專利名稱：京尼平氨基酸衍生物作為NF-κB抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種作為NF-K B抑制劑，用于預(yù)防、緩解和/或治療情感性精神障礙神經(jīng)系統(tǒng)疾病(抑郁癥)及慢性、急性炎癥等的藥物或保健食品，特別涉及用于治療NF- K B異常激活有關(guān)的藥物或保健食品。
背景技術(shù)：
核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear transcription factor kappa-B, NF- κ B)最早是從 B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κ B序列(GGGACTTTCC)特異結(jié)合的核蛋白因子，因而稱之為NF-κ B。通常生理情況下NF-κ B與抑制蛋白因子IKBdnhibitor of κ B) 在胞質(zhì)中結(jié)合，處于非激活狀態(tài)。當(dāng)受到外源性刺激后，I κ B激酶(ΙΚΚ，包括IKK α和IKK β )被激活，能在氨基酸末端絲氨酸殘基特異位點(diǎn)(I K B α和I K B β )磷酸化抑制蛋白因子I K B。I κ B α在32和36位氨基酸末端絲氨酸殘基被磷酸化，而I κ B β在19和23位氨基酸末端絲氨酸殘基被磷酸化。磷酸化后的IkB被Ε3泛素連接酶選擇性泛素化，導(dǎo)致存在于胞漿內(nèi)的已磷酸化及泛素化的I κ B被26S蛋白酶降解。降解后的I κ B與NF- κ B分離，NF- κ B由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)眾多細(xì)胞介質(zhì)和炎癥因子(如TNF-a，IL-6, IL-1 β，iNOS, COX-2, G-CSF，sICAM-1, IL-1 a，IL-lra, KC, JE, MIP-1 β，RANTES等)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，從而參與組織細(xì)胞的生理、病理反應(yīng)。NF- κ B通路激活后產(chǎn)生活化的NF- κ B，而活化的NF- κ B功能的失調(diào)與多種人類疾病相關(guān)，如惡性腫瘤，自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等),心腦血管疾病,急性、慢性炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如抑郁癥，阿爾茨海默病等)。例如:在嚴(yán)重抑郁性障礙病癥中，激活NF-κ B通路后能夠增加炎性因子的表達(dá)，并且能夠增加5ΗΤ1Α基因的表達(dá)，減少5-ΗΤ神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致抑郁癥。因此，NF-κ B已成為一個(gè)重要的藥物作用靶點(diǎn)。針對(duì)NF-κ B通路激活途中的不同環(huán)節(jié)作為靶點(diǎn)進(jìn)行拮抗，是治療上述疾病的關(guān)鍵。尋找NF-κ B通路抑制劑，對(duì)哮喘，嚴(yán)重抑郁性障礙等具有重要的臨床治療意義。NF-KB是調(diào)控眾多炎癥基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其通常以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到LPS、TNF- α等刺激時(shí)，NF- κ B得以活化并從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，啟動(dòng)多種炎癥基因表達(dá)，使大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于炎癥部位。巨噬細(xì)胞在炎癥的啟動(dòng)過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用，它通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，釋放細(xì)胞因子、具有生物活性的脂類介質(zhì)等一系列炎癥介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)。NF- κ B發(fā)生核轉(zhuǎn)位是一些免疫和炎癥反應(yīng)的重要步驟，應(yīng)用NF-κ B抑制劑以減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生成為治療炎癥的新思路。京尼平氨基酸衍生物，又稱京尼平藍(lán)或桅子藍(lán)色素，在東亞被作為天然食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)及化妝品和醫(yī)藥工業(yè)。桅子藍(lán)色素是以桅子的果實(shí)為原料，通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的一種純天然藍(lán)色素，它是桅子苷在β -葡糖糖苷酶的作用下水解生成京尼平，京尼平與含有伯胺基的氨基酸(甘氨酸，賴氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸等)在合適的條件下發(fā)生聚合反應(yīng)的產(chǎn)物，京尼平與甘氨酸的反應(yīng)方程式如圖1所示。
