一種以流感病毒為載體的hcv嵌合疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以流感病毒為載體的HCV嵌合疫苗及其制備方法。本發(fā)明公開了SEQ?ID?No.1所示的DNA分子。本發(fā)明公開的HCV嵌合疫苗是雙價(jià)疫苗，為發(fā)展流感病毒為載體的HCV嵌合疫苗實(shí)現(xiàn)“一苗兩用”或“一苗多用”奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種以流感病毒為載體的HCV嵌合疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以流感病毒為載體的HCV嵌合疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丙肝是危害人類健康和生命安全的致命殺手，在發(fā)展中國(guó)家防控形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，而丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝病的主要病原體，以血液、性生活黏膜為主要感染傳播途徑。據(jù)國(guó)家權(quán)威機(jī)構(gòu)報(bào)告，全世界約有1.7-2.0億人為HCV感染者，我國(guó)HCV感染者率約在4000萬以上。HCV感染后，約50%-85%轉(zhuǎn)為慢性肝病，其中20%_30%發(fā)展為肝硬化，部分轉(zhuǎn)為肝細(xì)胞肝癌(HCC)。目前，聚乙二醇、干擾素-a和利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用是丙型肝炎治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，其有效率僅為50%，且副作用大，費(fèi)用昂貴，停藥后有很高的復(fù)發(fā)率，由此許多丙肝患者失去治療機(jī)會(huì)，已成為全球性的、嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。
[0003]目前，疫苗接種是預(yù)防和控制傳染病的最有效措施。
[0004]在過去數(shù)十年中，重組乙肝疫苗的廣泛應(yīng)用大大降低了乙肝感染率和發(fā)病率，為人類健康作出了巨大貢獻(xiàn)。然而，對(duì)于丙型肝炎而言，至今還沒有被批準(zhǔn)使用的疫苗，但對(duì)于疫苗的研究一直是國(guó)際社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。當(dāng)前，HCV疫苗的研究主要集中在合成多肽疫苗、重組多表位疫苗、核酸疫苗、病毒載體疫苗等，已有幾個(gè)試驗(yàn)疫苗正在臨床前或進(jìn)入臨床研究階段。從已有研究結(jié)果顯示，至今沒有突破性進(jìn)展，仍停滯不前，有諸多關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題亟待解決。從研究看，由于HCV的基因組變異率高，交叉免疫保護(hù)抗原差，尚缺乏有效的敏感細(xì)胞和動(dòng)物感染模型，對(duì)其細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答在HCV感染恢復(fù)中的作用仍不十分清楚， 使以誘導(dǎo)保護(hù)性抗體產(chǎn)生為目的的預(yù)防性疫苗和/或治療性疫苗的研究步履艱難。此外，已有研究的HCV疫苗免疫后誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫效果差、免疫保護(hù)不全面、且注射不能產(chǎn)生有效的黏膜免疫和細(xì)胞免疫效果，給丙肝疫苗的研究提出了挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展安全、有效的丙肝疫苗已成為當(dāng)今生命科學(xué)亟待解決的重大科學(xué)問題。
[0005]HCV的基因組結(jié)構(gòu)類似黃病毒屬和瘟病毒屬，1991年國(guó)際病毒命名委員會(huì)將其歸為黃病毒科(flaviciridae)丙型肝炎病毒屬(hepacivirus)。HCV基因組為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)9.6kb，其5’端有一個(gè)319 — 341nt結(jié)構(gòu)較為保守的非編碼區(qū)(Non-coding region, 5’ -NCR),后面為一個(gè)連續(xù)的開放閱讀框架(open reading frame,0RF)，可編碼一個(gè)多聚蛋白前體，此多聚蛋白前體由宿主和病毒的信號(hào)肽酶剪接成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Core、El、E2)和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV C 蛋白由191個(gè)氨基酸殘基組成，是HCV基因組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域。5’ -NCR區(qū)最為保守，而3’-NCR對(duì)于HCV RNA的正常復(fù)制是不可缺少的。由于HCV病原體復(fù)雜的感染致病特點(diǎn)，給HCV的免疫防控帶來了難題。
[0006]HCV基因序列的高度變異性，丙肝疫苗的研制面臨很多挑戰(zhàn):①HCV RNA和病毒蛋白變異性很大，至少存在6種基因型及大約70種基因亞型，中國(guó)主要流行亞型是lb，2a，也有其他亞型感染報(bào)道HCV準(zhǔn)種的存在也是產(chǎn)生宿主免疫逃逸及容易導(dǎo)致慢性感染的機(jī)制之一，嚴(yán)重影響了 HCV疫苗發(fā)展及HCV預(yù)防和治療的成功率HCV在體外不能大量有效繁殖和缺乏感染的細(xì)胞、動(dòng)物敏感模型，而黑猩猩是HCV感染的唯一動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但黑猩猩受到保護(hù)而難以普遍使用HCV致病的免疫學(xué)機(jī)制尚未完全澄清，且性生活黏膜途徑感染對(duì)注射疫苗免疫不能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)，這些都嚴(yán)重限制了 HCV疫苗研發(fā)的進(jìn)程。
