一種抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其包括以下步驟：制備混合溶劑、溶解細菌纖維素和膠原蛋白，制備含有AgNO3或金、銀納米簇的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液，采用靜電紡絲技術(shù)對含有AgNO3或金、銀納米簇等熒光納米材料的細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液進行紡絲，采用紫外光光照還原含有AgNO3或金、銀納米簇等的復合纖維獲得載有納米銀或金、銀熒光納米簇等的納米纖維支架，將相關(guān)復合納米纖維支架用于細胞培養(yǎng)制備出組織工程材料。本發(fā)明采用不同細菌纖維素與膠原蛋白間配比，制備出的復合納米纖維支架材料，實現(xiàn)了力學強度、體內(nèi)降解能力可調(diào)，可用于制備多用途的組織工程材料。
【專利說明】一種抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細菌纖維素復合納米纖維支架的制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程是將細胞生物學和材料學相結(jié)合而形成的一門新生技術(shù)。其主要目的和方法是制備一種三維的具有良好生物相容性且能逐漸降解被人體所吸收的細胞外基質(zhì)材料，在該外源性細胞外基質(zhì)中種植細胞，在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)擴增，形成生物材料-細胞的復合物，然后再將這種復合體植入機體所需部位去代替缺損組織或器官。為此找到合適的外源性細胞外基質(zhì)來模擬天然組織中的細胞外基質(zhì)分子的功能對于組織工程具有重大意義，此外理想支架材料還應(yīng)具有一定的機械強度，良好的血液相容性以及三維多孔結(jié)構(gòu)以便細胞的粘附、生長和增殖。
[0003]采用靜電紡絲原理制備的仿細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀組織工程支架，具有多孔結(jié)構(gòu)，比表面積大，適合于細胞的遷移和增殖。該方法具有制備條件溫和，條件要求不高，制備過程聚合物不易降解，且支架能攜帶并釋放藥物、蛋白、核酸等多種生物化學物質(zhì)，高的比表面積使細胞能更好地吸收上述物質(zhì)且能更好地促進代謝產(chǎn)物的排出，從而更好的調(diào)控細胞生物學行為。研究提示，應(yīng)用靜電紡絲法制備納米組織工程支架前景良好。
[0004]采用微生物發(fā)酵合成的細菌纖維素作為一種可降解的仿生材料，制成組織器官表膜的商品已經(jīng)出現(xiàn)；也有研究表明細菌纖維素可制備為軟骨工程支架以及骨組織工程支架，能有效的促進傷口的愈合。但目前由靜電紡絲細菌纖維素作為基體材料，同時兼有作為組織工程支架又能促進組織修復，還能有效抑制手術(shù)感染等功能的商品還為之甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種可生物降解的，多孔的，抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架的制備方法。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架的制備方法，包括以下步驟:
1)制備混合溶劑:首先制備離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMIMCL)，將一定量的甲基咪唑和氯丙烯混合溶液(混合溶液中的甲基咪唑與氯丙烯體積比為1:1.1到1:1.9之間)加入到雙口燒瓶中，在氮氣中保護五分鐘，之后在油浴中恒溫加熱回流一定時間；用無水乙醚對反應(yīng)物進行數(shù)次萃取，再加入活性炭和去離子水后，在油浴中一定溫度下對反應(yīng)物再次進行數(shù)小時回流，過硅藻土得到淡黃色的液體，將其真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后再真空干燥48小時制得AMMCL ;再將4-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)和所制得的(AMMCL)按照不同的質(zhì)量比進行混合，混合體系中NMMO的質(zhì)量分數(shù)分別為9-90% ； 2)制備細菌纖維素溶液:取一定量的細菌纖維素溶于上述已干燥的NMMO和AMMCL混合溶劑中，在密閉容器中油浴加熱，保持一定溫度，并持續(xù)攪拌12-24個小時，可得到黃色液體，制備不同質(zhì)量分數(shù)的0.5-20%的細菌纖維素溶液；
3)制備膠原蛋白溶液:將一定量的膠原蛋白溶于六氟異丙醇，50°C微熱攪拌至完全溶解，得到不同質(zhì)量分數(shù)的0.5-20%的膠原蛋白溶液；
4)制備細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將細菌纖維素和膠原蛋白溶液以各種比例混合，得到總質(zhì)量分數(shù)為0.5%-20%的膠原蛋白和細菌纖維素的混合溶液；