京尼平氨基酸衍生物除上述作為天然食品添加劑用于食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)夕卜，未見(jiàn)其有抑制NF- κ B活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供京尼平氨基酸衍生物在制備治療人和動(dòng)物因NF-κ B因子異常激活相關(guān)疾病藥物或保健品的應(yīng)用；尤其是惡性腫瘤，自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等),心腦血管疾病，急性、慢性炎癥，情感性精神障礙神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如抑郁癥，阿爾茨海默病等)等相關(guān)疾病的應(yīng)用；其次是該衍生物能夠與其他藥物連用，作為增敏劑用于治療急性、慢性炎癥及抑郁癥等與NF-κ B因子異常激活相關(guān)疾病的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種京尼平氨基酸衍生物在制備核因子NF-κ B抑制劑的用途。京尼平氨基酸衍生物在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療由核因子NF-K B活化引起的病理性病癥的藥物或保健品中的用途。其中，所述病理性病癥為惡性腫瘤，自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)，心腦血管疾病，急性炎癥、慢性炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如抑郁癥，阿爾茨海默病等)中的一種或多種，優(yōu)選為急性炎癥、慢性炎癥或抑郁癥中的一種或多種。其中，所述的京尼平氨基酸衍生物為京尼平與含有伯胺基的氨基酸的衍生物。特別是，所述的含有伯胺基的氨基酸選擇丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等中的一種或多種。本發(fā)明的京尼平氨基酸衍生物按照如下順序進(jìn)行的步驟制備而成:本發(fā)明選用的是菌草科(Rubiaceae)植物桅子(Gardeniajasminoides Ellis)果實(shí)的主要化學(xué)成分桅子苷(Geniposide)，在β -葡糖糖苷酶的作用下水解生成京尼平，京尼平與含有伯胺基的氨基酸(丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等)在合適的條件下發(fā)生聚合反應(yīng)的產(chǎn)物。具體制備條件如下:將等摩爾量的京尼平和氨基酸加入到PBSdOOmmol，pH7.0)緩沖溶液中，80°C攪拌4h，接著將得到的京尼平氨基酸衍生物過(guò)HP-20大孔樹(shù)脂柱，進(jìn)行分離，并收集吸光度值為590nm的洗脫液，將收集到的洗脫液冷凍干燥機(jī)干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8°C冷藏保存，待用。其中，所述京尼平氨基酸衍生物按照如下順序進(jìn)行的步驟制備而成:I)將等摩爾的京尼平和氨基酸依次加入到PBS緩沖溶液(磷酸緩沖溶液)中，混勻；2)加熱并保持溫度為60_80°C，電磁攪拌反應(yīng)至少4h，即得。特別是，步驟 I)中所述京尼平為桅子苷(Geniposide)在β -葡糖糖苷酶的作用下水解而成；所述氨基酸為含有伯胺基的氨基酸，例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等；所述PBS緩沖溶液的pH值為7.0。尤其是，所述氨基酸選擇甘氨酸、酪氨酸。其中，步驟I)中所述京尼平與所述PBS溶液的的摩爾數(shù)之比為8.8:100。特別是，每IOOml所述PBS溶液中加入2.2mmol所述京尼平。其中，步驟2)中所述溫度優(yōu)選為80°C，電磁攪拌反應(yīng)時(shí)間為4_8h。特別是，還包括步驟3)，將反應(yīng)混合物通過(guò)HP-20大孔樹(shù)脂柱，進(jìn)行洗脫、分離，收集吸光度值為590nm的洗脫液，然后將洗脫液干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。尤其是，所述的梯度洗脫的洗脫劑為乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液，其中洗脫劑中乙酸乙酯-甲醇-水的體積之比為8:3:1。其中，所述藥物由京尼平氨基酸衍生物和藥學(xué)上可接受的載體組成。本發(fā)明中所述的京尼平氨基酸衍生物作為一種NF-K B抑制劑時(shí)，可以單獨(dú)使用，也可以通過(guò)含有京尼平氨基酸衍生物的藥物組合物的形式使用。本發(fā)明所述藥物是通過(guò)口服、舌下、經(jīng)皮、肌肉、皮下、皮膚黏膜、尿道、陰道、靜脈等途徑給藥。藥物組合物，通過(guò)本發(fā)明藥物組合物含有0.1-99.9%重量的京尼平氨基酸衍生物，藥物組合可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。本發(fā)明所述所述京尼平氨基酸衍生物純度超過(guò)90%。

本發(fā)明以京尼平氨基酸衍生物為活性成分，制備用于因核因子NF-κ B活化引起疾病的抑制劑的藥物制劑和相應(yīng)的藥物劑型。所述藥物制劑是以所述京尼平氨基酸衍生物為有效活性成分，并包括了藥劑學(xué)上可接受的其它載體組分。本發(fā)明所述藥物以口服制劑、注射劑、局部給藥制劑形式存在。其中所述口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑；注射劑包括注射液劑型或注射用凍干粉針劑型；局部給藥制劑包括霜?jiǎng)④浉鄤?、噴霧劑、氣霧劑、貼劑、凝膠劑、巴布劑。本發(fā)明中所述藥物以片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、注射劑、噴霧劑、氣霧劑、貼劑、凝膠劑、巴布劑形式存在，即藥物制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、注射劑、噴霧劑、氣霧劑、貼劑、凝膠劑、巴布劑等形式，但不局限于以上形式。在制備口服制劑時(shí)可選用的載體可以是淀粉、糊精或環(huán)糊精及各種化學(xué)修飾環(huán)糊精、蔗糖、硬脂酸鹽等常規(guī)制藥輔料。在制備凍干粉針劑時(shí)可以通過(guò)無(wú)菌噴霧干燥、低溫真空干燥、冷凍干燥等方法制備。