[0007]在過去數(shù)年中，HCV疫苗的研究一直是科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。在早期的研究中，以真核表達(dá)E1/E2免疫原為主，Ralston等用重組痘苗病毒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)了 HCV全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)現(xiàn)雖可獲得高效表達(dá)，所表達(dá)的El和E2包膜糖蛋白易形成復(fù)合物，用純化的包膜糖蛋白E1/E2復(fù)合物免疫黑猩猩可產(chǎn)生高滴度的抗El和E2抗體。而應(yīng)用El包膜糖蛋白僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生弱的免疫反應(yīng)，提示E1/E2包膜糖蛋白形成的異源二聚體可能對(duì)激發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答與保護(hù)是必要的。另有學(xué)者Lagging等構(gòu)建了 C基因(第I 一 191aa)重組質(zhì)粒pcDNA HCV Core, 0.2mg質(zhì)粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠2-3次后，于第6周處死小鼠，可檢測(cè)到較高水平的抗C抗體，免疫2次或3次的抗體滴度相似。以上實(shí)驗(yàn)說明，HCVC區(qū)構(gòu)建的重組質(zhì)粒均能在真核細(xì)胞中表達(dá)，且能誘導(dǎo)出特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但未能保護(hù)性傳播途徑的黏膜免疫保護(hù)。也有學(xué)者Duenas-Carrera等運(yùn)用編碼HCV-C，E蛋白的DNA疫苗免疫兔子和恒河猴，初次免疫28周后，所有兔子產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗C、E反應(yīng)，免疫52周后，恒河猴出現(xiàn)高滴度的抗HCV結(jié)構(gòu)區(qū)抗原的抗體。近年來，人們?cè)谂R床研究方面也取得了一定成果，Leroux-Roels等在I期臨床中，用Ib型El (aal92_326)的共同序列在重組痘苗病毒中表達(dá)純化后對(duì)20位志愿者肌肉注射后，結(jié)果提示三次免疫后可以引起明顯的El抗體反應(yīng)，通過第4次加強(qiáng)免疫后反應(yīng)增強(qiáng)，在所有的志愿者中都可以誘發(fā)針對(duì)El的強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，在臨床應(yīng)用中El治療性候選疫苗具有良好的安全性和免疫效果方面。Baryluk等用含有HCV El的質(zhì)粒和重組腺病毒進(jìn)行的治療性疫苗的研究，在I期臨床研究證明安全性的基礎(chǔ)上并已進(jìn)入II期臨床研究。在II期臨床研究中，重組的El疫苗可激發(fā)強(qiáng)烈的針對(duì)El的T細(xì)胞反應(yīng)，部分病人血清ALT水平明顯下降。2012年的《科學(xué)一轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》雜志上，英國(guó)牛津大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員報(bào)告了他們研發(fā)的一種HCV疫苗臨床試驗(yàn)取得的結(jié)果，該疫苗是以一種黑猩猩腺病毒為載體模仿了其內(nèi)部相對(duì)長(zhǎng)期穩(wěn)定不變的結(jié)構(gòu)，臨床試驗(yàn)取得初`步成效，41名志愿者接種疫苗后，跟蹤研究發(fā)現(xiàn)疫苗效果至少能持續(xù)一年，并且副作用明顯減弱，但DNA疫苗安全性及全面應(yīng)答與保護(hù)受限。盡管以上臨床前及進(jìn)入臨床研究的這些HCV候選疫苗取得了重要進(jìn)展，但疫苗免疫后誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫效果欠佳、交叉免疫保護(hù)不全面、注射免疫不能產(chǎn)生有效的黏膜免疫細(xì)胞免疫效應(yīng)，并且腺病毒為載體的DNA疫苗存在潛在安全隱患等問題。
[0008]近年來,反向遺傳學(xué)技術(shù)(Reverse genetics, RG)在流感病毒領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。美國(guó)Medimmune公司是RG技術(shù)用于疫苗研制領(lǐng)域最成功的典范，2003年6月，該公司生產(chǎn)的流感三價(jià)減毒活疫苗Flumi st被FDA批準(zhǔn)和投入使用，適用于2_49歲人群，通過鼻腔免疫，使用簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛，臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示具有安全、有效和交叉免疫保護(hù)效果，使得以冷適應(yīng)流感減毒活疫苗為遞送系統(tǒng)表達(dá)外源基因研制其他疫苗帶來了新的契機(jī)。與其他載體如腺病毒，痘苗病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體相比，流感病毒在復(fù)制周期不會(huì)形成DNA中間產(chǎn)物，由此不會(huì)整合進(jìn)宿主的染色體，使得應(yīng)用更好的安全性。用于流感病毒基因組操作的策略有:外源蛋白嵌入表面糖蛋白NA和HA，產(chǎn)生另外的基因片段，改造非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，PB2基因缺失等。目前，已有大量報(bào)道將流感病毒作為病毒疫苗載體成功制備了能夠達(dá)到有效免疫保護(hù)的重組嵌合疫苗候選株，如流感嵌合體病毒(A/B)、副流感、呼吸道合胞病毒(RSV)、衣原體、結(jié)核桿菌、瘧疾、艾滋、B.anthracis和腫瘤等均有報(bào)道，為以流感病毒為載體的多價(jià)疫苗研究拓寬了發(fā)展空間。值得我們注意的是，同樣是以血液、性傳播途徑為主的HIV病毒，Anna L.de Goedea等將HIV_lpl7Gag基因插入流感病毒NA基因，成功構(gòu)建了流感病毒為載體的復(fù)制缺陷型rFlu-pl7疫苗候選株，結(jié)果表明rFlu-pl7能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。而將流感病毒作為HCV疫苗研制的載體，在國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。所以，采用反向遺傳技術(shù)制備流感病毒為載體的HCV候選疫苗株將是HCV疫苗研究領(lǐng)域的新里程碑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種以流感病毒為載體的HCV嵌合疫苗及其制備方法。
[0010]本發(fā)明提供的SEQ ID N0.1所示的DNA分子。
