專利名稱：Cyr61在銀屑病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Cyr61在銀屑病藥物中的應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀屑病(Psoriasis)是一種發(fā)病率高達(dá)2-3%的由免疫介導(dǎo)的鱗屑性皮損為主要特征的慢性炎癥性皮膚疾病。病理特征為皮膚角質(zhì)細(xì)胞過度增生并角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤而導(dǎo)致的皮膚損傷和瘙癢。銀屑病的臨床特點表現(xiàn)為:皮膚出現(xiàn)不規(guī)則紅斑和丘疹，輕刮皮屑后紅斑處有明顯出血點，上面覆蓋 薄膜；皮膚紅斑和丘疹處皮損表皮過度增生，表現(xiàn)如厚厚牛皮，輕抓表皮呈鱗狀脫屑，嚴(yán)重者如套狀或者鞋襪狀皮屑脫落。本病呈反復(fù)發(fā)作、秋冬季加重、皮膚瘙癢難耐，嚴(yán)重影響患者的生活和工作。其中皰疹型或者紅皮病型，有時也會引起患者全身性癥狀，嚴(yán)重甚至可危及患者生命，因此不僅患者十分痛苦，而且也給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。近年來銀屑病在我國發(fā)病率呈增加趨勢，目前全國至少有300萬患者，是皮膚科的重要疾病。銀屑病發(fā)病機理復(fù)雜，至今不明。目前公認(rèn)此病相關(guān)因素較多，如遺傳、感染、精神因素、內(nèi)分泌因素、代謝障礙、免疫功能紊亂等。其中，免疫異常已經(jīng)得到公認(rèn)是銀屑病的重要因素:采用免疫抑制劑、或者抑制炎癥因子(如TNFa)的生物制劑能快速有效緩解銀屑病的臨床癥狀，證實了免疫和炎癥在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的重要性。典型的銀屑病患者的皮膚病理切片中可見，角質(zhì)細(xì)胞過度增生，向下(即向基底細(xì)胞層)生長而形成“杵狀”突出；向上在表皮部位形成多層重疊的角質(zhì)細(xì)胞，由于角化不全，這些表皮細(xì)胞中含有細(xì)胞核，在角質(zhì)細(xì)胞之間有明顯的、散在的中性粒細(xì)胞浸潤，形成“微膿瘍”。因此，銀屑病的病理中至少有下列兩個因素:炎癥/免疫細(xì)胞；角質(zhì)細(xì)胞過度增生并角化不全。目前在銀屑病皮損部位發(fā)現(xiàn)的炎癥/免疫細(xì)胞有單核巨噬細(xì)胞、郎格漢斯細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、ThU Thl7/Th22細(xì)胞等T細(xì)胞亞群以及中性粒細(xì)胞等。與此相關(guān)的炎癥因子介導(dǎo)了銀屑病皮損的發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)相關(guān)的重要炎癥因子有TNFa、IL-17、IL-22/IL-23等等。其中，TNFa可由多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，如皮膚的單核巨噬細(xì)胞、郎格汗式細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Thl細(xì)胞等都能夠產(chǎn)生，臨床上采用抗TNFa的生物制劑能夠獲得臨床癥狀緩解，表明這是一種主要的炎癥因子。除了炎癥細(xì)胞和炎癥因子外，在銀屑病發(fā)生中起關(guān)鍵作用的另外一種細(xì)胞即是皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)。角質(zhì)形成細(xì)胞位于皮膚的最表面,在正常情況下，表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞通過分化與活化這兩條相互調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)換的方式以維持正常功能和損傷修復(fù)。正常情況下，角質(zhì)形成細(xì)胞來源于皮膚的基地層，經(jīng)過分化發(fā)育為棘層、顆粒層，最后到達(dá)并形成角質(zhì)層。但是在銀屑病時，這樣的分化發(fā)育過程受到干擾，使角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生但是分化不全，從而導(dǎo)致銀屑病皮損病變。現(xiàn)在已知，來源于不同細(xì)胞的角質(zhì)素們調(diào)控著角質(zhì)形成細(xì)胞正常分化發(fā)育，而當(dāng)異常情況下，如接受炎癥因子刺激時，角質(zhì)素表達(dá)異常，從而使正常的表皮形成調(diào)控失常，導(dǎo)致疾病?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，炎癥因子如IL-b，TNFa是維持KC處于活化狀態(tài)的主要細(xì)胞因子，其他如IL-17、IL-22/IL-23等均通過不同途徑參與上述途徑，加重皮損。Cyr61 (Cysteine-rich 61)是一種分子量約42 kDa的分泌型基質(zhì)蛋白，不僅是胚胎發(fā)育、組織損傷修復(fù)中的重要蛋白，還與炎癥環(huán)境下組織細(xì)胞的過度增生有關(guān)，更重要的是Cyr61還能反向促進炎癥部位的Thl7細(xì)胞分化，由此加重炎癥部位的組織損傷{Journal of Immunol, 2012，188:5776-5784)。