專利名稱：與pyy類似物結(jié)合的脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及脂質(zhì)體。具體涉及與PYY類似物結(jié)合的、具有優(yōu)良的血中穩(wěn)定性和治療效果的脂質(zhì)體，及其制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
:多肽、蛋白類藥物與傳統(tǒng)藥物相比，不僅具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優(yōu)點(diǎn)，而且還具有不同于傳統(tǒng)藥物的一些特性:1)蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定其活性，影響活性的結(jié)構(gòu)因素主要為氨基酸及其排序、末端基團(tuán)、肽鏈和二硫鍵位置等。此外，藥物的空間結(jié)構(gòu)即二維、三維結(jié)構(gòu)也同樣影響生物活性。2)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)外不穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)外環(huán)境可能經(jīng)受多種復(fù)雜的化學(xué)降解和物理變化而失活，如凝聚、沉淀、消旋化、水解、脫酰氨基等。3)蛋白質(zhì)藥物半衰期短、清除率高、分子量大、易受體內(nèi)酶和細(xì)菌以及體液的破壞、非注射給藥生物利用度低，一般都僅為百分之幾。因此，如何設(shè)計出安全、有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)運(yùn)多肽、蛋白類藥物的新型給藥系統(tǒng)是當(dāng)今制劑工作者和制藥業(yè)面臨的一個重大難題。多肽、蛋白類藥物脂質(zhì)體的研究是當(dāng)前一個十分活躍的領(lǐng)域。脂質(zhì)體用做多肽、蛋白類藥物載體具有眾多優(yōu)點(diǎn)和用途:(I)根據(jù)脂質(zhì)體類似生物膜的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體可以用來測定多肽、蛋白類藥物通過膜的滲透性能及藥物在膜和水相之間的分配性能等；(2)根據(jù)脂質(zhì)體具有細(xì)胞親和性，適合體內(nèi)降解、無毒性和無免疫原性的特點(diǎn)，脂質(zhì)體被廣泛制藥和化妝品中的多肽、蛋白類藥物載體；(3)脂質(zhì)體做為藥物載體可控制藥物的釋放和具有器官靶向性，可用于藥物的可控釋放和體內(nèi)的靶向給藥；(4)利用脂質(zhì)體可與細(xì)胞融合的特性，脂質(zhì)體還可用作將目的基因和其它多肽、蛋白類物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)傳遞的工具，介導(dǎo)轉(zhuǎn)染作用。作為向特定部位輸送大量藥劑的手段，提出了將藥劑封入脂質(zhì)體，使抗體結(jié)合到脂質(zhì)體表面的方法。特別是在 癌的治療領(lǐng)域，有許多關(guān)于其中封入了抗腫瘤藥、與抗體結(jié)合的脂質(zhì)體的有效性的報道(Konno等，Cancer Tes.，47，4471，1987 ;特開昭58-134032號公報。進(jìn)而，作為對脂質(zhì)體存在的問題，即封入物的漏出、脂質(zhì)體的凝集以及在網(wǎng)狀內(nèi)皮器官中的捕獲等的改善方法，提出了向脂質(zhì)體上結(jié)合聚乙二醇的方法(特開平1-249717號公報、特開平 2-149512 號公報、Klibanovet, A.L 等，F(xiàn)EBS Lett.，268，235，1990)。在特開平4-346918號公報中，公開了與蛋白質(zhì)結(jié)合的含有藥劑的脂質(zhì)體，其特征在于具有蛋白質(zhì)和包含聚乙二醇部分的化合物殘基，所述蛋白質(zhì)和化合物殘基分別通過各自的硫羚基與內(nèi)含藥劑的脂質(zhì)體表面的馬來酸亞胺基結(jié)合.這種脂質(zhì)體是使結(jié)合在杭體上的硫巰基和結(jié)合在含聚乙二醇部分的化合物上的硫巰基與脂質(zhì)體表面的馬來酸亞胺基反應(yīng)來制備的，它的特征在于如通過歷來的脂質(zhì)體所觀察到的那樣，在肝臟、脾臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的非特異性攝入得到抑制，實(shí)現(xiàn)了靶向性的化學(xué)療法。PYY是最初從胰腸分離的36個殘基肽酰胺，并位于胃腸道和胰腺的內(nèi)分泌細(xì)胞中(Tatemoto 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.79:2514,1982)。