5)制備含有AgNO3或金、銀納米簇等的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將上述細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液中加入一定質(zhì)量的AgNO3或金、銀納米簇等溶液，充分混勻；
6)含AgNO3或金、銀納米簇等的上述混合溶液進行靜電紡絲:將一定量的AgNO3或金、銀納米簇等溶液分散于聚合物溶液中，將含有AgNO3或金、銀納米簇等的膠原蛋白和細菌纖維素溶液進行有序結(jié)構(gòu)靜電紡絲，得到AgNO3或金、銀納米簇等/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維；
7)制備載納米銀復合納米纖維:將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維在紫外光照射下進行光還原，光還原后的復合纖維顏色逐漸變?yōu)闇\黃，表明銀納米顆粒的形成；
8)制備的相關(guān)有序多孔結(jié)構(gòu)復合納米纖維支架用于細胞培養(yǎng):將相應(yīng)類型的細胞植入上述各類孔徑大小的支架中，然后整體放置于細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后觀察具體效果。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的 一個方面，在步驟I)中的NMMO和制備出的AMMCL的質(zhì)量比在1:10到10:1之間。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在步驟2)中的細菌纖維素溶液制備中，反應(yīng)溫度為10°C到 IlO0Co
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在步驟4)中的細菌纖維素溶液:膠原蛋白溶液的體積比是1:5到5:1之間。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在步驟6)中已配好的范圍在0.5%到20%之間的不同濃度的混和溶液轉(zhuǎn)移到注射器中，在范圍為IOkv到30kv之間的不同外加電場強度以及在5cm到20cm之間的不同接收距離范圍內(nèi)進行靜電紡絲。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在步驟8)中采用的細胞培養(yǎng)液為50ml胎牛血清(FBS)與440ml的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)儀器為六孔板，加入75%酒精，浸泡消毒5小時，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗6次，每次5ml，浸泡時間不少于12小時，然后用DMEM培養(yǎng)基浸泡材料半小時左右，放入CO2培養(yǎng)箱，過夜晾干，用于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)；然后用移液槍吸取2ml內(nèi)皮細胞懸液,種植在六孔培養(yǎng)板的各個孔中，然后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4個小時,等內(nèi)皮細胞基本粘附，再加入3ml預熱到37°C的加有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過程中根據(jù)消耗情況更換培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)3-5天。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在步驟8)中首先在六孔板中加入75%酒精，浸泡消毒5小時，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗1-6次，每次5ml，浸泡時間不少于12小時，然后用DMEM培養(yǎng)基浸泡材料10-60分鐘，放入CO2培養(yǎng)箱，過夜晾干，用于平滑肌細胞的培養(yǎng)；然后用移液槍吸取2ml平滑肌細胞懸液，種植在六孔培養(yǎng)板的各個孔中，然后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-10小時，等平滑肌細胞基本粘附，再加入3ml預熱到37°C的加有1%_10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過程中根據(jù)消耗情況更換培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)3-8天。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點:
(1)通過調(diào)節(jié)膠原蛋白和細菌纖維素兩者的比例來調(diào)節(jié)支架的降解速率，也可通過靜電紡絲過程中的參數(shù)設(shè)置來調(diào)節(jié)支架的孔徑大小來滿足不同細胞的培養(yǎng)。這些都使得該膠原蛋白-細菌纖維素細胞培養(yǎng)支架在組織工程學中有著廣闊的應(yīng)用前景；
