專利名稱：具有腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合能力的短肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，此類結(jié)合肽與高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤細(xì)胞具有特異性高親和力，能夠作為腫瘤治療藥物的靶向載體，增加抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性作用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是鐵吸收、儲(chǔ)存和利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Fe3+是核苷酸還原酶的一個(gè)輔因子，其主要功能之一是參與DNA復(fù)制的過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)是不可缺少的。關(guān)于Fe3+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的機(jī)理，目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的機(jī)理是，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶Fe3+結(jié)合到表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞上，通過(guò)胞吞轉(zhuǎn)鐵蛋白-Fe3+-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物進(jìn)入內(nèi)含體，ATP依賴的質(zhì)子泵把H+泵到內(nèi)涵體，PH值降低到5.5，在低PH下，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體改變構(gòu)象釋放攜帶Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白一被釋放就會(huì)立刻到達(dá)細(xì)胞表面，接下來(lái)轉(zhuǎn)鐵蛋白、Fe3+、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物就會(huì)如此循環(huán)運(yùn)輸Fe3+。正常情況下轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合Fe3+只會(huì)達(dá)到30%飽和的程度，通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞并不局限于Fe3+，鉍，硼，釕，锝都會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子量約為90KDa，是II型跨膜糖蛋白，由胞外段、跨膜段與胞內(nèi)段組成。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩類轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，TfRl與TfR2，在很多細(xì)胞包括血紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、單核細(xì)胞以及血腦屏障都發(fā)現(xiàn)有TfRl，而TfR2有兩種轉(zhuǎn)錄形式存在(a -TfR2, β -TfR2)，而a -TfR2顯著表達(dá)在肝細(xì)胞上，β _TfR2在很多細(xì)胞上呈低表達(dá)。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體幾乎在所有的細(xì)胞上都有表達(dá)但表達(dá)量不同。與緩慢增殖的非腫瘤細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)顯著增加，這與腫瘤細(xì)胞快速分裂需攝入大量Fe3+有關(guān)。在很多腫瘤組織上與很多病例上都可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是顯著上調(diào)的，其上調(diào)與腫瘤階段呈正相關(guān)，并且與治療效果也有關(guān)。在前列腺癌細(xì)胞、口腔癌細(xì)胞、和肝癌細(xì)胞上，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)量比非腫瘤細(xì)胞至少要高出100倍，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的分子數(shù)目可以達(dá)到10000個(gè)。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是腫瘤診斷與治療的重要靶點(diǎn)。相關(guān)報(bào)道表明，把植物藥青蒿素、治療性蛋白、寡核苷酸序列及核糖體失活蛋白如蓖麻毒素等共價(jià)連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白上，就能達(dá)到靶向治療作用，同時(shí)最大程度的降低了毒副作用。由Xenova開(kāi)發(fā)的白喉毒素-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物已經(jīng)用于治療腦腫瘤病人。與傳統(tǒng)的耐藥性治療效果相比，在一期與二期均起到的顯著性的抗腫瘤的作用(Weaver，M.J.Neurooncol.65, 3-13 (2003))。噬菌體展示技術(shù)是20世紀(jì)80年代興起的一項(xiàng)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，其可以用來(lái)抗原表位篩選、診斷試劑研究、疫苗研究、藥物靶向研究。由于噬菌體展示技術(shù)可以將其表型與基因型聯(lián)系一起，利用其配體獨(dú)特的親和力，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，庫(kù)容量大，所以將目的蛋白或短肽篩選出來(lái) 再進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成藥物成為極大的可能性(Kazuki N.Sugahara, etal.Science328，1031 (2010))。噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)藥物的快速有效的方法。