各制劑的后期制備工藝及設(shè)備均屬于制藥領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明對(duì)此不作限定。本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明發(fā)掘了京尼平氨基酸衍生物新的用途，將其用于核因子NF-κ B抑制劑，并可制備成預(yù)防、緩解和/或治療由核因子NF-κ B活化引起的病理性病癥的藥物或保健品，從而為京尼平氨基酸衍生物的應(yīng)用開(kāi)拓了一個(gè)新的領(lǐng)域。2、本發(fā)明的京尼平氨基酸衍生物作為核因子NF-κ B抑制劑的作用機(jī)理明確，療效顯著，毒副作用小、安全性好，能夠長(zhǎng)期服用，具有較高的成藥性和良好的藥用前景。3、本發(fā)明的產(chǎn)品來(lái)源豐富、價(jià)廉、臨床使用安全，制備工藝簡(jiǎn)單，可制成各種劑型，使用方便，因此易于推廣。


圖1是京尼平與甘氨酸的反應(yīng)方程式。圖 2 是以 β -actin 作為內(nèi)參，Western Blot 分析 Ρ_Ι κ B-α，I κ B-α，IKK-α，ΙΚΚ-β蛋白的表達(dá)的凝聚電泳圖。圖3是與炎癥相關(guān)40種蛋白表達(dá)的蛋白芯片掃描圖；其中(a)為空白對(duì)照組蛋白芯片掃描圖，(b)為模型組(LPS刺激組)蛋白芯片掃描圖，(c)為京尼平甘氨酸衍生物組的蛋白芯片掃描圖。圖4是蛋白芯片中與炎癥相關(guān)40種蛋白表達(dá)結(jié)果的光密度分析圖；其中LPS為模型組，Blue pigments為京尼平甘氨酸衍生物組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。以下通過(guò)試驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藥物或保健品的NF-K B抑制作用，這些試驗(yàn)例包括了本發(fā)明藥物的藥效學(xué)試驗(yàn)。本發(fā)明采用體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW274.7細(xì)胞株，給予京尼平甘氨酸衍生物(25，50，100 μ Μ)干預(yù)2h后，LPS (脂多糖200ng/mL)刺激0.5h后，驗(yàn)證藥物對(duì)NF- κ B通路的抑制作用。本發(fā)明通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證京尼平氨基酸衍生物對(duì)炎癥相關(guān)因子基因、蛋白的調(diào)節(jié)作用；通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物模型(角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足趾腫脹，LPS腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性炎癥模型)驗(yàn)證京尼平氨基酸衍生物對(duì)急性炎癥的調(diào)節(jié)作用；通過(guò)小鼠行為絕望實(shí)驗(yàn)、小鼠開(kāi)放場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、小鼠利血平拮抗實(shí)驗(yàn)以及大鼠慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證京尼平氨基酸衍生物的抗抑郁作用。本發(fā)明中使用的藥物京尼平氨基酸衍生物為京尼平丙氨酸衍生物，京尼平纈氨酸衍生物，京尼平亮氨酸衍生物，京尼平異亮氨酸衍生物，京尼平苯丙氨酸衍生物，京尼平色氨酸衍生物，京尼平甲硫氨酸衍生物，京尼平脯氨酸衍生物，京尼平甘氨酸衍生物，京尼平絲氨酸衍生物，京尼平蘇氨酸衍生物，京尼平半胱氨酸衍生物，京尼平酪氨酸衍生物，京尼平天冬酰胺氨酸衍生物，京尼平谷胺酰胺氨酸衍生物，京尼平組氨酸衍生物，京尼平賴氨酸衍生物，京尼平精氨酸衍生物，京尼平天冬氨酸衍生物，京尼平谷氨酸衍生物等。本發(fā)明中使用的藥物京尼平氨基酸衍生物按照如下方法制備而成:將8.8mmol的京尼平和8.8mmol的氛基酸依次加入到400mT,的PBS(100mmol,PH7.0)溶液中，80°C攪拌4h，接著將得到的京尼平氨基酸衍生物過(guò)HP-20大孔樹(shù)脂柱，進(jìn)行洗脫分離，并收集吸光度值為590nm的洗脫液，將收集到的洗脫液冷凍干燥機(jī)干燥，即得京尼平氨基酸衍生物成品。得到的京尼平氨基酸衍生物密封于2-8° C冷藏保存，待用。試驗(yàn)例INF-κ B 核因子轉(zhuǎn)錄試劑盒法(NF-κ B Universal EZ-TFA TranscriptionFactor Assay)和 Western Blot 法檢測(cè) NF- κ B 活性1.1實(shí)驗(yàn)材料
小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供；含有L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉及Hepes配方的DMEM高糖培養(yǎng)基(干粉)，Sigma-Aldrich公司(美國(guó))。