蛋白sFRP-5在治療銀屑病的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分泌型卷曲相關(guān)蛋白-5在制備免疫調(diào)節(jié)功能藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療銀屑病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]銀屑病(psoriasis)是一種常見的免疫相關(guān)性、復(fù)發(fā)性的皮膚慢性炎癥，其特征是真皮內(nèi)濃密的以T細(xì)胞、DC、自然殺傷T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤。銀屑病患者皮膚的表皮過度增生且無法正常分化，使其表皮顯著增厚、結(jié)痂增多[I]。銀屑病的確切發(fā)病原因還不明確，環(huán)境因子(諸如感染、外傷、壓力等)和遺傳因子等綜合因素決定了個(gè)體的易感性。銀屑病目前尚無根治的藥物[2]，早期治療多使用類固醇等非生物性的免疫抑制劑，此類非專一性免疫抑制劑具有相當(dāng)程度的副作用。近年來，生物制劑如腫瘤壞死因子制劑Etaner^pt (依那西普)等也被用于銀屑病治療，此類藥物多為人源化抗體，用于阻隔銀屑病相關(guān)炎癥細(xì)胞因子與受體間的作用。由于許多炎癥細(xì)胞因子在機(jī)體正常免疫反應(yīng)中不可缺少，沒有選擇性地阻擋炎癥細(xì)胞因子亦會(huì)導(dǎo)致用藥后的副作用，停藥后疾病容易反彈。我國從1984年以來約有超過400萬患者被診斷為銀屑病，自主研究開發(fā)我國有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療銀屑病的新藥物勢(shì)在必行。
[0003]Wnt信號(hào)通路廣泛存在于多種細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)，具有高度保守的特點(diǎn)，其功能最常見于胚胎發(fā)育和癌癥，但也參與成年動(dòng)物的正常生理過程。fct信號(hào)通路的失調(diào)可能會(huì)引起細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞極性、組織模式和細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程的異常，并且與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病密切相關(guān)[3，4]。Wnt信號(hào)通路的激活依靠wnt蛋白與靶細(xì)胞表面卷曲受體家族結(jié)合，有時(shí)也同時(shí)結(jié)合其它輔助受體，從而開啟下游一系列不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。目前被廣泛接受的wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有三類，即經(jīng)典的Wnt/beta-catenin通路、ffnt/Ca2+通路和細(xì)胞極性通路。生理?xiàng)l件下生物體自身有多種方式調(diào)控fct通路，防止其過度激活。比如通過分泌抑制劑干擾wnt蛋白和細(xì)胞表面受體的相互作用，繼而阻止信號(hào)的產(chǎn)生。這類抑制劑中比較常見的有三類:分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled related protein,SFRP)、Dickkopf 蛋白(DKK)和 wnt 抑制因子(wnt inhibitory factor, WIF)。其中，SFRP是最早被確認(rèn)的一類rat抑制劑。這類蛋白含有大約300個(gè)氨基酸，并具有一個(gè)類似受體Frizzled蛋白的半胱氨酸富集區(qū)(cysteine rich domain, CRD),這種結(jié)構(gòu)上的相似性可能是SFRP能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合wnt的原因。目前為止共發(fā)現(xiàn)5個(gè)哺乳動(dòng)物的SFRP分子，它們?cè)诙喾N胚胎和成體組織中表達(dá)，表明在多種不同的組織和細(xì)胞中SFRP家族廣泛地發(fā)揮著抑制wnt通路被過度激活的作用。
[0004]然而銀屑病患者的病變皮膚樣本的全基因組芯片數(shù)據(jù)顯示，和患者非皮損部位皮膚相比，sfrp和dkk表達(dá)降低，倍數(shù)差異分別是0.38和0.43倍[5]。我們?nèi)∵溧卣T導(dǎo)的小鼠類銀屑病模型的病變皮膚，通過提取皮膚中的RNA進(jìn)行real time PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)sfrp家族表達(dá)量都有降低趨勢(shì),其中sfrp-5的含量更是顯著降低(P = 0.0173)。這說明銀屑病的發(fā)生和發(fā)展可能伴隨著以wnt抑制信號(hào)表達(dá)降低為代表的wnt通路的激活。