[0011]一種重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該病毒按照如下方法制備:
[0012]將分別含有冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因和冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的表達(dá)質(zhì)粒，以及分別含有靶標(biāo)流感病毒的HA基因和靶標(biāo)流感病毒的NA基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到重組流感病毒；
[0013]在如下所述基因中的至少一種基因的開放讀碼框中的任意位置插入或替換為HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因:
[0014](1)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因；
[0015](2)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因；
[0016](3)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因；
[0017](4)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因；
[0018](5)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因；
[0019](6)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因；
[0020](7)所述靶標(biāo)流感病毒的HA基因；
[0021](8)所述靶標(biāo)流感病毒的NA基因；
[0022]所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因，以及靶標(biāo)流感病毒的HA基因和NA基因位于不同的表達(dá)質(zhì)粒上；
[0023]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)镠CV的核心蛋白C全基因、包膜蛋白E1/E2全基因、核心蛋白C的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和/或包膜蛋白E1/E2的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因。
[0024]上述病毒中，所述宿主細(xì)胞為MDCK、Vero、293T、COS細(xì)胞或MDCK/293T、MDCK/C0S共培養(yǎng)的細(xì)胞；
[0025]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)镠CV的核心蛋白C的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和包膜蛋白E1/E2的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因的融合基因。
[0026]上述任一所述的病毒中，所述HCV為I型HCV、2型HCV、3型HCV、4型HCV、5型HCV或6型HCV ;
[0027]所述I型HCV具體為Ib亞型HCV。
[0028]上述任一所述的病毒中，所述HCV的核心蛋白C的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和包膜蛋白E1/E2的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0029]上述任一所述的病毒中，所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間；
[0030]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因與所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位核苷酸之間連有5’ -UAAUG-3’序列；
[0031]和/ 或，
[0032]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換；
[0033]和/ 或，
[0034]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?qū)⑺霭袠?biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換。
[0035]上述任一所述的病毒中，所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒為冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒或冷適應(yīng)、減毒B型流感病毒；
[0036]所述冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒具體為H2N2亞型冷適應(yīng)、減毒流感病毒，再具體為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)；
[0037]所述靶標(biāo)流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種，再具體為HlNl亞型流感病毒，再具體為流感病毒株A/California/07/2009 (HlNl)；
[0038]所述靶標(biāo)流感病毒為未經(jīng)過任何處理的(如未經(jīng)過減毒、未經(jīng)過冷適應(yīng))的普通野生型流感病毒。`
[0039]上述任一所述的病毒中，所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間所得序列為SEQID N0.2中第51-1466位核苷酸所示；
[0040]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.3中第40-1053位核苷酸所示；
[0041]所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?qū)⑺霭袠?biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.4中第35-944位核苷酸所示。
[0042]構(gòu)建所述表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，上述PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因、NS基因、HA基因或NA基因，均在各自的5’端連接有各自基因的3’ NCR序列，均在各自的3’端均連接有各自基因的5’ NCR序列；
