專利名稱：一種氧氟脂質(zhì)微泡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種氧氟脂質(zhì)微泡(Microbubble,MB)及其作為補(bǔ)氧治療劑。
背景技術(shù)：
新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-1schemie encephalopathy, HIE)是指各種圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致胎兒或新生兒腦的缺氧缺血性損傷，是新生兒死亡和兒童期傷殘的主要原因，發(fā)病率約為活產(chǎn)兒的(I 8) / 1000，其中10% 20%在新生兒期死亡，存活者中25% -30%可能留有某種類型的遠(yuǎn)期神經(jīng)發(fā)育后遺癥。治療新生兒缺氧或其它缺氧性疾病，目前采取給氧治療的方式有多種:方法一，常規(guī)吸氧，也是最普遍常用的。對(duì)輕、中型缺氧的患兒，采用鼻導(dǎo)管淺插法給氧，氧流量的大小、濃度、壓力，可間接影響血氧飽和度，當(dāng)氧流量大、濃度高、壓力大、在一定條件下，血氧飽和度可明顯升高，但過高的氧流量，可造成肺損傷，甚至氧中毒。方法二，高壓氧治療。高壓氧(hyperbaric oxygen, HBO)療法是目前有關(guān)HIE治療的研究熱點(diǎn)之一,該療法是在高壓環(huán)境下使用氧氣治療疾病，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣泛，但其在應(yīng)用時(shí)間、適應(yīng)證、壓力選擇及療程等方面還存在分歧，尤其會(huì)引發(fā)很多并發(fā)癥:減壓病、神經(jīng)性氧中毒、肺組織纖維化、晶狀體后纖維化組織增生等，故而在一定程度上限制了其應(yīng)用。方法三，靜脈輸入高氧液。光量子氧透射液體療法是其中的一種，其是以5% 10%葡萄糖或生理鹽水作為載體，經(jīng)特定波長(zhǎng)、特定強(qiáng)度的紫外線照射、充氧、磁極化后輸入人體靜脈血管內(nèi)的一種特殊方法。它將量子能量、臭氧攜入人體內(nèi)，并被血液中各種細(xì)胞吸收，從而產(chǎn)生一系列光化學(xué)物理效應(yīng)，以增加血氧飽和度，提高紅細(xì)胞攜氧和氧分壓，降低二氧化碳?jí)海瑥亩纳平M織缺氧缺血狀態(tài)，提高組織攝氧能力。光量子療法對(duì)人體多種疾病均有一定的治療效果。因此，在H IE臨床治療方面更有價(jià)值的是研究一種更有效更直接的靜脈氧傳遞方式，即微泡造影劑作為氧載體傳送氧氣到達(dá)缺氧腦組織。這種方式可保證氧氣不需要經(jīng)過呼吸系統(tǒng)交換而可以直接進(jìn)入血液，可以更快地補(bǔ)給氧氣，改善大腦缺氧狀態(tài)，可望成為一種新的治療方式。近幾年來，超聲微泡造影劑已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。微泡造影劑目前被認(rèn)為是最好的人體微管內(nèi)的造影材料，在醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)中得到了越來越多的應(yīng)用。除了作為超聲診斷藥劑之外，更多的研究發(fā)現(xiàn)微泡造影劑是一種高效的載體，且超聲輻照能使其定向爆破，將所載之基因或藥物釋放在靶組織內(nèi)，在促進(jìn)血栓溶解、基因轉(zhuǎn)染及藥物體內(nèi)運(yùn)輸定點(diǎn)釋放方面已取得一定的成效。微泡載氧的研究目前尚處于起步階段,而國(guó)外學(xué)者Bisazza A等(Int J Pharm.2009，378(1-2):215-217)公開了一種殼聚糖外殼的氧氣微泡，其氣體核為單純氧氣，平均粒徑2 Mffl，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可作為工具運(yùn)載氧氣到缺氧組織，具有滲透性、無毒性、無溶血性、擴(kuò)散能力好，是一種安全、有效的載體，可運(yùn)送氧氣到缺氧組織。微泡的尺寸符合安全注射進(jìn)入毛細(xì)血管網(wǎng)的要求，外殼能夠?qū)⒀鯕忉尫懦鰜怼Ｔ? MHz超聲輻照下氧氣釋放加速，共聚焦激光掃描電鏡及免疫熒光圖像顯示此種納米造影劑能散播到細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)。現(xiàn)研究表明，微泡聯(lián)合超聲輻照能可逆開放血腦屏障(BBB)，并未引起急性神經(jīng)細(xì)胞的損傷，通過腦微血管運(yùn)送微泡將治療化合物到大腦組織，再經(jīng)超聲誘導(dǎo)微泡破裂在大動(dòng)物模型中滲透?jìng)鬟f藥物。這種誘導(dǎo)BBB開放的方法是可逆的，能作為一種安全的非侵入性的方法經(jīng)BBB完成藥物或基因的傳遞。微泡造影劑發(fā)展過程中曾僅以氧氣為核心，這樣看似載氧量極高，其實(shí)因氧氣的分子量小，易受動(dòng)脈壓力影響，微球里的氣體很快擴(kuò)散，球壁塌陷而迅速失去聲反射性，并且不能隨血流分布至全身，所以限制了其使用范圍。而氟碳?xì)怏w作為大分子惰性氣體，表現(xiàn)出了較小的彌散度，其在微球中不易穿過球壁而擴(kuò)散，能耐受33 330.5Pa以上的動(dòng)脈壓力，它在血管內(nèi)停留的時(shí)間足以滿足實(shí)際應(yīng)用所需要的最大值。