肽 YY 具有 N-端和 C-端酪氨酸酰胺；因此，這兩個酪氨酸給予PYY其名字(Y表示肽命名中的氨基酸酪氨酸)。此外，PYY共享其最初從豬腦分離出來的同源肽神經(jīng)肽Y(NPY)的多個中樞和外周調(diào)節(jié)作用(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sc1.79:5485,1982)。與PYY的細(xì)胞定位相反，NPY存在于粘膜下和腸肌層神經(jīng)元中，其各自神經(jīng)支配粘膜和平滑肌層(Ekblad等，Neuroscience20:169,1987)。認(rèn)為 PYY 和 NPY 都能抑制腸運(yùn)動性和血流(Laburthe, Trends Endocrinol.Metab.1:168,1990)，還認(rèn)為它們在大鼠中減弱基礎(chǔ)的(Cox等，Br.J.Pharmacol.101 =247,1990)和促分泌素誘導(dǎo)的腸分泌(Lundberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci USA79:4471,1982),以及刺激凈吸收(MacFadyen等,Neuropeptides7:219,1986)。總之，這些觀察表明進(jìn)餐后PYY和NPY 釋放至循環(huán)中(Adrian 等，Gastroenterology89:1070,1985 ；Balasubramaniam 等，Neuropeptidesl4:209,1989)，因此在調(diào)節(jié)腸分泌和吸收中起著生理作用。PYY由回腸L細(xì)胞分泌，與攝入的熱量呈正相關(guān)，在循環(huán)中以ΡΥΥ(3_36)形式存在，其分子結(jié)構(gòu)和生物活性均與胰多肽(PP)、神經(jīng)肽Y(NPY)相似，三者同屬肽類家族。近年來研究表明，PYY除在胃腸道功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用外，還在機(jī)體攝食的短期調(diào)節(jié)中起著重要作用，可能參與肥胖的發(fā)生。PYY受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)(大腦-腸道軸)的調(diào)節(jié)，其由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌后，通過G蛋白偶聯(lián)，作用于傳入神經(jīng)或直接作用于下丘腦弓狀核神經(jīng)元，還可通過負(fù)反饋?zhàn)饔米钄囡嬍硵z入刺激所引起的NPY和豚鼠相關(guān)蛋白的表達(dá)和釋放，從而阻斷興奮下丘腦腹外側(cè)核引起的攝食。因而，PYY的水平下降或作用發(fā)生異常可能導(dǎo)致肥胖。研究發(fā)現(xiàn)，PYY(3-36)能迅速抑制小鼠的食物攝入，且抑制率高達(dá)45%。通過外周PYY輸注可以減少雌性肥胖小鼠的 體重增加而不影響其攝食總量；在飲食誘導(dǎo)的雄性肥胖小鼠模型中，ΡΥΥ-3-36的輸注可減少其攝食總量，減輕體重和脂肪堆積，還可阻止飲食過量導(dǎo)致的糖化血紅蛋白Alc的升高，但對血糖水平無明顯影響。以上研究使開發(fā)PYY(3-36)作為一種肥胖治療藥物具有廣闊的前景。然而，天然的PYY生物半衰期短，在體內(nèi)很快被血液中的酶降解，同時，在腎臟被腎小球濾過，被腎小管上的酶代謝。半衰期短的問題是限制該類藥物臨床應(yīng)用的主要原因，本發(fā)明重點(diǎn)解決這
一缺陷。到目前為止，在肥胖領(lǐng)域，脂質(zhì)體制劑應(yīng)用于多肽藥物PYY類似物，目的延長PYY類似物的血漿穩(wěn)定性的研究鮮有報道。發(fā)明詳述本發(fā)明提供將半胱氨酸修飾的PYY(3-36)類似物通過二硫鍵結(jié)合到脂質(zhì)末端的一部分被巰基化的脂質(zhì)體上而得到的脂質(zhì)體，相對于包含在全脂中的Imol巰基化脂質(zhì)，所述PYY類似物的結(jié)合量為85% -98% ;相對于全脂中，所述PYY類似物的結(jié)合量為
0.5-10mol%。構(gòu)成本發(fā)明脂質(zhì)體的脂質(zhì)的例子包括但不限于下述物質(zhì):天然卵磷脂(例如蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿((DMPC)，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，二油酰磷脂酰膽堿((DOPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蘧酰磷脂酸(DMPA)等磷脂，鞘糖脂、甘油糖脂等糖脂、脂肪酸、兩親性二烷基二甲銨、聚甘油烷基醚、聚氧乙烯烷基醚等?？梢詥为?dú)使用這些脂質(zhì)，或是將兩種或兩種以上結(jié)合使用，也可以與膽固醇等非極性物質(zhì)、膽留醇衍生物結(jié)合使用。