[0043]所述表達(dá)質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)粒為雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pAD3000 ；
[0044]構(gòu)建所述表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，均將各基因插在雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pAD3000的BsmBI位點(diǎn)。
[0045]上述任一所述的病毒制備得到的嵌合疫苗也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0046]上述DNA分子在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HCV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0047]和/ 或，
[0048]上述任一所述的病毒在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HCV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；[0049]和/ 或，
[0050]上述嵌合疫苗在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HCV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0051]所述流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種；
[0052]所述HCV 為 I 型 HCV、2 型 HCV、3 型 HCV、4 型 HCV、5 型 HCV 或 6 型 HCV ；
[0053]所述I型HCV具體為Ib亞型HCV。
[0054]本發(fā)明提供的HCV嵌合疫苗可以覆蓋HCV傳染病病原體，保護(hù)更多人群免受流感病毒和HCV之害，為實(shí)現(xiàn)“一苗兩用”或“一苗多用”目的奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1為構(gòu)建以流感病毒為載體的HCV嵌合疫苗的重組策略示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0057]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0058]pAD3000 在文獻(xiàn)“Hoffmann E，Mahmood K, Yang CF, Webster RG, GreenbergHB，Kemble G.Rescue of influenza B virus from eight plasmids.Proc Natl AcadSc1.2002;99(17):11411-6.”中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。
[0059]BALB/c小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0060]10-12周齡的雪貂購(gòu)自中國(guó)無錫Angora安哥魯公司。
[0061]2012-2013年流感病毒當(dāng)年流行株A/California/07/2009 (HlNl)由國(guó)家流感中心提供，公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。分別擴(kuò)增該病毒株的HA、NA基因，再分別插入到雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體PAD3000的BsmBI位點(diǎn)，構(gòu)建得到該病毒株的重組質(zhì)粒pD-HA、pD-NA。
[0062]冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)(簡(jiǎn)寫A/AA/6/60)在文獻(xiàn)“Yang P, Duan Y, Wang C，Xing L, Gao X, Tang C, Luo D, Zhao Z, Jia ff, Peng D, Liu X，WangX.1mmunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine againstthe2009pandemic A HlNlin mice and ferrets.Vaccine.2011Janl7; 29 (4):698-705.，，中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。該病毒株的6個(gè)內(nèi)部基因PB2、PBl、PA、NP、NS、M，分別插入到雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體pAD3000的BsmBI位點(diǎn)，構(gòu)建得到該病毒的重組質(zhì)粒 pD-PB2、pD-PB UpD-PA, pD_NP、pD_NS、pD_M。
[0063]下述實(shí)施例中的NCR代表非編碼區(qū)。
[0064]實(shí)驗(yàn)例1、以流感病毒為載體的嵌合HCV-C/E1/E2優(yōu)勢(shì)抗原表位的HCV嵌合疫苗rFLU-HCV/NSl 的制備 [0065]一、Ib亞型的HCV中HCV-C/E1/E2優(yōu)勢(shì)抗原表位序列如SEQ ID N0.1所示，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床病人血清驗(yàn)證，符合下一步實(shí)驗(yàn)要求。
[0066]二、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pC/El/E2-NSl
[0067]以冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的NSl基因片段為插入HCV-C/E1/E2優(yōu)勢(shì)抗原表位基因的靶點(diǎn)，利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒PC/E1/E2-NS1，具體策略如圖1A所示。
[0068]具體是將上述獲得的HCV-C/E1/E2優(yōu)勢(shì)抗原表位基因插入到冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的NS基因開放閱讀框(ORF)的自5’末端起第375位核苷酸之后，中間加Λ linker (5; -UAAUG-3')連接，linker既有終止子作用，又有啟動(dòng)子作用，最后是NS基因開放閱讀框的自5’末端起第376位至第838位核苷酸，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pC/E1/E2-NS1。
