一種花青素脂質體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新的花青素脂質體的制備方法，它解決了游離花青素穩(wěn)定性差、生物可利用度低的問題。該方法基于花青素穩(wěn)定性受pH值影響大的特點，采用了pH梯度結合逆向蒸發(fā)的方法首先得到花青素脂質體的混懸液，再通過擠壓過膜或循環(huán)高壓均質，以獲得不同粒徑范圍的花青素脂質體。由于脂質體混懸液不易保存，在脂質體的制備過程中加入凍干保護劑，將混懸液在-65℃下預冷凍后在冷凍干燥機中凍干，得到花青素脂質體的凍干粉。采用本方法制成的花青素脂質體包埋率高達85.88％，根據(jù)處理方法不同，可獲得粒徑范圍100～234nm的脂質體。凍干復溶后的包埋率可達82.5％。采用脂質體包埋花青素，可提高花青素在體內的穩(wěn)定性和生物可利用度。
【專利說明】一種花青素脂質體的制備方法
一、【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及天然抗氧化劑花青素的脂質體的制備方法。
二、【背景技術】
[0002]花青素在自然界中的分布廣泛，已發(fā)現(xiàn)存在于自然界中的花青素有600多種，大量體外研究表明，花青素具有比維生素E等常見的抗氧化劑更高的抗氧化能力，較強的抗炎，抗菌及抑制癌細胞生長能力，因此被認為可以用于降低由氧化性損傷所引起的慢性疾病，如心血病、腫瘤、神經(jīng)退性疾病、糖尿病的患病風險的作用，這些作用引起了藥學、營養(yǎng)學及食品學界的廣泛關注和研究。
[0003]然而，相比較其它植物黃酮，花青素穩(wěn)定性差，對溫度、pH、光、金屬離子等外在因素敏感，尤其受PH值的影響很大，花青素一般在pHl?2以下以2 —苯基苯并吡喃型陽離子的結構穩(wěn)定存在，隨著PH值的增加，其主體結構逐漸過渡到查爾酮、醌型堿的結構，穩(wěn)定性也迅速減小，容易被氧化降解。此外，近年來對花青素體內生物可利用度的研究結果也不容樂觀，可能原因有二，一是花青素在生理條件下不穩(wěn)定，二是其較強親水性及較大分子量導致其不易被胃腸道吸收。穩(wěn)定性差和生物可利用率差嚴重影響了花青素的廣泛應用，隨著近年來人們對花青素在功能食品、保健食品的應用，期望解決這個問題的心情也越來越迫切。
[0004]朱樹華等將紫薯·花青素與甘薯、小麥和玉米淀粉混合碾磨，再載入明膠膠囊制備得到了紫薯花青素膠囊，但該發(fā)明未說明中花青素在體內的穩(wěn)定性和生物可利用度。如何在提高花青素的穩(wěn)定性同時提高其生物可利用度一直是個難題。
[0005]脂質體是一種磷脂在水相中形成的具有類似生物膜結構的雙分子層結構的小囊，最早是由英國學者Bangham在1965年將磷脂分散在水中進行電鏡觀察時發(fā)現(xiàn)的。1972年Gregoriadis和Ryman提出用脂質體作為β -半乳糖苷酶載體治療糖原累積疾病后,此后人們開始研究應用脂質體作為不穩(wěn)定的藥物的包埋使其穩(wěn)定化和通過脂質體載體控制藥物釋放。脂質體包埋技術較為成熟，部分脂質體藥物已有臨床應用。制備脂質體常用的方法有手搖法、超聲法、凍干再水化法、表面活性劑去除法、冷凍熔融法、逆向蒸發(fā)法和PH梯度法等。逆相蒸發(fā)法由于適用于包埋水溶性物質且可制得大單室脂質體的特點，成為包埋黃酮類化合物最常用的方法之一。鑒于一般的脂質體在生理條件(即PH中性)下會比較穩(wěn)定，而花青素在PH < 2時比較穩(wěn)定，本發(fā)明采用pH梯度法、逆向蒸發(fā)法兩者相結合的方法制備獲得花青素脂質體混懸液，大大提高了花青素的穩(wěn)定性，同時采用加入凍干保護劑進行冷凍干燥，制備得到了花青素脂質體的凍干粉，便于保存和作為食品、醫(yī)藥保健品和化妝品的原料進行使用。