其中全氟化碳的獨(dú)特特性包括疏水性、疏脂性、極惰性、衍生性，可預(yù)報(bào)性、氟原子的電子結(jié)構(gòu)和空間需求等，其低水溶性是其在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在的關(guān)鍵，全氟化碳具有氧氣的高溶解特性，如果能將氧氣和氟碳?xì)怏w結(jié)合一起作為氣體核，具有既可以維持微泡的穩(wěn)定性和體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)存在，也可以傳遞氧氣到靶組織的優(yōu)勢(shì)。脂質(zhì)微泡的優(yōu)良載藥性能和靶向性能，脂質(zhì)微泡在載藥、載基因及靶向顯像方面已相當(dāng)成熟，腦組織內(nèi)顯像效果好，聯(lián)合一定能量的超聲輻照能夠可逆地開放血腦屏障。CN200810217176公開了一種超聲造影劑，由合成磷脂或其聚二乙醇衍生物10-90%和糖脂成分10-90%主要組成復(fù)合脂膜，脂膜內(nèi)充有全氟碳?xì)怏w，該造影劑穩(wěn)定，耐壓性好，載藥量大。CN200310122421.2公開了一種以磷脂成分為成膜材料的超聲造影劑組合物，該組合物由磷脂成分1%-10%/起泡劑5%-15%聚合物70-90%0穩(wěn)定劑0.5%_10%和氟碳?xì)怏w組成。CN200448002975.2公開了一種凍干基質(zhì)的脂質(zhì)造影劑，由磷脂穩(wěn)定的充氣微泡的液體水溶性混懸液，制備一種水溶性介質(zhì)/磷脂和水不溶性有機(jī)溶劑組成的乳劑，凍干，然后在充氣微泡的水溶性混懸液中重建而成。本發(fā)明人在脂質(zhì)微泡基礎(chǔ)上，通過將超聲、化學(xué)等技術(shù)相結(jié)合，在微泡核中溶入氧氣，構(gòu)建出一種新型的、穩(wěn)定的氧氟脂質(zhì)微泡，其在超聲儀可視監(jiān)控下，被超聲輻照破壞，將氧氣釋放在缺氧腦組織，以實(shí)現(xiàn)直接、定點(diǎn)且高效供氧、滿足神經(jīng)細(xì)胞的需氧要求，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，避免由于缺氧未及時(shí)糾正而導(dǎo)致細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)損傷的目的。本發(fā)明的脂質(zhì)微泡以載氧治療為目的研究國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道，這種將超聲造影劑技術(shù)與生物化學(xué)治療技術(shù)相結(jié)合的新興技術(shù)，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景，可為臨床HIE患兒的早期糾正缺氧治療提供一個(gè)新思路和新手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效載氧、性能穩(wěn)定、粒徑均勻的氧氟脂質(zhì)微泡，該氧氟脂質(zhì)微泡，由微泡、和存于微泡內(nèi)的氧氣和全氟化碳?xì)怏w組成，其中，微泡主要由合成磷脂、天然磷脂或氫化磷脂和它們的聚乙二醇衍生物構(gòu)成，氧氣與全氟化碳的體積比為4:1 8:1。在一實(shí)施方案中， 本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡，由微泡、和存于微泡內(nèi)的氧氣和全氟化碳?xì)怏w組成，其中，微泡主要由合成磷脂及其聚乙二醇衍生物構(gòu)成，氧氣與全氟化碳的體積比為4:1 8:1，其中合成磷脂與其(合成磷脂的)聚乙二醇衍生物的重量比為1:9 — 9:1，優(yōu)選為5:2。在上述實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡，所述合成磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰甘油一種或幾種，優(yōu)選二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC);所述合成磷脂為聚乙二醇衍生物為聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺的一種，優(yōu)選甲氧基聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)，所述氧氣與全氟化碳的體積比優(yōu)選為5:1，所述全氟化碳選自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一種或幾種，優(yōu)選全氟丙烷。在上述實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡，脂質(zhì)微泡的平均粒徑為0.5