[0069]步驟如下: [0070](一)合成SEQID N0.2所示的DNA分子，SEQ ID N0.2中自5’端起第I位至第24位為酶切位點(diǎn)，第25位至第51位為NS基因的3’ NCR，第51位至第425位為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60NS基因開放閱讀框(ORF)的自5’末端起第I位至第375位核苷酸，第426位至第430位為linker，第431位至第1003位為HCV-C/E1/E2優(yōu)勢(shì)抗原表位基因，第1004位至第1466位為NS基因開放閱讀框(ORF)的自5’末端起第376位至第838位核苷酸，第1467位至第1495位為NS基因的5’ NCR,第1496位至第1517位酶切位點(diǎn)。
[0071](二)AarI酶切SEQ ID N0.2所示的DNA分子，得到目的基因片段；BsmBI酶切PAD3000，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pC/E1/E2-NS1，將重組質(zhì)粒送測(cè)序結(jié)果正確。
[0072]三、將重組質(zhì)粒pC/El/E2-NSl與冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的內(nèi)部病毒基因骨架 PB2、PBl、PA、NP、M 分別構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pD_PB2、pD_PBl、pD_PA、pD_NP、pD_M，及流感病毒當(dāng)年流行株A/California/07/2009 (HlNl)的HA、NA基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pD_HA、pD-NA,共8種質(zhì)粒各0.2 μ g,等量混合加入10 μ L轉(zhuǎn)染試劑(Effectene,購(gòu)自Qiagen公司)室溫作用lOmin，共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，33°C，5%C02,培養(yǎng)48_60h，得細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種9日齡SPF雞胚，33°C培養(yǎng)72h，收獲雞胚尿囊液測(cè)定HA血凝效價(jià)，HA血凝效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果是1:256-512，獲得嵌合HCV-C/E1/E2優(yōu)勢(shì)抗原表位的HCV嵌合疫苗株(rFLU-HCV/NSl)。
[0073]四、對(duì)步驟三獲得的疫苗株進(jìn)行鑒定，電鏡觀察病毒形態(tài)，結(jié)果表明該疫苗株符合流感病毒典型形態(tài)特征，病毒顆粒大小在80-120nm之間。
[0074]五、將rFLU-HCV/NSl接種9-11日齡SPF雞胚(購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)傳代，取第二代雞胚尿囊液提取病毒RNA，經(jīng)過RT-PCR，擴(kuò)增出PB2、PBU PA, NP、HA、NA、M和NSl共8個(gè)基因片段，分別將基因片段送公司測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期基因序列一致。
[0075]六、將rFLU-HCV/NSl經(jīng)雞胚大量培養(yǎng)，超濾濃縮、蔗糖梯度離心純化后，跑SDS-PAGE電泳，凝膠染色、脫色后，可檢測(cè)到相應(yīng)大小的NP、HA1、HA2、NEP蛋白，表明抗原的主要成分沒有丟失。
[0076]七、rFLU-HCV/NSl的溫度敏感(Temperature sensitive, ts)、冷適應(yīng)(Coldadapted, ca)和減毒(Attenuated, att)表型檢測(cè)
[0077]將rFLU-HCV/NSl接種MDCK細(xì)胞或9-11日齡雞胚，分別于25、33、37和39°C條件下培養(yǎng)3天，收集細(xì)胞上清或雞胚尿囊液測(cè)定病毒滴度。結(jié)果表明，該疫苗株具有ts、ca表型。同時(shí)，該疫苗株在BALB/c小鼠和雪貂動(dòng)物上表現(xiàn)減毒表型。
[0078]八、rFLU-HCV/NSl在小鼠體內(nèi)的免疫效果
[0079]將rFLU-HCV/NSl經(jīng)超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心純化后，制備該疫苗的減毒活疫苗劑型。
[0080]選用6-8周齡BALB/c小鼠，分為疫苗組和對(duì)照組，每組20只。
[0081]疫苗組:將該疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫2次，間隔2周，每次免疫劑量為105 5-106_5TCID50，免疫體積為 20 μl。
[0082]對(duì)照組:PBS代替疫苗，同時(shí)免疫方式、免疫體積及免疫時(shí)間與疫苗組一致。
[0083]將疫苗組和對(duì)照組分別于初次免疫后、二次免疫后2周，經(jīng)小鼠尾靜脈采血，離心收集各組小鼠的血清。
[0084]采用HI方法測(cè)定血清中針對(duì)野生型流感病毒A/California/07/2009 (HlNl)的抗體效價(jià)，同時(shí)采用微量中和方法檢測(cè)血清中針對(duì)HCV的特異性抗體產(chǎn)生情況，結(jié)果如表1所示。
[0085]表lrFLU-HCV/NSl的免疫效果檢測(cè)
[0086]疫苗組、
【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.1所示的DNA分子。