(2)采用膠原蛋白和細菌纖維素為基體材料，模擬細胞外基質(zhì)中的多糖和膠原，由靜電紡絲所制得的該納米纖維支架，能有效促進細胞的粘附、生長與增殖；
(3)由于采用生物相容性好的膠原蛋白/細菌纖維素等作為基體材料，植入抗菌能力強的納米銀后，制備出的支架具有抗菌修復之功效可在組織工程中獲得應(yīng)用。
[0014]同時，將含有金、銀熒光納米簇等的相關(guān)有序多孔結(jié)構(gòu)的膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維支架用于細胞培養(yǎng)制備出組織工程材料，兼有精確成像示蹤、消炎、材料體內(nèi)可控化降解的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是膠原蛋白和細菌纖維素的靜電紡絲電鏡圖。
【具體實施方式】
[0016]以下的說明本質(zhì)上僅僅是示例性的而并不是為了限制本公開、應(yīng)用或用途。
[0017]下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0018]實施實例1:
Cl)制備混合溶劑:首先制備離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMIMCL)，將體積比為1:1.1的甲基咪唑和氯丙烯加入到的雙口燒瓶中，在氮氣保護五分鐘，之后在油浴中恒溫加熱回流一定時間；用無水乙醚對反應(yīng)物進行數(shù)次萃取，再加入活性炭和去離子水后，在油浴中一定溫度下對反應(yīng)物再次進行回流數(shù)小時，過硅藻土得到淡黃色的液體，將其真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后真空干燥48小時制得AMMCL ;再將4-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)和所制得的(AMMCL)按照1:10的質(zhì)量比進行混合，混合體系中NMMO的質(zhì)量分數(shù)分別為9% ；
(2)制備細菌纖維素溶液:取0.05g的細菌纖維素溶于IOml的NMMO和AMMCL混合溶劑中，在密閉容器中油浴加熱，保持恒溫10°C，并持續(xù)攪拌12個小時，可得到黃色液體，制備質(zhì)量分數(shù)為0.5%的細菌纖維素溶液；
(3)制備膠原蛋白溶液:將0.05g膠原蛋白溶于IOml六氟異丙醇,50°C微熱攪拌至完全溶解，得到質(zhì)量分數(shù)為0.5%的膠原蛋白溶液；
(4)制備細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將細菌纖維素和膠原蛋白溶液以1:5體積比混合，得到總質(zhì)量分數(shù)為0.5%的膠原蛋白和細菌纖維素的混合溶液；
(5)制備含有AgNO3或金、銀納米簇等的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將上述細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液中加入0.0OlgAgNO3或金、銀納米簇等的溶液，充分混勻；
(6)含AgNO3或金、銀納米簇等的上述混合溶液進行靜電紡絲:將AgNO3或金、銀納米簇等溶液分散于聚合物溶液中，將含有AgNO3或金、銀納米簇等的膠原蛋白和細菌纖維素溶液進行靜電紡絲，設(shè)置接收距離為5cm，外加電場強度為25kv，將濃度0.5%的混和溶液轉(zhuǎn)移到注射器中進行紡絲，得到AgNO3或金、銀納米簇等/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維；(7)制備載納米銀復合納米纖維:將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維在紫外光照射下進行光還原，光還原后的復合纖維顏色逐漸變?yōu)闇\黃，表明銀納米顆粒的形成；
(8)制備的納米纖維支架用于細胞培養(yǎng):將內(nèi)皮細胞等植入上述各類孔徑大小的支架中，然后整體放置于細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后觀察具體效果。
實施實例2:
(1)制備混合溶劑:首先制備離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMIMCL)，將體積比為1:1.2的甲基咪唑和氯丙烯加入到的雙口燒瓶中，在氮氣保護五分鐘，之后在油浴中恒溫加熱回流一定時間；用無水乙醚對反應(yīng)物進行數(shù)次萃取，再加入活性炭和去離子水后，在油浴中一定溫度下對反應(yīng)物再次進行回流數(shù)小時，過硅藻土得到淡黃色的液體，將其真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后真空干燥48小時制得AMMCL ;再將4-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)和所制得的(AMMCL)按照3:7質(zhì)量比進行混合，混合體系中NMMO的質(zhì)量分數(shù)分別為30% ；