之前的研究均集中在Cyr61分子在胚胎發(fā)育、組織損傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生中的作用。2009年底申請人率先報道了 Cyr61受到IL-17上調(diào)并介導(dǎo)類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞過度增生(心^ Rheumatism，2009，60:3602 — 3612、飽關(guān)鍵作用，繼之Cyr61能夠通過促進滑膜細(xì)胞分泌IL-6而反向促進Thl7分化增殖，由此導(dǎo)致 RA 病變部位 Thl7 增多、加重炎癥(Journal of Immunol, 2012,188:5776-5784)。這些研究表明Cyr61在類風(fēng)關(guān)這樣的自身免疫病中起到前炎癥因子的作用，因此是潛在的治療靶點。這些研究還表明Cyr61在免疫應(yīng)答與自身免疫病中擔(dān)任著關(guān)鍵的中介作用，它像IL-lb, IL-6、IL-8等重要的前炎癥因子一樣，介導(dǎo)免疫系統(tǒng)與組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間的相互作用，是機體免疫系統(tǒng)和組織細(xì)胞間的重要橋梁，起到加重局部炎癥和組織損傷病理作用。申請人:最新的研究表明Cyr61分子還參與銀屑病的發(fā)生，因此認(rèn)為是潛在的治療靶點。主要參考文獻(xiàn):
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于:提供一種Cyr61新應(yīng)用。為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案:一種Cyr61在制備銀屑病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供Cyr61抑制劑在制備銀屑病藥物中的用途。在上述方案基礎(chǔ)上，所述的Cyr61抑制劑選自Cyr61特異性中和抗體093G9、Cyr61基因干擾RNA、抗Cyr61蛋白。根據(jù)上述技術(shù)方案本發(fā)明運用實時定量PCR方法分析了 Cyr61在銀屑病患者皮損部位中的表達(dá)，首先采用實時定量PCR分析了 10例銀屑病患者皮損和皮損周圍正常皮膚組織中Cyr61的mRNA的表達(dá)水平；采用特異性Cyr61 siRNA序列干擾實驗,所述的Cyr61基因干擾RNA選自siRNA中的一種或其變異體。證實Cyr61分子參與銀屑病的發(fā)生:在銀屑病患者皮損部位的炎癥因子可通過上調(diào)角質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生Cyr61分子而上調(diào)角質(zhì)素(K6)表達(dá)，結(jié)局是促進角質(zhì)細(xì)胞過度增生并分化不全，由此導(dǎo)致銀屑病皮損。用抗Cyr61特異性中和抗體阻斷Cyr61作用后，可以降低K6表達(dá)而緩解銀屑病皮損和病變。因此，Cyr61的確參與銀屑病發(fā)生，也是重要的治療靶點。


圖1中，圖1 A在銀屑病患者皮損部位中Cyr61基因的相對表達(dá)量比正常皮膚高(圖1);圖1 B蛋白印跡實驗證實了基因表達(dá)水平的結(jié)果，實時定量PCR檢測表明皮損部位的Cyr61表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常皮膚；圖1 C采用免疫組化方法對于Cyr61在銀屑病患者皮損組織中的分布，表明皮損部位角質(zhì)細(xì)胞呈“杵狀生長”，向基底細(xì)胞層生長，而Cyr61在這些部位表達(dá)十分明顯；
圖2，為銀屑病小鼠模型中病變皮損Cyr61表達(dá)上調(diào)，其中:
圖2 Al咪喹莫特造模小鼠10天皮膚增厚、有出血點、皮膚鱗屑圖，至16天的圖2 A2皮膚鱗屑更加明顯；
圖2B皮膚病理顯示隨著造模時間延長角質(zhì)細(xì)胞增生明顯，10天的圖2B1到16天的圖2B2 “杵狀生長”顯著；
圖2C在小鼠的鱗屑狀 皮損中Cyr61的相對表達(dá)量，在小鼠的鱗屑狀皮損中Cyr61表達(dá)明顯增加；
圖3在銀屑病小鼠皮損出現(xiàn)明顯時(第七天)時給予抗Cyr61的中和抗體093G9，與對照組Con-1gGl比較，其中:
圖3A，銀屑病小鼠皮損明顯減輕、出血點消失、皮膚鱗屑減少；
圖3B，皮損部厚度，皮膚厚度明顯降低；
圖3C，093G9治療小鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞增生明顯降低，“杵狀生長”不顯著；
圖3D，Cyr61的相對表達(dá)量，明顯降低；
圖4，角質(zhì)素(Keratin，或K)在銀屑病皮損和正常皮膚中相對表達(dá)量，其中:
圖4A，銀屑病患者皮損中K6的mRNA相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常皮膚，K6的mRNA的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常皮膚；
圖4B，蛋白印跡實驗中，銀屑病患者皮損的K6的mRNA相對表達(dá)量也證實相同；
圖5，炎癥因子/Cyr61/K6表達(dá)格局與相關(guān)性，其中，
