腫瘤抑制劑mln4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。通過實驗證明在抗腫瘤臨床人體試驗中有較好表現(xiàn)的小分子抑制劑MLN4924具有較強的抗病毒活性，通過抑制病毒輔助蛋白作用，能夠達(dá)到大于80%的抑制病毒復(fù)制。由于該藥物具有較長的前期實驗性臨床應(yīng)用經(jīng)驗，藥物作用效果強，可大規(guī)模生產(chǎn)，因而具有很大的潛力成為高效抗病毒藥物。利用小分子藥物抑制病毒蛋白主導(dǎo)的Neddylation激活下的泛素系統(tǒng)，檢測腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用價值。
【專利說明】腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種腫瘤抑制劑MLN4924的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒作為危害人類健康的重要病原體，已成為全球性的公共衛(wèi)生領(lǐng)域的難題，至今人們?nèi)匀粵]有找到非常有效的治療藥物和方法。不同病毒的傳播以及在宿主體內(nèi)的復(fù)制方式也存在著較大的差異。隨著近二十年病毒與宿主間相互作用的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列的天然抗病毒因子，諸如AP0BEC3G，BST-2, Trim5_a以及SAMHDl等。然而病毒不斷的復(fù)制過程中也形成了各異的適應(yīng)機制來逃避宿主免疫防御。其中，病毒利用所編碼的病毒蛋白通過篡奪宿主泛素化系統(tǒng)來促進(jìn)抗病毒因子的蛋白酶體依賴性降解是最為普遍的策略。
[0003]Cullin家族蛋白作為重要的泛素系統(tǒng)連接蛋白，直接參與泛素化過程的調(diào)控。前期國際多項研究揭示Cullin家族蛋白廣泛涉及生物體發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等過程。然而，Cullin蛋白組成的泛素E3復(fù)合體也被許多病毒蛋白所劫持，特異性的促進(jìn)宿主蛋白降解進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制與傳播。病毒蛋白識別泛素E3復(fù)合體的現(xiàn)象普遍存在于DNA病毒和RNA病毒中，成為國際公認(rèn)的新型抗病毒疫苗與藥物研究靶點(表I)。
[0004]小分子抑制劑MLN4924能夠特異性的結(jié)合Nedd8活化酶(NAE)，破壞Nedd8分子的正常傳遞，從而阻斷了 Neddylation修飾激活Cullin蛋白參與的泛素復(fù)合體，抑制癌細(xì)胞的增生。該抑制劑被美國國家癌癥研究中心(NCI)作為重要的候選抗腫瘤藥物進(jìn)行I和II/III 其月人^本Ife床試驗石開究(http: //www.cancer, gov/drugdictionary?cdrid=596795),但至今尚未報道腫瘤抑制劑MLN4924對病毒有抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0007]腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
[0008]通過實驗證明在抗腫瘤臨床人體試驗中有較好表現(xiàn)的小分子抑制劑MLN4924具有較強的抗病毒活性，通過抑制病毒輔助蛋白作用，能夠達(dá)到大于80%的抑制病毒復(fù)制。由于該藥物具有較長的前期實驗性臨床應(yīng)用經(jīng)驗，藥物作用效果強，可大規(guī)模生產(chǎn)，因而具有很大的潛力成為高效抗病毒藥物。
[0009]利用小分子藥物抑制病毒蛋白主導(dǎo)的Neddylation激活下的泛素系統(tǒng)，檢測腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為MLN4924抑制宿主細(xì)胞內(nèi)Cullin4A蛋白的正常Neddylation修飾。[0011]圖2為MLN4924有效阻斷病毒蛋白Vpx誘導(dǎo)宿主SAMHDl蛋白降解。
[0012]圖3為細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)Neddylation介導(dǎo)蛋白UBE2M突變體有效抑制病毒蛋白Vpx功能。
[0013]圖4A為腺病毒蛋白E4of6識別CRL5E3復(fù)合體降解P53蛋白示意圖；
[0014]圖4B為MLN4924有效抑制腺病毒E4of6蛋白誘導(dǎo)P53蛋白降解。
[0015]圖5為MLN4924有效抑制慢病毒在PMA誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞狀態(tài)下THP-1細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。