(2)制備細菌纖維素溶液:取Ig的細菌纖維素溶于上述IOml的NMMO和AMMCL混合溶劑中，在密閉容器中油浴加熱，保持恒溫110°C，并持續(xù)攪拌12個小時，可得到黃色液體，制備質(zhì)量分數(shù)為10%的細菌纖維素溶液；
(3)制備膠原蛋白溶液:將0.05g膠原蛋白溶于IOml六氟異丙醇,50°C微熱攪拌至完全溶解，得到質(zhì)量分數(shù)為0.5%的膠原蛋白溶液；
(4)制備細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將細菌纖維素和膠原蛋白溶液以3:3比例混合，得到總質(zhì)量分數(shù) 為5%的膠原蛋白和細菌纖維素的混合溶液；
(5)制備含有AgNO3或金、銀納米簇等的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將上述細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液中加入0.0Olg的AgNO3或金、銀納米簇等溶液，充分混勻；
(6)含AgNO3或金、銀納米簇等的上述混合溶液進行靜電紡絲:將上述AgNO3或金、銀納米簇等溶液分散于聚合物溶液中，將含有AgNO3或金、銀納米簇等的膠原蛋白和細菌纖維素溶液進行靜電紡絲，濃度為20%的混和溶液轉(zhuǎn)移到注射器中，接收距離為20cm，在外加電場強度25kv下進行紡絲，得到AgNO3或金、銀納米簇等/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維；
(7)制備載納米銀復合納米纖維:將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維在紫外光照射下進行光還原，光還原后的復合纖維顏色逐漸變?yōu)闇\黃，表明銀納米顆粒的形成；
(8)制備的納米纖維支架用于細胞培養(yǎng):將平滑肌細胞等植入上述支架中，然后整體放置于細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后觀察具體效果。
[0019] 實施實例3:
Cl)制備混合溶劑:首先制備離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMIMCL)，將體積比為1:1.6的甲基咪唑和氯丙烯加入到的雙口燒瓶中，在氮氣保護五分鐘，之后在油浴中恒溫加熱回流一定時間；用無水乙醚對反應(yīng)物進行數(shù)次萃取，再加入活性炭和去離子水后，在油浴中一定溫度下對反應(yīng)物再次進行回流數(shù)小時，過硅藻土得到淡黃色的液體，將其真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后真空干燥48小時制得AMMCL ;再將4-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)和所制得的(AMMCL)按照7:3質(zhì)量比進行混合，混合體系中NMMO的質(zhì)量分數(shù)分別為70% ；
(2)制備細菌纖維素溶液:取Ig細菌纖維素溶于IOml的上述NMMO和AMMCL混合溶劑中，在密閉容器中油浴加熱，保持恒溫10°c，并持續(xù)攪拌24個小時，可得到黃色液體，制備質(zhì)量分數(shù)為10%的細菌纖維素溶液；
(3)制備膠原蛋白溶液:將Ig膠原蛋白溶于IOml六氟異丙醇,50°C微熱攪拌至完全溶解，得到質(zhì)量分數(shù)為10%的膠原蛋白溶液；
(4)制備細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將細菌纖維素和膠原蛋白溶液以4:2體積比混合，得到總質(zhì)量分數(shù)為10%的膠原蛋白和細菌纖維素的混合溶液；
(5)制備含有AgNO3或金、銀納米簇等的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將上述細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液中加入0.0Olg的AgNO3或金、銀納米簇等溶液，充分混勻；
(6)含AgNO3或金、銀納米簇等的上述混合溶液進行靜電紡絲:將上述AgNO3或金、銀納米簇等溶液分散于聚合物溶液中，將含有AgNO3或金、銀納米簇等的膠原蛋白和細菌纖維素溶液進行靜電紡絲，將已配好20%濃度的混和溶液轉(zhuǎn)移到注射器中，接收距離5cm，外加電場強度為IOkv進行紡絲，得到AgNO3或金、銀納米簇等/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維；
(7)制備載納米銀復合納米纖維:將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維在紫外光照射下進行光還原，光還原后的復合纖維顏色逐漸變?yōu)闇\黃，表明銀納米顆粒的形成； (8)制備的納米纖維支架用于細胞培養(yǎng):將內(nèi)皮細胞等植入上述支架中，然后整體放置于細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后觀察具體效果。
[0020]實施實例4:
Cl)制備混合溶劑:首先制備離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMIMCL)，將體積比為1:1.9的甲基咪唑和氯丙烯加入到的雙口燒瓶中，在氮氣保護五分鐘，之后在油浴中恒溫加熱回流一定時間；用無水乙醚對反應(yīng)物進行數(shù)次萃取，再加入活性炭和去離子水后，在油浴中一定溫度下對反應(yīng)物再次進行回流數(shù)小時，過硅藻土得到淡黃色的液體，將其真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后真空干燥48小時制得AMMCL ;再將4-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)和所制得的(AMMCL)按照10:1質(zhì)量比進行混合，混合體系中NMMO的質(zhì)量分數(shù)分別為90% ；
(2)制備細菌纖維素溶液:取2g細菌纖維素溶于上述IOml的NMMO和AMMCL混合溶劑中，在密閉容器中油浴加熱，保持恒溫110°C，并持續(xù)攪拌24個小時，可得到黃色液體，制備質(zhì)量分數(shù)為20%的細菌纖維素溶液；
(3)制備膠原蛋白溶液:將Ig膠原蛋白溶于IOml的六氟異丙醇中，50°C微熱攪拌至完全溶解，得到質(zhì)量分數(shù)為10%的膠原蛋白溶液；
(4)制備細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將細菌纖維素和膠原蛋白溶液以5:1的體積比混合，得到總質(zhì)量分數(shù)為18%的膠原蛋白和細菌纖維素的混合溶液；
(5)制備含有AgNO3或金、銀納米簇等的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將上述細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液中加入質(zhì)量0.0Olg的AgNO3或金、銀納米簇等溶液，充分混勻；
(6)含AgNO3或金、銀納米簇等的上述混合溶液進行靜電紡絲:將上述AgNO3或金、銀納米簇等溶液分散于聚合物溶液中，將含有AgNO3或金、銀納米簇等的膠原蛋白和細菌纖維素溶液進行靜電紡絲，0.5%的混和溶液轉(zhuǎn)移到注射器中，接收距離為5cm，在外加電場強度30kv下進行靜電紡絲，得到AgNO3或金、銀納米簇等/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維；(7)制備載納米銀復合納米纖維:將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維在紫外光照射下進行光還原，光還原后的復合纖維顏色逐漸變?yōu)闇\黃，表明銀納米顆粒的形成；
(8)制備的納米纖維支架用于細胞培養(yǎng):將平滑肌細胞等植入上述支架中，然后整體放置于細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)8天后觀察具體效果。
[0021]結(jié)合附圖，由圖1可以看出，在此條件下可制備出50nm左右的膠原蛋白和細菌纖維素的靜電紡絲。本發(fā)明通過細菌纖維素溶液與膠原蛋白溶液以及硝酸銀溶液混合制備靜電紡絲液，通過改變靜電紡絲過程的參數(shù)來制備不同孔徑的纖維支架，將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維支架在紫外光照射下進行光還原，還原后得到粒徑小、分布均勻的納米銀后形成Ag-膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架。Ag-膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架再通過細胞培養(yǎng)制備不同細胞類型的支架，該支架具有抗菌修復之功效可在組織工程中獲得應(yīng)用。
[0022]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的 前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)制備混合溶劑:首先制備離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMMCL)，將一定量的甲基咪唑和氯丙烯混合溶液加入到的雙口燒瓶中，其中混合溶液中的甲基咪唑與氯丙烯體積比為1: 1.1到1: 1.9之間，在氮氣中保護五分鐘，之后在油浴中恒溫加熱回流一定時間；用無水乙醚對反應(yīng)物進行數(shù)次萃取，再加入活性炭和去離子水后，在油浴中一定溫度下對反應(yīng)物再次進行數(shù)小時回流，過硅藻土得到淡黃色的液體，將其真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后再真空干燥48小時制得AMMCL ;再將4-甲基嗎啉-N-氧化物(NMMO)和所制得的AMMCL按照不同的質(zhì)量比進行混合，混合體系中NMMO的質(zhì)量分數(shù)分別為9-90% ； 2)制備細菌纖維素溶液:取一定量的細菌纖維素溶于上述NMMO和AMMCL混合溶劑中，在密閉容器中油浴加熱，保持在一定溫度條件下反應(yīng)，在持續(xù)攪拌12-24小時后，即可得到黃色液體，從而制備出不同質(zhì)量分數(shù)的0.5-20%的細菌纖維素溶液； 3)制備膠原蛋白溶液:將一定量的膠原蛋白溶于六氟異丙醇，50°C微熱攪拌至完全溶解，得到不同質(zhì)量分數(shù)的0.5-20%的膠原蛋白溶液； 