2.一種重組病毒，該病毒按照如下方法制備: 將分別含有冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因和冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的表達(dá)質(zhì)粒，以及分別含有靶標(biāo)流感病毒的HA基因和靶標(biāo)流感病毒的NA基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到重組流感病毒； 在如下所述基因中的至少一種基因的開放讀碼框中的任意位置插入或替換為HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因: (1)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因； (2)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因； (3)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因； (4)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因； (5)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因； (6)所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因； (7)所述靶標(biāo)流感病毒的HA基因； (8)所述靶標(biāo)流感病毒的NA基因； 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)镠CV的核心蛋`白C全基因、包膜蛋白E1/E2全基因、核心蛋白C的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和/或包膜蛋白E1/E2的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的病毒，其特征在于:所述宿主細(xì)胞為MDCK、Vero、293T、C0S細(xì)胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培養(yǎng)的細(xì)胞； 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)镠CV的核心蛋白C的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和包膜蛋白E1/E2的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因的融合基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3任一所述的病毒，其特征在于:所述HCV為I型HCV、2型HCV、3型HCV,4 型 HCV、5 型 HCV 或 6 型 HCV ； 所述I型HCV具體為Ib亞型HCV。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的病毒，其特征在于:所述HCV的核心蛋白C的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因和包膜蛋白E1/E2的優(yōu)勢(shì)抗原表位基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一所述的病毒，其特征在于:所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間； 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因與所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位核苷酸之間連有5’ -UAAUG-3’序列； 和/或， 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換； 和/或， 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?qū)⑺霭袠?biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一所述的病毒，其特征在于:所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒為冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒或冷適應(yīng)、減毒B型流感病毒； 所述冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒具體為H2N2亞型冷適應(yīng)、減毒流感病毒，再具體為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)； 所述靶標(biāo)流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種，再具體為HlNl亞型流感病毒，再具體為流感病毒株A/California/07/2009 (HlNl)0
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一所述的病毒，其特征在于:所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間所得序列為SEQ ID N0.2中第51-1466位核苷酸所示； 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.3中第40-1053位核苷酸所示； 所述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?qū)⑺霭袠?biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.4中第35-944位核苷酸所示。
9.由權(quán)利要求2-8任一所述的病毒制備得到的嵌合疫苗。
10.權(quán)利要求1所述的DNA分子在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HCV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 和/或， 權(quán)利要求2-8任一所述的病毒在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HCV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 和/或， 權(quán)利要求9所述的嵌合疫苗在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HCV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種；
所述 HCV 為 I 型 HCV、2 型 HCV、3 型 HCV、4 型 HCV、5 型 HCV 或 6 型 HCV ； 所述I型HCV具體為Ib亞型HCV。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK103757032SQ201410041509
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】楊鵬輝, 張紹庚, 王希良, 段躍強(qiáng), 張培瑞, 李志偉, 王兆海 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三0二醫(yī)院