本發(fā)明通過(guò)噬菌體隨機(jī)展示7肽庫(kù)對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)行篩選，最終得到了一組具有生物活性的短肽，并驗(yàn)證了此短肽與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有良好的結(jié)合活性，能用于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的檢測(cè)和作為腫瘤治療藥物的靶向載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組新型轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，其能夠與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體專一結(jié)合，并能夠用于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的檢測(cè)和作為腫瘤治療藥物的靶向載體。本發(fā)明通過(guò)噬菌體隨機(jī)展示7肽庫(kù)對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)行篩選，最終得到了一組具有生物活性的短肽，對(duì)與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合的短肽的結(jié)構(gòu)分析，確定了與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異結(jié)合的氨基酸序列模式。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽的篩選與鑒定按照下述步驟進(jìn)行:(I)準(zhǔn)備靶分子溶液，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體用NaHCO3溶液稀釋16 μ g/ml包被酶標(biāo)板，每孔150μ 1，4°C濕盒輕微震蕩孵育過(guò)夜。如果需要穩(wěn)定靶分子溶液，也可使用其他相似強(qiáng)度的離子溶液。(2)挑取單克隆宿主菌大腸桿菌(購(gòu)自New England Biolabs公司)ER2738于IOml含抗性的LB培養(yǎng)基里震蕩培養(yǎng)。(3)傾去包·被液并扣去殘余液，加進(jìn)封閉液，封閉至少I小時(shí)。(4)棄去封閉液，0.1 % TBST洗脫快速洗脫6次，每次要徹底洗脫底部與邊緣的封閉液，均旋轉(zhuǎn)以使板或孔的底部及邊緣均被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液并注意防止干燥。(5)加上TBST稀釋的原始肽庫(kù)，每孔100 μ I加到已經(jīng)包被好的板上上，室溫溫和震動(dòng)60min。(6)潔凈紙傾除未結(jié)合噬菌體，倒置在干凈的試紙上扣去未結(jié)合肽。(7) 0.1 % TBST洗板，每次要換潔凈紙避免交叉污染。(8)非特異性洗脫緩沖液0.2MGlycine-HCL洗脫，輕微震蕩不超過(guò)10_20min，洗脫脫液轉(zhuǎn)入離心管中，并迅速用150 μ I pH9.1 IM Tris-HCL中和上述洗脫液。剩余洗脫物應(yīng)當(dāng)被擴(kuò)增:將洗脫物加入到20ml ER2738培養(yǎng)物中(菌體應(yīng)當(dāng)處于對(duì)數(shù)前期)，37°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4.5hr。(9)取 1μ I 測(cè)滴度。(10)擴(kuò)增剩余洗脫物。擴(kuò)增過(guò)程:將洗脫物加到20ml生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的ER2738宿主菌中。ER2738宿主菌過(guò)夜培養(yǎng)物以1: 100接種LB四環(huán)素中，把剩余洗脫物加進(jìn)去，37°C,220rpm4.5 小時(shí)左右。(11) 12000rpm,4°C, IOmin離心，轉(zhuǎn)移上清到新離心管中重離心。(12)轉(zhuǎn)移上清80%到新離心管中，加1/6體積PEG8000/NaCL，4°C過(guò)夜。(13) 12000rpm, 15mim, 4°C, 15min離心，棄上清，重離心并移去殘余液。(14) ImlTBS重懸沉淀物，轉(zhuǎn)移到微量離心管中14000rpm，5min4°C(15)轉(zhuǎn)移上清到新離心管1/6體積PEG8000/NaCL重懸沉淀，置冰上15_60min。(16) 14000rpm, 10min4°C,棄上清重離心，并移去殘余液。(17)TBS重懸沉淀物，再次離心以除去不溶物，轉(zhuǎn)移上清到新管。
(18)測(cè)上述擴(kuò)增噬菌體滴度。(19)并把此擴(kuò)增的噬菌體用于下一輪的篩選。(20)進(jìn)行第二輪篩選，用第一輪篩選擴(kuò)增的洗脫物重復(fù)上述步驟；并注意延長(zhǎng)洗脫時(shí)間、增大吐溫濃度、減小靶分子濃度等曬算因素。(21)在LB/IPTG/Xgal平板上測(cè)定第二輪淘選所得洗脫物擴(kuò)增后的滴度。(22)第三輪篩選；(23)在LB/IPTG/Xgal平板上測(cè)定第三輪淘選所得洗脫物未擴(kuò)增時(shí)的滴度。第三輪洗脫物不必再擴(kuò)增，滴度測(cè)定時(shí)得到的噬菌斑可做測(cè)序用:只要注意平板培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò)18小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易出現(xiàn)缺失。其余洗脫物4°C貯存。(24)通過(guò)噬菌體ELISA鑒定，挑取OD值比對(duì)照高的單克隆。(25)從平板上挑取分隔良好的單克隆，對(duì)其采用competitive Elisa檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。 (26)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，以化學(xué)方法合成對(duì)TfR親和力最高的噬菌體展示短肽序列。(27)標(biāo)記FITC (異硫氰酸熒光素)，以高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞!fepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞、低表達(dá)TfR的正常肝細(xì)胞L-o2為對(duì)照細(xì)胞，采用免疫熒光顯微(immunofluorescencemicroscopy),激光共聚焦顯微掃描(confocal laser scanning microscope),競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合試驗(yàn)(competitive inhibition binding experiments)等方法檢驗(yàn)此短肽與高表達(dá)TfR的!fepG2親和性。通過(guò)上述篩選過(guò)程，最終篩選獲得具有下列氨基酸序列的多肽:Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO:1)；His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln(SEQ ID NO:2)；His-Ser-Ser-Leu-Gln-Thr-Pro(SEQ ID NO:3)；Met-Val-Pro-Pro-Arg-Leu-Leu(SEQ ID NO:4)。具有上述氨基酸序列的多肽可以專一性與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合。對(duì)本發(fā)明短肽的研究結(jié)果表明，本發(fā)明篩選得到的短肽可以作為腫瘤治療藥物的靶向載體，將其與腫瘤治療藥物結(jié)合，例如與抗腫瘤多肽或蛋白融合，可以介導(dǎo)這些藥物靶向結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，從而提高作用效果，并減少了對(duì)正常的細(xì)胞的殺傷與毒副作用，例如，將上述短肽與麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)融合，可用于治療肝癌和乳腺癌(研究表明，肝癌和乳腺癌細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞(參見(jiàn)，Daniels TR, Delgado T, Rodriguez JA,Helguera G，Penichet ML:The transferrin receptor part I:Biology and targetingwith cytotoxic antibodies for the treatment of cancer.Clin Immunol 2006,121 (2):144-158)。另外，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽作為生物制劑也存在著潛在的應(yīng)用價(jià)值，例如作為配體用作轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的親和純化，F(xiàn)ITC標(biāo)記的此短肽則可以用于探針檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的存在，也可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。根據(jù)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽的氨基酸序列，可能存在多種獲取含此種短肽的方法，例如化學(xué)方法合成(固相合成、液相合成)，或者用基因重組的方法生產(chǎn)得到該短肽。因此，本發(fā)明涉及下述各項(xiàng):1.一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2，3或4。2.第I項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
3.第2項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤。4.第3項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤選自肝癌或乳腺癌。5.一種腫瘤治療藥物，其包括有效量的第I項(xiàng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽作為腫瘤治療藥物的靶向載體。6.第5項(xiàng)所述的腫瘤治療藥物，其中所述腫瘤是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤。7.第6項(xiàng)所述的腫瘤治療藥物，其中所述腫瘤選自肝癌或乳腺癌。8.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的試劑，所述試劑包含有效量的第I項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:圖1A為HPLC檢測(cè)體外有機(jī)合成短肽的純度；圖1B為MS檢測(cè)體外有機(jī)合成短肽的分子量；圖2A為免疫熒光檢測(cè)本發(fā)明的短肽(即，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽)-麻瘋樹(shù)毒蛋白融合蛋白與高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞表面結(jié)合；