三、
【發(fā)明內容】

[0006]技術問題
[0007]本發(fā)明的目的是為了解決游離花青素存在的穩(wěn)定性差及生物可利用率差的問題，提供了一種花青素脂質體的制備方法。
[0008]技術方案
[0009]本發(fā)明的制備花青素脂質體的方法是通過以下步驟實現(xiàn)的:
[0010](I)成膜:按摩爾比為1:1?5:1的比例稱取一定量的磷脂和膽固醇置于梨形燒瓶中，并按1:1?10:1的比例加入氯仿或乙醚等有機溶劑溶解，并在10°c?35°C下通過減壓旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，在瓶內壁上形成一層均勻的淺黃色膜脂；
[0011](2)花青素酸性溶液的配置:將花青素與花青素穩(wěn)定劑按重量比為20:5-20:1的比例混合，加入PH2的磷酸緩沖溶液溶解。
[0012](3)超聲波處理:向形成脂膜的梨形燒瓶中重新加入一定量的乙醚等有機溶劑將膜脂溶解，再按磷脂與花青素的重量比為10:1-50:1加入花青素酸性磷酸鹽緩沖溶液，并震蕩混合，得混合液；將_混合液短時間歇超聲處理3?lOmin，使其形成外觀均勻，且在20min內不發(fā)生分層現(xiàn)象的乳狀液；
·[0013](4)逆向蒸發(fā):上述乳狀液置于梨形瓶中，并在15°C?35°C的水浴中，減壓旋轉蒸發(fā)直至有機溶劑去除后形成的凝膠半固態(tài)脂質體從瓶底脫落；
[0014](5)水合:向通過逆向蒸發(fā)得到的脂質體中加入一定體積的pH為7的磷酸鹽緩沖液，室溫下震蕩5?IOmin后得粗脂質體混懸液。
[0015](6)粒徑控制:將粗脂質體擠壓通過0.45 μ m、0.25 μ m或0.10 μ m等不同孔徑的
濾膜，或循環(huán)高壓均質，以獲得不同粒徑范圍的花青素脂質體。
[0016](7)冷凍干燥:在上述脂質體懸浮液中按3_20g / IOOml加入凍干保護劑，然后放入_65°C下預冷凍24小時后用冷凍干燥劑進行冷凍干燥，得到花青素脂質體的凍干粉。
[0017]有益效果
[0018](I)脂質體具有提高芯材穩(wěn)定性，控制芯材釋放，屏蔽不良味道與氣味的作用，本發(fā)明采用PH梯度結合逆相蒸發(fā)法制備花青素脂質體，將花青素包埋在內水相中，降低了花青素受外界環(huán)境影響的敏感性，使花青素更加穩(wěn)定。
[0019](2)脂質體具有靶向性和生物相容性，有利于人體吸收利用，本發(fā)明采用脂質體包埋花青素可有效地提高花青素的生物可利用率。
[0020](3)本發(fā)明采用pH梯度結合逆相蒸發(fā)法制備花青素脂質體，得到了包封率高達85.88%，平均粒徑為234nm的花青素脂質體，實現(xiàn)了在提高花青素穩(wěn)定性同時改善其生物可利用率的技術難題，并且該發(fā)明制備工藝簡單，具有廣泛的應用前景。
[0021 ] (4)通過加入保護劑后進行冷凍干燥，得到花青素脂質體的凍干粉，易于保存運輸以及作為食品、功能保健品和化妝品的原料使用。
四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是應用pH梯度結合逆相蒸發(fā)法制備出的花青素脂質體懸浮液；
[0023]圖2是擠壓過0.45 μ m的膜后的花青素脂質體的粒徑分布曲線；
[0024]圖3是擠壓過0.20 μ m的膜后的花青素脂質體的粒徑分布曲線；
[0025]圖4是擠壓過0.10 μ m的膜的花青素脂質體的粒徑分布曲線。
[0026]發(fā)明的【具體實施方式】
[0027]實施例1:[0028](I)稱取0.0600g的大豆卵磷脂和0.0lOOg的膽固醇置于梨形燒瓶中，量取12mL的氯仿加入其中將磷脂和膽固醇溶解，25°C旋轉蒸發(fā)蒸去氯仿，直至瓶內壁上形成一層均勻的淺黃色膜脂；