在本發(fā)明的脂質(zhì)體中，為了結(jié)合多肽衍生物，使用例如巰基化磷脂酰乙醇胺等被巰基化的脂質(zhì)(在本說明書中稱為“巰基化脂質(zhì)”)作為脂質(zhì)體重要組成部分。用巰基化磷脂酰乙醇胺的例子來進(jìn)行說明，這種化合物是由具有與氨基的反應(yīng)性的含巰基乙酸酯的化合物與磷脂酰乙醇胺(PE)的氨基反應(yīng)得到的。所述含巰基的化合物可以含己?；?、苯甲?；⒈交□；葰埢？梢允褂玫腜E有二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE)等磷脂酰乙醇胺類，但優(yōu)選DPPE。構(gòu)成本發(fā)明磷脂/膽甾醇/巰基化磷脂摩爾比為10-30/10/0.1-1 ;更為優(yōu)選的比例是磷脂/膽甾醇/巰基化磷脂摩爾比為10-30/10/0.1-1 ;最為優(yōu)選的比例是磷脂/膽甾醇/疏基化憐脂18/10/0.5.
巰基化脂質(zhì)相對于全脂質(zhì)的比例通常約為0.5-10%。構(gòu)成本發(fā)明的多肽脂質(zhì)體具有較好的控制飲食的功效，具有良好的血漿穩(wěn)定性。

此外，提供作為肥胖治療藥的上述脂質(zhì)體；以及使用所述脂質(zhì)體的肥胖治療方法。
具體實(shí)施方式
:以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步具體的說明，但本發(fā)明的范圍不限于以下的實(shí)施例。實(shí)施例1(I)載體脂質(zhì)體的制備向由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)/膽甾醇/巰基己酰基二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)摩爾比為18/10/0.5)組成的脂質(zhì)體混合物(4.8g)中加入48mL0.3M的檸檬酰緩沖液(pH4.0)，水合之后，用液氮和60°C的溫浴冷凍和解凍3次，制成多層脂質(zhì)體.進(jìn)一步用擠出法將其顆粒大小調(diào)整為0.1微米。脂質(zhì)體混合物配比:二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC) /膽甾醇/巰基己?；鹿瘐Ａ字Ｒ掖及?HS-DLPE)摩爾比為 18/10/0.5 ；二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)/膽留醇/巰基己?；舛罐觉Ａ字Ｒ掖及?HS-DMPE)摩爾比為 18/10/0.5 ；二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC) /膽甾醇/巰基己?；仓Ａ字Ｒ掖及?HS-DSPE)摩爾比為 18/10/0.5 ；二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)/膽留醇/巰基己?；王Ａ字Ｒ掖及?HS-DOPE)摩爾比為18/10/0.5 ；二芥酰磷脂酰膽堿(DEPC)/膽留醇/巰基己?；骢Ａ字Ｒ掖及?HS-DEPE)摩爾比為18/10/0.5 ；天然蛋黃卵磷脂/膽甾醇/巰基己?；貦磅Ａ字Ｒ掖及?HS-DPPE18/10/0.5)；天然大豆黃卵磷脂/膽甾醇/巰基己酰基二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)18/10/0.5 ；
二棕櫚酰磷脂酸(DPPA) /膽留醇/巰基己酰基二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)18/10/0.5 ；二棕櫚酰磷脂酸甘油(DPPG) /膽甾醇/巰基己?；貦磅Ａ字Ｒ掖及?HS-DPPE)18/10/0.5。(2)含有半胱氨酸(Cys)殘基的PYY(3_36)類似物的合成使用微波輔助固相多肽合成儀合成末端和中間位置含有半胱氨酸的PYY (3-36)類似物；akpeacgedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2 ；akpeapcedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2 ；akpecpgedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2 ；akpcapgedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2 ；akceapgedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2 ；acpeapgedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2 ；cakpeapgedaspeelsryyaslrhylnlvtrqry-nh2.