圖2B為免疫熒光檢測(cè)本發(fā)明的短肽-麻瘋樹(shù)毒蛋白融合蛋白與正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞表面結(jié)合。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些具體的實(shí)施例僅是舉例說(shuō)明，并不限制本發(fā)明的精神和范圍。需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例中所用的試劑、酶類等除特別說(shuō)明外，均為可從試劑公司商購(gòu)的分析純級(jí)別的試劑或酶類。實(shí)施例1短妝Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser, His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln,Hi s-Ser-Ser-Leu-Gln-Thr-Pro, Met-Val-Pro-Pro-Arg-Leu-Leu 的化學(xué)合成采用CS936多肽合成儀(美國(guó)CSBio公司)，F(xiàn)moc固相合成法合成上述短肽，合成過(guò)程主要包括下述步驟:a.去保護(hù):用哌唳(piperidine,上海紫一試劑廠)溶液去除氨基的保護(hù)基團(tuán)；b.激活與交聯(lián):下一個(gè)氨基酸的羧基被激活劑HBTU(HCTU/HITU)+NMM所激活溶解，激活的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵；c.循環(huán):a、b兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到整條肽鏈合成完畢；d.洗脫和脫保護(hù):根據(jù)肽鏈所含的殘基不同，用不同的脫樹(shù)脂溶劑從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑(TFA)洗脫和脫保護(hù)；e.合成好的短肽經(jīng)過(guò)Varian Prostar210純化柱(美國(guó)VARIAN公司)純化,純化的過(guò)程中米用 UV-Vis-detector:Varian Prostar345 (美國(guó) VARIAN 公司)檢測(cè)；f.采用System Gold HPLC (美國(guó)貝克曼公司)驗(yàn)證純度達(dá)到99%以上；
g.米用 Thermo Finnigan LCQ deca XP plus (美國(guó) Thermo 公司)檢測(cè)合成短妝的分子量。圖1A 和 IB 分別顯示了 Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO:1)短肽的純度與分子量檢測(cè)結(jié)果，與理論值吻合。實(shí)施例2His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln (SEQ ID NO:2)短肽的 His-tag 融合多肽的表達(dá)與純化根據(jù)短肽的氨基酸序列推導(dǎo)其堿基序列，并合成其互補(bǔ)的序列，退火后將其連接到載體PET-22b (Invitrogen公司)上的Nde I/Xho I的酶切位點(diǎn)，將得到的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司)，挑取單克隆并做菌落PCR，測(cè)序(上海英俊生物公司)。再回收將經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定正確的重組子，將其轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21(購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司)，將此表達(dá)菌液以1: 50(v/v)接種到含有100 μ g/ml氨芐青霉素(Sigma公司)的LB培養(yǎng)基中，220rpm，37°C，搖菌4小時(shí)，待其OD值達(dá)到0.6左右，加進(jìn)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，離心去上清收集菌體，冰上超聲破碎此菌體。12000rpm，4°C，離心10分鐘。收集上清，使用N1-NTA親和層析得到該短肽的His-tag融合多肽。實(shí)施例3ELISA檢測(cè)噬菌體展示短肽與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性、專一性結(jié)合用由PBS 稀釋濃度為 2 μ g/ml>4 μ g/ml>8 μ g/ml、16 μ g/ml、32 μ g/ml、64 μ g/ml、128 μ g/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(購(gòu)自美國(guó)R&D公司)包被96孔酶標(biāo)板(Corning公司),每孔150μ1，留有幾個(gè)孔作為不包被轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的空白對(duì)照，4°C緩慢搖床過(guò)夜，傾去包被液，加進(jìn)PBS稀釋的I % BSA封閉液，封閉I小時(shí)。分別加入終滴度為IxiO11Pfu/ml的展示本發(fā)明的短肽的噬菌體100 μ 1，室溫緩慢搖床結(jié)合I小時(shí)。0.1 % PBST洗滌6次，加入HRP-抗Μ13抗體(NEB公司)100μ1(1: 5000稀釋)，37 °C孵育40分鐘，PBST洗滌6次后加入顯示·底物TMB(碧云天公司)50μ I顯色10分鐘，IM H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀 450nm 檢測(cè) OD 值。展不序列為 Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO:1) >His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln(SEQ ID NO:2), His-Ser-Ser-Leu-Gln-Thr-Pro(SEQ IDNO:3)和 Met-Val-Pro-Pro-Arg-Leu-Leu (SEQ ID NO:4)的噬菌體的 OD 值分別為 0.7108、
