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為初級(jí)濃縮病毒液；
[0031]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，棄去透過(guò)液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為二級(jí)濃縮病毒液；
[0032]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為三級(jí)濃縮病毒液；
[0033] 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。[0034]將上述制備的病毒濃縮液成品保存于_20°C。
[0035]上述豬圓環(huán)病毒2型純化方法，采用的是二步純化法，第一步通過(guò)較大孔徑的澄清純化濾膜過(guò)濾病毒液，除去毒液中的細(xì)胞碎片；第二步通過(guò)較小孔徑的澄清純化濾膜洗濾第一步的濾過(guò)液，達(dá)到除去病毒液中的吐溫20、小分子蛋白，細(xì)胞代謝產(chǎn)物的小分子物質(zhì)等雜質(zhì)及實(shí)現(xiàn)濃縮病毒等目的。
[0036]上述豬圓環(huán)病毒2型純化方法中，步驟I)所述的振蕩處理時(shí)間優(yōu)選為IOmin ;步驟I)所述的比例優(yōu)選為5% ;步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑優(yōu)選為0.65 μ m ;步驟7)所述的超濾濾膜孔徑優(yōu)選為300KD ;步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間的操作條件均優(yōu)選為400rpm循環(huán)30min ;利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗；上述所述病毒澄清純化及濃縮方法，步驟2)中透過(guò)液的體積可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)選為透過(guò)液體積達(dá)到原液的90% ;步驟7)中的濃縮倍數(shù)可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)選為濃縮10倍以上。
[0037]上述技術(shù)方案中，步驟I)所述的豬圓環(huán)病毒2型病毒液是指制備得到的病毒原液，未經(jīng)稀釋處理；步驟I)加入吐溫20起到乳化作用，能夠有效避免病毒粒子聚集成團(tuán)，從而提升后續(xù)過(guò)濾效率。
[0038]所述微濾澄 清純化系統(tǒng)是指GE公司制造的QuixStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)，型號(hào)為QAM-04SA/50 ;所述微濾膜可以選自GE公司制造的、型號(hào)為CFP-6-D-6A或CFP-4-E-6A的Pilot微濾柱膜；所述超濾膜可以選自GE公司制造的、型號(hào)為UFP-300-C-6A或UFP-100-C-6A的Pilot超濾柱膜。
[0039]上述制備的病毒濃縮液成品檢測(cè)方法如下:
[0040]對(duì)純化濃縮工藝過(guò)程中的病毒樣品進(jìn)行病毒滴度及蛋白濃度檢測(cè)，以分析濃縮工藝的有效性。其中病毒滴度的檢測(cè)方法為:
[0041]以IFA法對(duì)各樣品的病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)，純化有效的判定標(biāo)準(zhǔn)為:二級(jí)純化及濃縮步驟的洗濾液檢測(cè)不出存活病毒，表明工藝有效；病毒的回收率在80%以上。
[0042]蛋白含量的測(cè)定方法為:
[0043]以蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)濃縮病毒液的蛋白殘存量進(jìn)行測(cè)定，可溶性蛋白的殘存量應(yīng)低于原液可溶性蛋白的10%,表明工藝有效。
[0044]以上對(duì)本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的純化方法綜合采用了病毒粒子洗脫法，二級(jí)純化法，重復(fù)洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了 PCV2的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品制備的疫苗相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同時(shí)，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)便、成本較低，具有突出的規(guī)?；瘧?yīng)用前
旦
-5^ O
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1是本發(fā)明微濾澄清純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0046]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制備的PCV2濃縮液成品熒光圖(10-4)；
[0047]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中PCV2原液熒光圖(10-4);
[0048]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中洗濾液的熒光圖(10-1)；[0049]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中細(xì)胞對(duì)照組的熒光圖；
[0050]圖6是本發(fā)明實(shí)施例1各樣品的病毒滴度圖；
[0051 ]圖7是本發(fā)明實(shí)施例1各樣品的可溶性蛋白濃度圖；
[0052]圖8是本發(fā)明實(shí)施例1免疫反應(yīng)后抗體消長(zhǎng)曲線圖(ELISA值)；