4.0 μ m,優(yōu)選平均粒徑為0.9 2.0 μ m。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡，由微泡、和存于微泡內(nèi)的氧氣和全氟化碳?xì)怏w組成，其中，微泡主要由二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和甲氧基聚乙二醇5000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)構(gòu)成，其重量比為1:9 一 9:1，優(yōu)選為5:2，氧氣與全氟化碳的體積比為4:1-8:1，優(yōu)選5:1，所述全氟化碳選自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一種或幾種，優(yōu)選全氟丙烷。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡，由微泡、和存于微泡內(nèi)的氧氣和全氟丙烷氣體組成，其中，微泡主要由二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和甲氧基聚乙二醇5000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)構(gòu)成，其重量比為5:2，氧氣與全氟丙烷的體積比為5:1。在上述具體和優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡，脂質(zhì)微泡的平均粒徑為0.5 4.0 μ m,優(yōu)選平均 粒徑為0.9 2.0 μ m。本發(fā)明還提供了一種氧氟脂質(zhì)微泡的制備方法，包括以下步驟:
a)在合成磷脂、天然磷脂或氫化磷脂和它們的聚乙二醇衍生物中加入甘油和PBS，加熱溶解，得到溶液；
b )在步驟a的溶液中排除空氣，加壓通入含有氧氣和全氟碳的混合氣體，其中，氧氣與全氟化碳的體積比為4:1-8:1;
c )利用超聲或機(jī)械振蕩步驟b的溶液，形成得到白色乳液狀脂質(zhì)微泡混懸液，獲得氧氟脂質(zhì)微泡。上述本發(fā)明的方法，所述合成磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺或二棕櫚酰磷脂酰甘油，優(yōu)選二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，所述合成磷脂為聚乙二醇衍生物為聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、或甲氧基聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺，優(yōu)選甲氧基聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-MPEG5000)，所述氧氣與全氟化碳的體積比為5:1，所述全氟化碳選自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一種或幾種，優(yōu)選全氟丙烷。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡的制備方法，包括以下步驟:a)在二硬脂酰磷脂酰膽堿和甲氧基聚乙二醇5000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(重量比5:2)中加入甘油和PBS，加熱溶解，得到溶液；
b )在步驟a的溶液中排除空氣，加壓通入含有氧氣和全氟丙烷的混合氣體，其中，氧氣與全氟丙烷的體積比為5:1;
c )利用超聲或機(jī)械振蕩步驟b的溶液，形成得到白色乳液狀脂質(zhì)微泡混懸液，獲得氧氟脂質(zhì)微泡。本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡性能穩(wěn)定、粒徑均勻，能用于超聲增強(qiáng)顯影，同時(shí)高效、穩(wěn)定載氧，克服單氣體氧易損失的缺點(diǎn)。本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡聯(lián)合超聲輻照對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞提供了供氧治療效果，為新生兒缺氧缺血性腦病在早期及時(shí)、安全、高效供氧，改良預(yù)后提供了一個(gè)新手段。同時(shí)，本發(fā)明的氧氟脂質(zhì)微泡中氧氣成分具有兩種功效:一作為顯像成分即用作超聲造影劑，二作為“治療藥物”，為 缺氧細(xì)胞靶向供氧，即作補(bǔ)氧治療劑，一舉兩得。


圖1、微泡光鏡圖(X 400 )
圖2、氧氟脂質(zhì)微泡粒徑分布圖 圖3、氧氟脂質(zhì)微泡對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞毒性百分比 圖4、氧氟脂質(zhì)微泡對(duì)細(xì)胞HIF-1 a蛋白表達(dá)百分比 圖5、兔肝顯影的時(shí)間強(qiáng)度曲線圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1氧氟脂質(zhì)微泡的制備
O精密稱量器稱取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于膠囊瓶中，加入50 μ I甘油及450 μ IPBS ；2)在55°C恒溫水浴箱中加熱30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜將膠囊瓶密封；4)用注射器分別抽取3體積的氧氣及I體積的全氟丙烷，利用三通管在負(fù)壓條件下將氧氣及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在負(fù)壓條件下用混合氣體置換膠囊瓶中的空氣，達(dá)到飽和狀態(tài)；6)利用銀汞膠囊調(diào)和器機(jī)械震蕩后，即得到白色乳液狀脂質(zhì)微泡混懸液，即得氧氟脂質(zhì)微泡，放于4°C冰箱保存。2)實(shí)施例2 氧氟脂質(zhì)微泡的制備