0.9953,0.8965和0.8324，表明其與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有較高的特異性、專一性結(jié)合能力。實(shí)施例4ELISA檢測(cè)His-tag融合肽與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性、專一性結(jié)合。用由PBS 稀釋濃度為 2 μ g/ml>4 μ g/ml>8 μ g/ml、16 μ g/ml、32 μ g/ml、64 μ g/ml、128 μ g/ml、256 μ g/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(美國(guó)R&D公司)包被96孔酶標(biāo)板(Corning,公司)，每孔150μ 1，同時(shí)設(shè)置不包被轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的空白對(duì)照，4°C緩慢搖床過(guò)夜，傾去包被液，加進(jìn)PBS稀釋的I % BSA封閉液，封閉I小時(shí)。加入PBS稀釋1.0y M His-tag融合肽(SEQ ID NO:2，由實(shí)施例2獲得)，室溫結(jié)合I小時(shí)。0.1 %的PBST洗滌6次后，加入鼠源的抗組氨酸標(biāo)簽的抗體(上海江萊生物科技有限公司)(I: 2000稀釋)，37°C孵育40分鐘，PBST洗滌6次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(上海江萊生物科技有限公司)100 μ 1,37°C孵育40min，PBST洗滌6次后加入顯示底物TMB (碧云天公司)50 μ I顯色10分鐘，IM H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)OD值，OD值為0.9025，表明該肽(SEQ ID NO:2)與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有較高的特異性、專一性結(jié)合能力。
實(shí)施例5噬菌體與短肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合表腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體根據(jù)Zvezdana Popovic (Zvezdana Popovic Douglas M.Templeton, Molecularand Cellular Biochemistry 265:37_45，2004.)，!fepG2 細(xì)胞表面表達(dá)有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，將HepG2細(xì)胞(購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))吹打均勻，每孔接種I X IO6個(gè)細(xì)胞到細(xì)胞培養(yǎng)板里。待貼壁后無(wú)血清處理3小時(shí)，I % BSA封閉I小時(shí)。將系列稀釋的短肽(0.00001mM，0.0OOlmM，
0.001mM,0.0lmM,0.1mM)(即由實(shí)施例1獲得的四種短肽)與！fepG2細(xì)胞在37°C共孵育3小時(shí)。同時(shí)做空白對(duì)照，M13Wild(購(gòu)自New England Biolabs公司)對(duì)照，L_02(正常肝細(xì)胞，購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))對(duì)照。將用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋、終滴度達(dá)到10npfu/ml的噬菌體與上述細(xì)胞共作用2小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液洗滌非特異性噬菌體，再用0.2M pH2.2的甘氨酸鹽酸洗脫特異性噬菌體，最后在LB/Xgal/IPTG平板(在含有LB固體平板上滴加40ul2% X-Gal和7ul20% IPTG，然后涂布均勻)計(jì)數(shù)噬菌體滴度。抑制率=(對(duì)照滴度-實(shí)驗(yàn)滴度)/對(duì)照滴度X 100 %。結(jié)果顯不，短妝Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: I),His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln(SEQ ID NO:2), His-Ser-Ser-Leu-Gln-Thr-Pro(SEQ IDNO:3)，Met-Val-Pro-Pro-Arg-Leu-Leu(SEQ ID NO:4)對(duì)噬菌體的抑制率分別為 65.3%,73.1%>62.5%和68.4%，表明其具有顯著的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用。實(shí)施例6His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln(SEQ ID NO:2)增強(qiáng)麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合能力將HepG2細(xì)胞(購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))吹打均勻，每孔接種I X IO6個(gè)細(xì)胞到共聚焦培養(yǎng)皿里，過(guò)夜生長(zhǎng)貼壁；次日，3.7%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，甲醇孵育lOmin，，山羊血清(購(gòu)自杭州四季青公司)封閉I小時(shí)；用FITC標(biāo)記的本發(fā)明的短肽-麻瘋樹(shù)毒蛋白融合蛋白(該融合蛋白通過(guò)常規(guī)的基因工程方法獲得)與細(xì)胞相互作用