4)制備細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將細菌纖維素和膠原蛋白溶液以各種比例混合，得到總質(zhì)量分數(shù)為0.5%-20%的膠原蛋白和細菌纖維素的混合溶液； 5)制備含有AgNO3或金、銀納米簇等的細菌纖維素和膠原蛋白混和溶液:將上述細菌纖維素和膠原蛋白混合溶液中加入一定質(zhì)量的AgNO3或金、銀納米簇等溶液，充分混勻； 6)含AgNO3或金、銀納米簇的上述混合溶液進行靜電紡絲:將一定量的AgNO3或金、銀納米簇等溶液分散于聚合物溶液中，將含有AgNO3或金、銀納米簇等的膠原蛋白和細菌纖維素溶液進行有序結(jié)構(gòu)靜電紡絲，得到AgNO3或金、銀納米簇等/膠原蛋白/細菌纖維素復合納米纖維； 7)制備載納米銀復合納米纖維:將靜電紡絲得到的AgNO3/膠原蛋白-細菌纖維素復合納米纖維在紫外光照射下進行光還原，光還原后的復合纖維顏色逐漸變?yōu)闇\黃，表明銀納米顆粒的形成； 8)制備的納米纖維支架用于細胞培養(yǎng):將相應(yīng)類型的細胞植入上述各類孔徑大小的支架中，然后整體放置于細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后觀察具體效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其特征在于:步驟I)中的NMMO和AMMCL的質(zhì)量比在1:10到10:1之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其特征在于:步驟2)中的細菌纖維素溶液制備中，反應(yīng)溫度為10°C到110°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其特征在于:步驟4)中的細菌纖維素溶液:膠原蛋白溶液的體積比是1:5到5:1之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌修復 型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其特征在于:步驟6)中已配好的范圍在0.5%到20%之間的不同濃度的混和溶液轉(zhuǎn)移到注射器中，在范圍為IOkv到30kv之間的不同外加電場強度以及在5cm到20cm之間的不同接收距離范圍內(nèi)進行靜電紡絲。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其特征在于:步驟8)中采用的細胞培養(yǎng)液為50ml胎牛血清(FBS)與440ml的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)儀器為六孔板，加入75%酒精，浸泡消毒5小時，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗6次，每次5ml，浸泡時間不少于12小時，然后用DMEM培養(yǎng)基浸泡材料半小時左右，放入CO2培養(yǎng)箱，過夜晾干，用于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)；然后用移液槍吸取2ml內(nèi)皮細胞懸液，種植在六孔培養(yǎng)板的各個孔中，然后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4個小時,等內(nèi)皮細胞基本粘附，再加入3ml預熱到37°C的加有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過程中根據(jù)消耗情況更換培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)3-5天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌修復型靜電紡絲膠原蛋白-細菌纖維素納米纖維支架的制備方法，其特征在于:步驟8)中首先在六孔板中加入75%酒精，浸泡消毒5小時，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗1-6次，每次5ml，浸泡時間不少于12小時，然后用DMEM培養(yǎng)基浸泡材料10-60分鐘，放入CO2培養(yǎng)箱，過夜晾干，用于平滑肌細胞的培養(yǎng)；然后用移液槍吸取2ml平滑肌細胞懸液，種植在六孔培養(yǎng)板的各個孔中，然后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-10小時，等平滑肌細胞基本粘附，再加入3ml預熱到37°C的加有1%_10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過程中根據(jù)消耗情況更換培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)3-8天。
【文檔編號】A61L27/54GK103751848SQ201410038926
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】王雪梅, 劉曉麗, 來蘭梅 申請人:東南大學