按照說(shuō)明書用MilliQ級(jí)純水配制并過(guò)濾除菌，2-8°C冷藏保存；含有L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉，不含酚紅配方的DMEM高糖培養(yǎng)基(液體)，Hyclone公司(美國(guó))；熱滅活胎牛血清(H1-FBS), Bioind公司(以色列)；核蛋白提取試劑盒，Active Motif公司(日本)；NF- κ B Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay (NF-κ: B 核因子轉(zhuǎn)錄試劑盒)，Millipore公司(美國(guó));Ρ_Ι κ B- α , I κ B- a , IKK-α，IKK-β單克隆抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，Cell Singaling Technology 公司(美國(guó))；β -actin 單克隆抗體,Sigma-AIdrich公司(美國(guó))；Horseradish peroxidase substrate 顯色底物，Millipore 公司(美國(guó))；NF- κ B inhibitor BAY11-7082,碧云天生物技術(shù)研究所(中國(guó))；京尼平甘氨酸衍生物,京尼平酪氨酸衍生物，本實(shí)驗(yàn)室自制；Ma_alian Cell Lysis細(xì)胞裂解試劑盒,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(中國(guó))；BCA總蛋白測(cè)定試劑盒，Pierce公司(美國(guó))；Tris Base,Sigma-Aldrich 公司(美國(guó))。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1核蛋白提取I)將RAW264.7細(xì)胞以每孔5.0 X IO6個(gè)細(xì)胞種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后換液，將供試細(xì)胞分成6組，空白對(duì)照組，模型組，京尼平甘氨酸衍生物高劑量組，京尼平甘氨酸衍生物中劑量組，京尼平甘氨酸衍生物低劑量組和對(duì)照藥物組，其中空白對(duì)照組換入無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基組；模型組換入含LPS (200ng/mL)的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基；京尼平甘氨酸衍生物高劑量組換入含有京尼平甘氨酸衍生物(100 μ Μ) +LPS (200ng/mL)的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基；京尼平甘氨酸衍生物中劑量組換入含有京尼平甘氨酸衍生物(SOyMHLPSOOOng/mL)的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基；京尼平甘氨酸衍生物低劑量組換入含有京尼平甘氨酸衍生物(25 μ M)+LPS (200ng/mL)的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基；對(duì)照藥物組換入含有NF-κ B抑制劑BAYl 1-7082 (10 μ Μ) +LPS (200ng/mL)的無(wú)酚紅 DMEM 培養(yǎng)基。

2)換入無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基藥物干預(yù)2h后，加入濃度為200ng/mL的LPS再刺激30min，然后用冷的PBS(磷酸緩沖液，pH7.4)清洗細(xì)胞3次。加入細(xì)胞裂解液后按照核蛋白提取試劑盒(Active Motif)進(jìn)行。將提取得到的核蛋白用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce)進(jìn)行蛋白定量，最后用無(wú)菌的PBS將蛋白濃度調(diào)整為2mg/mL。1.2.2NF- κ B核因子轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)NF-κ B是調(diào)控眾多炎癥基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其通常以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到LPS、TNF-α等刺激時(shí)，NF-kB得以活化并從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，啟動(dòng)多種炎癥基因表達(dá)。NF- κ B活化入核主要是其亞基Ρ50和Ρ65，因此測(cè)定其亞基Ρ50和Ρ65的活性，能夠反映出NF-κ B入核情況。核因子轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)采用Universal EZ-TFATranscription Factor Assay試劑盒進(jìn)行，將 1.2.I 提到的核蛋白，按照Universal EZ-TFATranscription Factor Assay試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。1.2.3ffestern Blot 法檢測(cè) NF- κ B 活性I)將RAW264.7細(xì)胞以每孔5.0X IO6個(gè)細(xì)胞種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后換液，換入含有藥物的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基，藥物組分別為京尼平甘氨酸衍生物組(給藥組)，BAYl 1-7082組(陽(yáng)性對(duì)照藥組)，和無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基組(空白對(duì)照組)。供試細(xì)胞分成6組，分別為(I)空白對(duì)照組，(2)模型組:LPS (200ng/mL), (3)京尼平甘氨酸衍生物高劑量組:京尼平甘氨酸衍生物(100yM)+LPS(200ng/mL)，(4)京尼平甘氨酸衍生物中劑量組:京尼平甘氨酸衍生物(50 μ M)+LPS (200ng/mL)，(5)京尼平甘氨酸衍生物低劑量組:京尼平甘氨酸衍生物(25 μ Μ) +LPS (200ng/mL) (6)對(duì)照藥物組:BAY11-7082 (10 μ M) +LPS (200ng/mL)。