[0053]圖1 中:
[0054]1、進(jìn)料罐2、中空纖維濾柱 3、蠕動(dòng)泵
[0055]4、病毒原液進(jìn)料管線5、透過(guò)液流出管線6、截留液流動(dòng)管線
【具體實(shí)施方式】
[0056]實(shí)施例中所用儀器型號(hào)如下:
[0057]QuixStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)，型號(hào):QAM_04SA/50 ；
[0058]Pilot 微濾柱:CFP-6-D-6A(0.65 μ m)，CFP-4-E-6A(0.45 μ m)；
[0059]Pilot 超濾柱:UFP-300-C-6A(300KD)，UFP-100-C-6A(100KD)；
[0060]上述儀器均購(gòu)自GE公司。
[0061]實(shí)施例中所用試劑如下:
[0062]100L豬圓環(huán)病毒2型病毒液，107 2TCID5Q/ml，由本公司生產(chǎn)；
[0063]PCV2-Cap蛋白單克隆抗體，購(gòu)自浙江大學(xué)；
[0064]FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG,購(gòu)自Sigma公司；
[0065]丙內(nèi)酯，購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司；
[0066]ISA28VG，購(gòu)自法國(guó)賽比克公司；
[0067]PCV2ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司；
[0068]BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自康為世紀(jì)公司；
[0069]0.5Μ NaOHlOOL ；
[0070]無(wú)菌0.1M PBS100L ；
[0071]無(wú)菌高純水100L ;
[0072]吐溫20，分析純。
[0073]實(shí)施例1
[0074] I操作流程
[0075]1.1前處理
[0076]1.1.1系統(tǒng)的組裝
[0077]無(wú)菌條件下，將澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)按照組裝要求進(jìn)行組裝。在澄清系統(tǒng)中可安裝無(wú)菌0.65 μ m、完整無(wú)損的中空纖維微濾膜，在濃縮系統(tǒng)中安裝孔徑為300KD的無(wú)菌中空纖維超濾膜。
[0078]1.1.2系統(tǒng)完整性檢測(cè)
[0079]壓力保持法檢測(cè)系統(tǒng)的完整性。
[0080]1.1.3系統(tǒng)的處理
[0081]清洗及滅菌:
[0082]將0.5M NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進(jìn)料罐，浸泡處理20min，開(kāi)啟循環(huán)泵300rpm，進(jìn)行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。[0083]水洗及通量檢測(cè):
[0084]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無(wú)囷超純水注?兩系統(tǒng)的進(jìn)料--!，開(kāi)啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0085]PBS 處理:
[0086]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進(jìn)料罐，開(kāi)啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0087]1.2病毒的澄清純化
[0088]1.2.1病毒液的處理
[0089]將5L無(wú)菌吐溫20加入100L豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液中，振蕩處理lOmin。
[0090]1.2.2病毒液的澄清
[0091]澄清系統(tǒng)處理完畢后，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的PBS溶液，將振蕩處理后的病毒液，注入澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開(kāi)啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min,經(jīng)0.65 μ m中空纖維微濾柱進(jìn)行純化處理，收集透過(guò)液90L，進(jìn)料罐內(nèi)存留截留液10L。
[0092]1.2.3截留液的洗濾
[0093]第一次洗濾:
[0094]將IOL無(wú)菌的0.1M PBS加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵400rpm循環(huán)30min，收集透過(guò)液10L，記為洗濾液I。
[0095]第二次洗濾:
[0096]將IOL無(wú)菌的0.1M PBS加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵400rpm循環(huán)30min,收集透過(guò)液10L，記為洗濾液2。
[0097]第三次洗濾:
[0098]將IOL無(wú)菌的0.1M PBS加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵400rpm循環(huán)30min,收集透過(guò)液10L，記為洗濾液3。
[0099]1.2.4病毒液的收集
[0100]將上述澄清純化過(guò)程所收集的透過(guò)液及三次洗濾液混合均勻，得到混合液120L。
[0101]1.2.5初級(jí)濃縮
[0102]濃縮系統(tǒng)處理完畢后，將混合液注入濃縮系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開(kāi)啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min,經(jīng)300KD中空纖維超濾柱進(jìn)行純化處理,棄去透過(guò)液,進(jìn)料罐中剩余截留液10L,記為初級(jí)濃縮病毒液。