[0029](2)花青素溶液的制備:將2mg從黑米麩皮中提取的花青素粉末、0.2mg抗壞血酸溶解在2.0ml pH為2.0的磷酸緩沖溶液中；
[0030](3)向梨形燒瓶中加入12mL乙醚將(I)所制得的膜脂溶解，然后將上述花青素磷酸緩沖液在震蕩下緩慢加入，得混合液，將該混合液短時間歇超聲處理5min，使其形成外觀均勻的乳狀液；
[0031](4)將上述乳狀液在15°C下減壓旋轉蒸發(fā)除去有機相，直至形成凝膠狀的半固體從瓶底脫落，得到混懸液；
[0032](5)向(4)的混懸液中加入50mLpH為7的磷酸鹽緩沖液，并震蕩5min后得粗脂質體，粗脂質體過0.45μ m的濾膜，得到包封率為83.48%，平均粒徑為221nm的花青素脂質體。
[0033](6)在(5)的脂質體混懸液中加入海藻糖5g，并在_65°C下預冷凍24小時，然后用冷凍干燥機冷凍，得到·花青素脂質體粉末。
[0034]實施例2:
[0035](I)稱取0.1200g的大豆卵磷脂和0.0180g的膽固醇置于梨形燒瓶中，量取26mL的氯仿加入其中將磷脂和膽固醇溶解，25°C旋轉蒸發(fā)蒸去氯仿，直至瓶內壁上形成一層均勻的淺黃色膜脂；
[0036](2)花青素溶液的制備:將4mg從黑米麩皮中提取的花青素粉末、0.2mg水溶性維生素E溶解在8.0ml pH為2.0的磷酸緩沖溶液中；
[0037](3)向梨形燒瓶中加入26mL乙醚將(I)所制得的膜脂溶解，然后將上述花青素磷酸緩沖液在震蕩下緩慢加入，得混合液，將該混合液短時間歇超聲處理5min，使其形成外觀均勻的乳狀液；
[0038](4)將上述乳狀液在25°C下減壓旋轉蒸發(fā)除去有機相，直至形成凝膠狀的半固體從瓶底脫落，得到混懸液；
[0039](5)向(4)的混懸液中加入IOOmLpH為7的磷酸鹽緩沖液，并震蕩5min后得粗脂質體，粗脂質體過0.2 μ m的濾膜，得到包封率為76.21%，平均粒徑為187nm的花青素脂質體。
[0040](6)在(5)所制備的脂質體混懸液中加入海藻糖3g，并在_65°C下預冷凍24小時，然后用冷凍干燥機冷凍，得到花青素脂質體粉末。
[0041]實施例3:
[0042](I)稱取0.1800g的大豆卵磷脂和0.0300g的膽固醇置于梨形燒瓶中，量取40mL的氯仿加入其中將磷脂和膽固醇溶解，30°C旋轉蒸發(fā)蒸去氯仿，直至瓶內壁上形成一層均勻的淺黃色膜脂；
[0043](2)花青素溶液的制備:將6mg從黑米麩皮中提取的花青素粉末、1.2mg抗壞血酸溶解在12ml pH為2.0的磷酸緩沖溶液中；
[0044](3)向梨形燒瓶中加入40mL乙醚將(I)所制得的膜脂溶解，然后將上述花青素磷酸緩沖液在震蕩下緩慢加入，得混合液，將該混合液短時間間歇超聲處理5min，使其形成外觀均勻的乳狀液；
[0045](4)將上述乳狀液在30°C下減壓旋轉蒸發(fā)除去有機相，直至形成凝膠狀的半固體從瓶底脫落，得到混懸液；
[0046](5)向(4)的混懸液中加入150mLpH為7的磷酸鹽緩沖液，并震蕩5min后得粗脂質體，粗脂質體經(jīng)循環(huán)高壓均質處理，得到包封率為70.02%，平均粒徑為136 nm的花青素脂質體。
[0047](6)在(5)所制備的脂質體混懸液中加入海藻糖5g，并在_65°C下預冷凍24小時，然后用冷凍干燥機冷凍 ，得到花青素脂質體粉末。
【權利要求】