2)換入無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基藥物干預(yù)2h后，加入濃度為200ng/mL的LPS再刺激30min，然后用冷的PBS(磷酸緩沖液，pH7.4)清洗細(xì)胞3次。蛋白提取按照Mammalian CellLysis說(shuō)明書進(jìn)行。將提取得到的核蛋白用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce)進(jìn)行蛋白定量，最后用無(wú)菌的PBS將蛋白濃度調(diào)整為2mg/mL。5)配置蛋白電泳分離膠即配制濃度為8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳分離，其中，蛋白上樣量為30 μ g ;電泳條件為:層積膠電壓80V，30min ;分離膠電壓100V，60min，電泳完后濕法轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，一抗(P-1 κΒ-α , I κ B- a , IKK- α，IKK- β，β -actin) 4°C過(guò)夜，清洗干凈后二抗室溫孵育lh，二抗清洗干凈后加入顯色底物，X光片曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，凝膠電泳分析結(jié)果如圖2所示。1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.3.1Universal EZ-TFA Transcription Factor Assay 結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(X土s)表示，使用SPSSl1.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。組間比較使用單因素方差分析(One-Way AN0VA)法，以P〈0.05和P〈0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。核因子NF- κ B p50和p65轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示。表I 核因子 NF-K B p50 和 p65 轉(zhuǎn)錄(x土 s，n=6)
權(quán)利要求
1.京尼平氨基酸衍生物的核因子NF-K B抑制劑的用途。
2.京尼平氨基酸衍生物在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療由核因子NF-κB活化引起的病理性病癥的藥物或保健品中的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征是所述病理性病癥為惡性腫瘤，自身免疫性疾病，心腦血管疾病，急性炎癥、慢性炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征是所述的京尼平氨基酸衍生物為京尼平與含有伯胺基的氨基酸的衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征是所述的含有伯胺基的氨基酸選擇丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺氨酸，谷胺酰胺氨酸，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等中的一種或多種。
6.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征是所述藥物由京尼平氨基酸衍生物和藥學(xué)上可接受的載體組成。
7.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征是所述藥物是通過(guò)口服、舌下、經(jīng)皮、肌肉、皮下、皮膚黏膜、尿道、陰道、靜脈途徑給藥。
8.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征是所述藥物以口服制劑、注射劑或局部給藥制劑形式存在。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征是所述口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑或溶液劑；注射劑包括注射液劑型或注射用凍干粉針劑型；局部給藥制劑包括霜?jiǎng)④浉鄤?、噴霧劑、氣霧劑或貼劑。
10.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征是所述京尼平氨基酸衍生物純度超過(guò)90%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種京尼平氨基酸衍生物的NF-κB抑制劑的用途，京尼平氨基酸衍生物作為NF-κB抑制劑控制參與腫瘤轉(zhuǎn)移的各種炎性細(xì)胞因子、主要的組織適合性復(fù)合基因、粘著分子的表達(dá)，通過(guò)阻斷核因子NF-κB活化來(lái)抑制和治療因NF-κB活化引起的病理性病癥，如惡性腫瘤，自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)，心腦血管疾病，急性、慢性炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如抑郁癥，阿爾茨海默病等)，而且京尼平氨基酸衍生物能以與劑量和時(shí)間依賴的方式抑制NF-κB活性。本發(fā)明為NF-κB抑制劑及其NF-κB控制的相關(guān)疾病提供了一種新的藥物來(lái)源。
文檔編號(hào)A61P29/00GK103191106SQ20131007377
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者崔元璐, 王強(qiáng)松, 胡利民, 高秀梅, 田俊生, 王躍飛 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)