[0103]1.2.6濃縮液的洗濾
[0104]第一次洗濾:
[0105]將10L0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min，棄去透過(guò)液10L，進(jìn)料罐中剩余截留液10L，記為二級(jí)濃縮病毒液。
[0106]第二次洗濾:
[0107]將10L0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮液，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進(jìn)料罐中剩余截留液10L，記為三級(jí)濃縮病毒液。
[0108]第三次洗濾:
[0109]將10L0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮液，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進(jìn)料罐中剩余截留液10L，即為病毒濃縮液成品。[0110]1.2.7病毒液的收集
[0111]將經(jīng)過(guò)上述處理后的得到的病毒濃縮液成品進(jìn)行收集，保存于_20°C。
[0112]2有效性檢測(cè)
[0113]對(duì)純化濃縮工藝過(guò)程中的病毒樣品進(jìn)行病毒滴度及蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，以分析濃縮工藝的有效性。
[0114]2.1病毒滴度的檢測(cè):
[0115]以IFA法對(duì)各樣品的病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下:
[0116]2.1.1細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng)
[0117]以0.25%的EDTA-胰酶將生長(zhǎng)良好的檢測(cè)用豬腎細(xì)胞(PK15)進(jìn)行消化，以細(xì)胞生長(zhǎng)液重懸為2X 105/ml并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，IOOul/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。[0118]2.1.2病毒的梯度稀釋
[0119]將各收集的毒液樣品取樣，以0.1M PBS進(jìn)行10倍倍比稀釋10個(gè)梯度(KT1~10_10)。
[0120]2.1.3病毒的接種及培養(yǎng)
[0121 ] 將稀釋后各梯度病毒液接種于步驟(1)所述的檢測(cè)用細(xì)胞，IOOul/孔，每個(gè)梯度8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照，37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)72h。
[0122]2.1.4IFA 檢測(cè)
[0123]維持培養(yǎng)結(jié)束后，棄盡板內(nèi)維持液，以固定液(甲醇丙酮混合，1:1)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，IOOul/ 孔，-200C，5 ~IOmin0
[0124]棄盡固定液，將細(xì)胞板進(jìn)行風(fēng)干。
[0125]以1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液進(jìn)行封閉處理，IOOul/孔，37 °C，孵育30~60mino
[0126]以0.1M PBS洗3遍，200 μ I/孔。將500~700倍稀釋的PCV2_cap蛋白單克隆抗體(一抗)添加于細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μ I/孔，37°C，孵育30~60min。
[0127]棄盡一抗溶液，以0.1M PBS洗5遍，200 μ I/孔。添加800-1000倍稀釋的熒光色素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(二抗)，100μ I/孔，37°C，孵育30~60min。
[0128]棄盡二抗溶液，以0.1M PBS洗5遍，200 μ I/孔，熒光顯微鏡下觀察。
[0129]2.1.5統(tǒng)計(jì)并計(jì)算病毒滴度
[0130]統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)特異熒光孔的數(shù)目，以Reed-Muench法對(duì)豬瘟病毒的滴度(TCID50)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果證實(shí)，濃縮后的病毒液產(chǎn)生的熒光數(shù)明顯高于濃縮前的病毒液，濃縮階段的洗濾液無(wú)特異熒光，純化過(guò)程各階段的樣品的病毒滴度顯示，濃縮病毒滴度達(dá)到108_°TCID5(l/ml，濃縮階段的洗濾液無(wú)效價(jià)，病毒回收率接近100%。
[0131]2.2可溶性蛋白的檢測(cè)
[0132]取各樣品以BCA蛋白濃度試劑盒進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，可溶性蛋白殘存率為9.3%。
[0133]3疫苗制備
[0134]以上述工藝制備的病毒濃縮液作為原料，進(jìn)一步制備疫苗，其工藝步驟如下:
[0135]3.1 滅活
[0136]將純化濃縮后的PCV2毒液以0.1M PBS進(jìn)行稀釋，使其病毒滴度達(dá)到107_ tlTCID5tl/ml，將純化前的PCV2病毒液(107_°TCID5(l/ml)與純化后的PCV2病毒液(107_°TCID5(l/ml)分別置于滅活容器中，按1:2000加入β -丙內(nèi)酯，攪拌滅活48h，而后置37°C水浴2小時(shí)，終止滅活。
[0137]3.2 乳化