I)精密稱量器稱取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于膠囊瓶中，加入50 μ I甘油及450 μ IPBS ；2)在55°C恒溫水浴箱中加熱30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜將膠囊瓶密封；4)用注射器分別抽取4體積的氧氣及I體積的全氟丙烷，利用三通管在負(fù)壓條件下將氧氣及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在負(fù)壓條件下用混合氣體置換膠囊瓶中的空氣，達(dá)到飽和狀態(tài)；6)利用銀汞膠囊調(diào)和器機(jī)械震蕩后，即得到白色乳液狀脂質(zhì)微泡混懸液，即得氧氟脂質(zhì)微泡，放于4°C冰箱保存。實(shí)施例3氧氟脂質(zhì)微泡的制備
I)精密稱量器稱取50mgDSPC及20mgDPPE-MPEG5000于膠囊瓶中，加入50 μ I甘油及450 μ IPBS ；2)在55°C恒溫水浴箱中加熱30min，使DSPC及DPPE-MPEG5000完全溶解在溶液中；3)用封口膜將膠囊瓶密封；4)用注射器分別抽取5體積的氧氣及I體積的全氟丙烷，利用三通管在負(fù)壓條件下將氧氣及全氟丙烷混合；5)利用三通管，在負(fù)壓條件下用混合氣體置換膠囊瓶中的空氣，達(dá)到飽和狀態(tài)；6)利用銀汞膠囊調(diào)和器機(jī)械震蕩后，即得到白色乳液狀脂質(zhì)微泡混懸液，即得氧氟脂質(zhì)微泡(MB(5:1))，放于4°C冰箱保存。實(shí)施例4-7 氧氟脂質(zhì)微泡的制備
權(quán)利要求
1.一種氧氟脂質(zhì)微泡，由微泡、和存于微泡內(nèi)的氧氣和全氟化碳?xì)怏w組成，其中，微泡主要由合成磷脂、氫化磷脂或天然磷脂和它們的聚乙二醇衍生物構(gòu)成，氧氣與全氟化碳?xì)怏w的體積比為4:1-8:1。
2.如權(quán)利要求1所述的微泡，合成磷脂與合成磷脂聚乙二醇衍生物的重量比為1:9 -9:1，優(yōu)選為5:2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的微泡，所述合成磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰甘油的一種或幾種，所述合成磷脂的聚乙二醇衍生物為聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的微泡，所述氧氣與全氟化碳的體積比為5:1。
5.如權(quán)利要求1或4所述的微泡，所述全氟化碳選自全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求5所述的微泡，所述全氟化碳為全氟丙烷。
7.如權(quán)利要求1所述的微泡，脂質(zhì)微泡的平均粒徑為0.5 4.0 μ m，優(yōu)選平均粒徑為0.9 2.0 μ mD
8.一種氧氟脂質(zhì)微泡的制備方法，包括以下步驟: a在合成磷脂、天然磷脂或氫化磷脂和它們的聚乙二醇衍生物中加入甘油和PBS，加熱溶解，得到溶液； b 步驟a的溶液排除 空氣，并加壓通入含有氧氣和全氟化碳的混合氣體，其中，氧氣與全氟化碳的體積比為4:1-8:1; c利用超聲或機(jī)械振蕩步驟b的溶液，形成得到白色乳液狀脂質(zhì)微泡混懸液，獲得氧氟脂質(zhì)微泡。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，所述合成磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰甘油的一種或幾種，優(yōu)選二硬脂酰磷脂酰膽堿，所述合成磷脂為聚乙二醇衍生物為聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、甲氧基聚乙二醇5000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺的一種，優(yōu)選甲氧基聚乙二醇5000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，所述氧氣與全氟化碳的體積比為5:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氧氟脂質(zhì)微泡補(bǔ)氧治療劑，由微泡、和存在于微泡內(nèi)的氧氣和至少一種全氟化碳組成，氣體核以氧氣為主，全氟化碳為輔，其中，微泡主要由磷脂及其聚乙二醇衍生物構(gòu)成。該氧氟脂質(zhì)微泡補(bǔ)氧治療劑在人體內(nèi)可以通過靜脈輸送并靶向缺氧組織在超聲輻照下控制釋放氧氣，治療缺氧性疾病，同時(shí)作為造影劑用于超聲增強(qiáng)顯影，因此，該微泡既是顯影劑，更是補(bǔ)氧治療劑。
文檔編號(hào)A61K49/22GK103212094SQ201310154479
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者楊春江, 唐毅, 肖歡, 王蕎, 李攀, 王冬, 高洋 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院