1.5hs,磷酸鹽緩沖液洗漆2遍；DAPI (sigma公司)與細(xì)胞作用30min,磷酸鹽緩沖液洗漆2遍；激光共聚焦儀(德國(guó)蔡斯公司)檢測(cè)短肽-麻瘋樹(shù)毒蛋白融合蛋白與細(xì)胞的定位，并設(shè)置人正常肝細(xì)胞株L02(購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))作為對(duì)照。結(jié)果如圖2A和圖2B所示，短肽-麻瘋樹(shù)毒蛋白融合蛋白結(jié)合于聞表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受:體的HepG2細(xì)胞表面，部分進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，L02正常細(xì)胞表面未觀察到與短肽-麻瘋樹(shù)毒蛋白融合蛋白結(jié)合，此結(jié)果表明，該短肽增強(qiáng)了麻瘋樹(shù)毒蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合能力。實(shí)施例7Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO:1)增強(qiáng)麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的!fepG2細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為6X IO4個(gè)細(xì)胞/ml，10% FBS,5% CO2在96孔培養(yǎng)板中每孔加入IOOul細(xì)胞懸液。37。。，10% FBS, 5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去培養(yǎng)液，加入短肽-融合蛋白，分5個(gè)劑量組，分別為2.5 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml>20 μ g/ml、40 μ g/ml,同時(shí)設(shè)不加融合蛋白的對(duì)照組,孵育48小時(shí)，加入20μ 1MTT， 繼續(xù)孵育4小時(shí)，每孔加入150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其OD值，計(jì)算半數(shù)抑制率IC5(I。同時(shí)做麻瘋樹(shù)毒蛋白單體的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，curcin和該短肽-curcin融合蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞的IC5tl分別為0.137nmol和0.562nmol,該短肽-curcin融合蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞的IC5tl顯著低于curcin。實(shí)施例8His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln(SEQ ID NO:2)增強(qiáng)麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的!fepG2細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為6X IO4個(gè)細(xì)胞/ml，10% FBS,5% CO2在96孔培養(yǎng)板中每孔加入IOOul細(xì)胞懸液。37。。，10% FBS, 5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去培養(yǎng)液，加入短肽-curcin融合蛋白，分5個(gè)劑量組，分別為2.5 μ g/ml>5 μ g/ml、10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml,同時(shí)設(shè)不加融合蛋白的對(duì)照組,孵育48小時(shí)，加入20 μ 1MTT，繼續(xù)孵育4小時(shí)，每孔加入150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其OD值，計(jì)算半數(shù)抑制率IC5(I。同時(shí)做麻瘋樹(shù)毒蛋白的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，curcin和該短肽-curcin融合蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50分別為0.153nmol和0.546nmol，該短肽-curcin融合蛋白對(duì)H印G2細(xì)胞的IC50顯著低于Curcin0。應(yīng)該理解，盡 管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2，3或4。
2.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤選自肝癌或乳腺癌。
5.一種腫瘤治療藥物，其包括有效量的權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽作為腫瘤治療藥物的靶向載體。
6.權(quán)利要求5所述的腫瘤治療藥物，其中所述腫瘤是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤。
7.權(quán)利要求6所述的腫瘤治療藥物，其中所述腫瘤選自肝癌或乳腺癌。
8.—種檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的試劑，所述試劑包含有效量的權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽，其氨基酸序列如下Ala-His-Leu-His-Asn-Arg-Ser、His-Glu-Asn-Gln-Thr-Arg-Gln、His-Ser-Ser-Leu-Gln-Thr-Pro、Met-Val-Pro-Pro-Arg-Leu-Leu。本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽在體內(nèi)和體外均能結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，能用于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的檢測(cè)、作為腫瘤治療藥物的靶向載體等方面，在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103254280SQ20131007327
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者鄭青, 徐單單, 熊耀玲, 黃亞?wèn)|, 蘇志堅(jiān), 許華, 張齊好, 項(xiàng)琪 申請(qǐng)人:廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心, 暨南大學(xué)