圖5A，炎癥因子TNFa、IL-17, IL-21/IL-22/IL-23上調(diào)角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Cyr61 ;5B，炎癥因子TNFa、IL-17、IL-21/IL-22/IL-23上調(diào)人角質(zhì)細(xì)胞株HaCat細(xì)胞相對表達(dá)K6 ；
圖5C，采用Cyr61特異性siRNA將HaCat細(xì)胞中Cyr61敲除，再用上述炎癥因子刺激，K6相對表達(dá)量明顯降低；
圖5D，蛋白印跡實驗中，除Cyr61后炎癥因子促進K6蛋白A表達(dá)降低；
圖6，為Cyr61介導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)K6，其中:· 圖6A，外源性Cyr61在一定濃度范圍內(nèi)上調(diào)K6相對表達(dá)量；
圖6B，Cyr61促進K6表達(dá)在48小時時最為明顯；
圖6C,敲除Cyr61后,角質(zhì)細(xì)胞中K6表達(dá)下調(diào),而補充外源性Cyr61后K6表達(dá)恢復(fù)。
具體實施例方式實驗材料與方法:
O銀屑病患者皮損樣本:
選擇皮膚科門診患者、臨床表現(xiàn)典型的銀屑病患者(10例)，常規(guī)方法取皮損部位和皮損邊緣正常皮膚樣本置于生理鹽水中，樣本當(dāng)天處理。抽提RNA、蛋白質(zhì)或者制備病理切片(方法見下)備用。2)銀屑病小鼠模型建立:
采用國際通用的銀屑病小鼠模型:給8周齡的Balb/c小鼠，以5%咪喹莫特(Imiquimod,終用量為每只小鼠3.125 mg)涂抹背部，每日2次，連續(xù)7天。小鼠背部出現(xiàn)銀屑病樣改變:皮膚增厚變硬，表現(xiàn)如厚厚牛皮，出現(xiàn)不規(guī)則紅斑和丘疹，上面覆蓋薄膜樣鱗屑。病理切片檢查也與人類銀屑病相似:角質(zhì)細(xì)胞過度增生，向基底細(xì)胞層生長而形成“杵狀”突出；向上在表皮部位形成多層重疊的角質(zhì)細(xì)胞。皮膚表皮細(xì)胞中含有細(xì)胞核，即為角化不全。3)銀屑病小鼠用特異性抗Cyr61抗體治療:
在上述造模小鼠的第7天,皮損出現(xiàn)明顯時給予小鼠抗Cyr61特異性中和抗體093G9進行治療:方法:無菌注射用水溶解，給小鼠腹腔注射，每周2次，每次用量為200ug。治療至20天時結(jié)束。對照小鼠給予相同劑量的抗小鼠IgGl抗體。所有處理與觀察相同。4) RNA抽提與實時定量PCR:
抽提細(xì)胞總RNA:采用Tritzol (Invitrogen)方法。簡述之:將Iml Trizol加入組織或者細(xì)胞中，多次吹打使充分裂解，然后加入200 μ I氯仿,渦旋振蕩15 sec，室溫靜置10分鐘；12000rpm，4°C離心15min后小心吸取上清(水相)約200 — 300 μ I置于另一個EP管中，再加入等體積的異丙醇(4°C預(yù)冷)，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；12000rpm，4°C離心IOmin后棄上清，加入I ml 75%乙醇洗滌I次；空氣干燥后加10 — 20 μ I DEPC處理的水，260nm測濃度待用。5)實時定量PCR檢測Cyr61基因表達(dá)格局:
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Sensiscript RT Kit, QIAGEN)合成各樣本的cDNA。常規(guī)方法擴增基因片段。擴增引物見表1:
表1.實時定量PCR分析所用特異性擴增引物(已知的)
權(quán)利要求
1.一種Cyr61在制備銀屑病藥物中的應(yīng)用。
2.Cyr61抑制劑在制備銀屑病藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的Cyr61抑制劑選自Cyr61特異性中和抗體093G9、Cyr61基因干擾RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的Cyr61基因干擾RNA選自siRNA中的一種或其變異體，正義鏈SEQ ID NO. 5，反義鏈SEQ ID NO. 6。
全文摘要
本發(fā)明涉及Cyr61在銀屑病藥物中的應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及Cyr61抑制劑在制備銀屑病藥物中的用途。本發(fā)明運用實時定量PCR方法分析了Cyr61在銀屑病患者皮損部位中的表達(dá)，并采用特異性Cyr61siRNA序列干擾實驗。證實Cyr61分子參與銀屑病的發(fā)生在銀屑病患者皮損部位的炎癥因子可通過上調(diào)角質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生Cyr61分子而上調(diào)角質(zhì)素(K6)表達(dá)，結(jié)局是促進角質(zhì)細(xì)胞過度增生并分化不全，由此導(dǎo)致銀屑病皮損。用抗Cyr61特異性中和抗體阻斷Cyr61作用后，可以降低K6表達(dá)而緩解銀屑病皮損和病變。因此，Cyr61的確參與銀屑病發(fā)生，也是重要的治療靶點。
文檔編號A61P17/06GK103251931SQ201310072830
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者陳向東, 李寧麗, 沈佰華, 火蓉芬, 汪蓓青, 吳品茹, 沈征宇, 徐慧 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院