[0016]圖6為抗腫瘤藥物MLN4924抑制病毒泛素復(fù)合體功能示意圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。[0018]本發(fā)明通過整合細(xì)胞宿主泛素復(fù)合體調(diào)節(jié)機制，研究在病毒蛋白劫持下的泛素復(fù)合體激活機制，篩選和檢驗特異性高，機體毒害性小且可行性大的小分子抑制劑來阻斷病毒輔助蛋白促進(jìn)的病毒在巨噬細(xì)胞中復(fù)制，建立新型抗病毒藥物研究的新靶標(biāo)。選用了的小分子抑制劑 MLN4924(化學(xué)式:C21H25N504S，編號:M425100，廠商:T0R0NT0 RESEARCHCHEMICALS INC.)實施例1
[0019]利用MLN4924 能夠有效的抑制 THP-1 細(xì)胞(2010 年從 NIH AIDS reagent program獲得:https://www.aidsreagent.0rg/reagentdetai1.cfm?t=cell lines&id=142) 內(nèi)Cullin4A蛋白與類泛素分子Nedd8的結(jié)合，從而有效的阻止了 CRLs泛素E3復(fù)合體的變構(gòu)激活。(見圖1)。實施例2
[0020]病毒蛋白誘導(dǎo)宿主蛋白泛素化降解檢測系統(tǒng):
[0021]本發(fā)明中，宿主基因SAMHDl和P53表達(dá)質(zhì)粒均通過提取THP-1細(xì)胞的cDNA，利用PCR擴(kuò)增目的基因構(gòu)建進(jìn)入哺乳細(xì)胞表達(dá)載體p⑶NA3.1 (Invitrogen:http: //tools,lifetechnologies.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1+, pdf)中。再利用月旨質(zhì)法轉(zhuǎn)染將相應(yīng)的宿主基因和病毒編碼基因轉(zhuǎn)入人胚胎腎細(xì)胞HEK293T (2010年購自ATCC:httD://www.atcc.0rg/Products/All/CRL-3216.aspx)中，48小時后，利用免疫印跡法檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況，所有實驗結(jié)果均使用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析(圖2，圖3，圖4)。(I)MLN4924強效阻斷了慢病毒(Lentivirus)病毒蛋白Vpx識別CRL4(DCAFl)復(fù)合體促進(jìn)
[0022]抗病毒因子SAMHDl的降解(圖2);平行的機制性研究再次證明了 Vpx_CRL4病毒復(fù)合
[0023]體受Nedd8修飾途徑中直接由UBE2M參與Nedd8分子傳遞和調(diào)控。多途徑干擾UBE2M
[0024]蛋白正常表達(dá)或者功能，均明顯阻斷Vpx誘導(dǎo)降解抗病毒蛋白SAMHDl (圖3)；
[0025](2)MLN4924 有效阻斷腺病毒(Adenovirus)病毒蛋白 E4of6 識別 CRL5 (ElonginB/C)復(fù)
[0026]合體促進(jìn)重要調(diào)節(jié)蛋白P53的泛素化降解，恢復(fù)宿主細(xì)胞內(nèi)的正常功能性調(diào)節(jié)(圖4)。實施例3
[0027]病毒侵染試驗系統(tǒng):
[0028]選用50ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)刺激后的單核細(xì)胞系THP-1(購自ATCCMt為檢測系統(tǒng)。病毒侵染前6小時加入MLN4924達(dá)到IOOnM濃度，對照組使用溶劑DMSO與細(xì)胞共孵育，之后分別加入30ul含有濃縮后的無細(xì)胞的類人猿免疫缺陷病毒SIV病毒上清(病毒侵染報告質(zhì)粒來自于美國凱斯西儲大學(xué)分子生物學(xué)和微生物學(xué)系Jacek Skowronski,相關(guān)文章已發(fā)表Hrecka，K.2011，Nature474，658-661)。72小時后，收細(xì)胞熒光顯微鏡觀察后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行GFP陽性細(xì)胞篩選(病毒侵染陽性)，收獲數(shù)據(jù)進(jìn)行侵染性分析(圖5)。
[0029]重復(fù)試驗顯示MLN4924阻斷了病毒蛋白結(jié)合后的CRL E3泛素連接酶功能，對SIV在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制達(dá)到大于80%的抑制(圖5和圖6)。
[0030]圖 6 中(NAE:neddy8 蛋白激活酶；UBE2M/UBE2F:Nedd8 蛋白結(jié)合酶；Rbxl/Rbx2:E3泛素連接酶蛋白；E2:泛素結(jié)合酶；Ubiquitin(Ub):泛素蛋白)
[0031]抗腫瘤藥物MLN4924潛在抗病毒作用靶點見表1。
[0032]表1
[0033]
【權(quán)利要求】
1.腫瘤抑制劑MLN4924在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/519GK103520163SQ201310500094
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】于曉方, 魏偉, 郭浩然 申請人:天津大學(xué)