[0138]將徹底滅活的兩份毒液，分別置于乳化容器中，按水相與油相3:1，緩慢向病毒液中加入ISA28VG，800r/min攪拌30min，制備為水包油型疫苗，將純化前的PCV2病毒液和純化后的PCV2病毒液制備的疫苗分別記為:PCV2滅活疫苗I和PCV2滅活疫苗2。
[0139]4疫苗安全檢驗(yàn)
[0140]以上述工藝制備的PCV2滅活疫苗1，PCV2滅活疫苗2，無(wú)菌0.1M PBS溶液作為實(shí)驗(yàn)試劑；取20日齡PCV2ELISA抗體陰性、PCV2抗原陰性健康易感仔豬15頭作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。具體操作步驟如下:
[0141]4.1動(dòng)物分組
[0142]將15頭仔豬隨 機(jī)分為3組，每組5頭。
[0143]4.2疫苗免疫
[0144]腹腔注射兩種疫苗及PBS于試驗(yàn)用仔豬，如下操作:
[0145]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PCV2滅活疫苗1，共5頭；
[0146]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PCV2滅活疫苗2，共5頭；
[0147]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PBS，共5頭。
[0148]疫苗免疫后連續(xù)觀察14天。
[0149]4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0150]免疫后，各組仔豬均無(wú)不良反應(yīng)，純化疫苗組仔豬日增重優(yōu)于普通疫苗組，各組仔豬體溫?zé)o明顯波動(dòng)，結(jié)果如表1所示。
[0151]表1各組仔豬體重增長(zhǎng)及體溫紀(jì)錄
[0152]
【權(quán)利要求】
1. 一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)，并包括以下步驟: O將無(wú)菌吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬圓環(huán)病毒2型病毒液中，振蕩處理； 2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開(kāi)啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過(guò)液待用； 3)以l:l(v/v)的比例將無(wú)菌的0.1M PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過(guò)液，得到第一洗濾液待用； 4)以1:1 (v/v)的比例將無(wú)菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過(guò)液，得到第二洗濾液待用； 5)以1:1 (v/v)的比例將無(wú)菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，收集透過(guò)液，得到第三洗濾液待用； 6)將上述透過(guò)液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液； 7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，經(jīng)100KD或300KD中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾處理，棄去透過(guò)液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為初級(jí)濃縮病毒液； 8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的初級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間，棄去透過(guò)液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為二級(jí)濃縮病毒液； 9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的二級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為三級(jí)濃縮病毒液； 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進(jìn)料罐中的三級(jí)濃縮病毒液中，重懸，開(kāi)啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時(shí)間，棄去洗濾液，收集進(jìn)料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟I)所述的振蕩處理時(shí)間為IOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟I)所述的比例為5% ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑為0.45或0.65 μ m,較優(yōu)的為0.65 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟7)所述的超濾濾膜孔徑為300KD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開(kāi)啟循環(huán)泵循環(huán)一定時(shí)間的操作條件均為400rpm循環(huán)30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗。
【文檔編號(hào)】A61P31/20GK103937756SQ201410145472
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】李倬, 吳全忠, 米娜, 丁旭娜, 呂茂杰, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司