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠類銀屑病造模過程中通過皮內(nèi)注射的方式連續(xù)給與重組SFRP-5蛋白，7天造模期結(jié)束后，和注射PBS的對(duì)照組相比，表皮的厚度和真皮中淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量都有顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SFRP-5對(duì)小鼠類銀屑病有一定治療/預(yù)防作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蛋白質(zhì)類大分子化合物SFRP-5在制備抑制細(xì)胞增殖功能藥物、制備具有免疫調(diào)節(jié)功能及制備治療銀屑病的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]該蛋白質(zhì)分子SFRP-5的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I) PCR法擴(kuò)增小鼠sfrp-5基因；
[0009]2)構(gòu)建 pcDNA3.1-HA-SFRP5 的表達(dá)載體；
[0010]3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞系中進(jìn)行重組蛋白表達(dá)；
[0011 ] 4)通過蛋白質(zhì)A/D微球純化法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；
[0012]5)通過熒光素酶檢測(cè)反應(yīng)測(cè)量它在HEK293T中能夠抑制β -catenin的活化比例來確定其活性；
[0013]該蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP5—級(jí)結(jié)構(gòu)如下:
[0014]mwvawsarta alalllgalh gaptrgqeyd yygwqaeplh grsyskppqc ldipadlplchtvgykrmrl pnllehesla evkqqasswl pilakrchsd tqvficslfa pvcldrpiyp crslceavragcaplmeayg fpwpemlhch kfpldndlci avqfghlpat appvtkicaq cemehsadgl meqmcssdfvvkmrikeiki dngdrkliga qkkkkllkag plkrkdtkkl vlhmkngasc pcpqldnltg sfivmgrkvegqlIltavyr wdkknkemkf avkfmfsypc slyypffyga aeph
[0015]蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5在制備抑制細(xì)胞增殖功能藥物中的應(yīng)用。
[0016]蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5在制備具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥物中的應(yīng)用。
[0017]蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5在制備治療銀屑病的藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明公開的蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5對(duì)小鼠類銀屑病發(fā)生、發(fā)展的抑制作用是由本發(fā)明首次報(bào)道。
【附圖說明】
[0019]圖1.類銀屑病小鼠模型的建立:咪喹莫特誘導(dǎo)前后；
[0020]圖2.類銀屑病小鼠模型的建立:病理切片誘導(dǎo)前后；
[0021]圖3.sfrp家族在正常小鼠皮膚和類銀屑病小鼠皮膚中的表達(dá)；
[0022]圖4.sfrp4和sfrp5在健康人和銀屑病患者皮膚中的表達(dá)；
[0023]圖5.SFRP-5在正常小鼠皮膚和類銀屑病小鼠皮膚中蛋白水平的表達(dá)；
[0024]圖6.皮內(nèi)注射蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5 (I μ g/ml)
[0025]A.小鼠皮內(nèi)注射蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5 (I μ g/ml)和對(duì)照PBS的同時(shí)使用咪喹莫特誘導(dǎo)H&E病理結(jié)果；
[0026]B.表皮面積和真皮淋巴細(xì)胞的浸潤；
[0027]圖7.皮內(nèi)注射不同濃度蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5
[0028]A.小鼠皮內(nèi)注射0.5 μ g/ml、l μ g/ml和15 μ g/ml蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5和對(duì)照PBS的同時(shí)使用咪喹莫特誘導(dǎo)后表皮面積比較；
[0029]B.小鼠皮內(nèi)注射0.5 μ g/ml、l μ g/ml和15 μ g/ml蛋白質(zhì)大分子化合物SFRP-5和對(duì)照PBS的同時(shí)使用咪喹莫特誘導(dǎo)后真皮淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)目比較。
【具體實(shí)施方式】
[0030]1.類銀屑病小鼠模型的建立及鑒定:
[0031]將小鼠麻醉后背部剃毛，面積1.5cm*2