1.一種花青素脂質體的制備方法，其特征在于應用PH梯度結合逆相蒸發(fā)法，并通過擠壓過膜或循環(huán)高壓均質處理，得到不同粒徑分布的脂質體。其制備通過以下步驟和工藝條件實現(xiàn): (1)成膜:稱取一定量的磷脂和膽固醇，用適量的有機溶劑溶解，并在溫度為15°c?35°C下減壓旋轉蒸發(fā)緩慢除去有機溶劑，直至瓶內壁上形成一層均勻的淺黃色膜脂； (2)超聲波處理:向梨形燒瓶中重新加入有機溶劑將膜脂溶解，再加入酸性的含有穩(wěn)定劑的花青素(pH = 2.0)溶液震蕩混合；將該混合液短時間間歇超聲處理，使其形成外觀均一的乳狀液； (3)減壓旋轉蒸發(fā):將梨形瓶置于25°C?35°C的水浴中，旋轉蒸發(fā)直至凝膠從瓶底脫落； (4)水合:向(3)中的燒瓶里加pH7.0的磷酸鹽緩沖液，室溫下震蕩后得到內、外水相具有PH梯度差的脂質體粗混懸液； (5)粒徑控制:將上述脂質體初混懸液依次擠壓通過0.45 μ m、0.25 μ m、0.1Oym的濾膜，或用高壓均質機均質，得到不同粒徑分布(120nm?230nm)的脂質體。 (6)冷凍干燥:將在上述脂質體混懸液加入保護劑，經(jīng)預冷凍后進行冷凍干燥，得到花青素脂質體的凍干粉。
2.根據(jù)權利要求1 所述的花青素脂質體制備方法，其中所說的磷脂包括豆磷脂、蛋磷脂及其它可用于食品藥品的磷脂中的一種或幾種。
3.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其中所使用的有機溶劑可以是乙醚，氯仿等弱極性，與水不混溶的溶劑。
4.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，含穩(wěn)定劑花青素酸性溶液的制備中使用的穩(wěn)定劑為抗壞血酸、維生素E、小分子酚酸等具有生物活性的花青素穩(wěn)定劑，花青素溶液的配制采用PH2的磷酸緩沖液。
5.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，凍干保護劑包括下列物質的一種或多種:海藻糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等二糖或棉子糖等其它寡聚糖，氯化鈉，磷酸鹽。
6.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其特征(I)在于通過將磷脂與膽固醇溶液混合并用有機溶劑溶解，再通過緩慢減壓蒸發(fā)，首先制成一層膜。磷脂與膽固醇的摩爾比為1:1?1:5。
7.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其特征(2)在于花青素溶于pH為2的含花青素穩(wěn)定劑的酸性緩沖溶液中，使得制成的花青素脂質體所處內水相為酸性，從而保持了花青素原有的結構和具有足夠的穩(wěn)定性?；ㄇ嗨嘏c穩(wěn)定劑的重量比為20:1?20:5。
8.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其特征(3)在于磷脂與花青素的質量比為10:1?50:1。
9.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其特征(4)加入pH7.0的磷酸緩沖液水合，凍干保護劑可以溶在該緩沖溶液中，也可以在形成脂質體混懸液后加入。凍干保護劑的加入量為2?30g / 100ml。
10.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其特征(4)通過擠壓過膜或循環(huán)高壓均質，形成不同粒徑分布范圍的花青素脂質體。
11.根據(jù)權利要求1所述的花青素脂質體制備方法，其特征(5)經(jīng)過預冷凍、冷凍干燥，得到花青素脂質體的凍干粉。該凍干粉易于保存，可作為功能保健品、藥物和化妝品的原料使用 。
【文檔編號】A61K8/49GK103432013SQ201310413928
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】劉琴, 牛文慧, 張薇娜, 胡秋輝 申請人:南京財經(jīng)大學