(3)結(jié)合了 PYY(3-36)類似物脂質(zhì)體的制作用緩沖液ImM EDTA的0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)后，溶解(2)中制備的PYY (3-36)類似物。加入⑴中所述的脂質(zhì)，使其在25°C通入空氣，反應(yīng)12小時，使多肽結(jié)合到脂質(zhì)體上。制成結(jié)合了 GLP-1類似物的脂質(zhì)體。(4)結(jié)合PYY類似物 量的定量將脂質(zhì)體溶液作為最終濃度為2%的SDS溶液在60°C加溫30分鐘，使脂質(zhì)體可以完全溶解。使用 GPC 柱(3000SWXL)，用 ρΗ7.0 的緩沖液(25mM NaH2PO4, 200mM Na2SO4,0.1%SDS)進(jìn)行洗脫，分離GLP-1類似物，用在214nm檢出的多肽PYY類似物峰的面積值來對多肽
進(jìn)行定量。(5)脂質(zhì)體的定量用HPLC法對脂質(zhì)(DPPC和膽固醇的總量)進(jìn)行定量。向L-柱0DS4.6mm X250mm中裝入脂質(zhì)體，用四氫呋喃(THF)/乙睛/水(2:1: 1，ν/ν/ν，0.1%三氟乙酸進(jìn)行洗脫。由DPPC的峰面積和膽固醇的峰面積來進(jìn)行定量。向I體積的脂質(zhì)體試樣中加入9體積的上述洗脫液來制備脂質(zhì)體定量用試樣。實(shí)施例2(I)血漿穩(wěn)定性試驗所制備的化合物與人血漿在三乙醇胺-HCl (pH7.8，肽終濃度2 20nM) 37°C條件下孵育1-24小時。最后加入10% (V/V)三氟醋酸/水終止酶促反應(yīng)。酶解產(chǎn)物用C-18反相HPLC分析鑒定，214nm下測定紫外吸收。(2)小鼠急性喂養(yǎng)試驗雄性清潔級小鼠14_16g，隨機(jī)分組，20只為一組。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，控制食物攝入量，讓小鼠一周后體重在22-24g。飼養(yǎng)期間，皮下給生理鹽水0.20ml，使小鼠適應(yīng)。第七天晚上小鼠禁食不禁水，次日皮下給藥。劑量為5.6umol/kg，PYY(3-36)作為陽性對照藥。給藥30min后，給食物。測量1，2，4，8，12，24，36小時的食物重量。血衆(zhòng)穩(wěn)定性試驗結(jié)果:
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體是將半胱氨酸修飾的PYY(3-36)類似物通過二硫鍵結(jié)合到脂質(zhì)末端的一部分被巰基化的脂質(zhì)體上而得到的脂質(zhì)體，相對于包含在全脂中的Imol巰基化脂質(zhì)，所述PYY類似物的結(jié)合量為85% -98%。
2.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述化合物的結(jié)合量相對于全脂為0.5-10mol%。
3.權(quán)利要求1或2的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體選自天然卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酸等磷脂，以及鞘糖脂、甘油糖脂等糖脂、脂肪酸、兩親性二烷基二甲銨、聚甘油烷基醚、聚氧乙烯烷基醚等。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的脂質(zhì)體，其中所述化合物結(jié)合在所述脂質(zhì)體的表面。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的脂質(zhì)體，其中所述聚亞烷基二醇為聚乙二醇。
6.權(quán)利要求5的脂質(zhì)體，其中所述化合物為具有2個聚乙二醇基的化合物。
7.權(quán)利要求6的脂質(zhì)體，其中所述聚乙二醇的分子量為2，000-7,000道爾頓。
8.權(quán)利要求6的脂質(zhì)體，其中所述聚乙二醇的分子量為約5，000道爾頓。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的表面進(jìn)一步結(jié)合了抗體。
10.權(quán)利要求1-9 中任一項的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體可用于制備治療肥胖的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于與PYY類似物結(jié)合的脂質(zhì)體及其制備方法。該發(fā)明是在脂質(zhì)末端的一部分被巰基化的脂質(zhì)體上通過二硫鍵結(jié)合了PYY類似物而得到的脂質(zhì)體，相對于包含在脂質(zhì)體中的1摩爾巰基化脂質(zhì)，所述PYY類似物的結(jié)合量為0.5-10mol％。該脂質(zhì)體在保留了PYY多肽生物活性的同時，增加了PYY類似物在血液中的穩(wěn)定性，延長了PYY類似物在體內(nèi)的半衰期。
文檔編號A61P3/04GK103211764SQ201310163290
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月7日
發(fā)明者曹亮 申請人:上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司