專利名稱：c-Met抗體的組合物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含特異性結(jié)合蛋白質(zhì)靶標c-Met的抗體的組合物，制備這些抗體的方法，以及治療增生性病癥(例如癌癥和轉(zhuǎn)移)以及炎癥的使用方法。
背景
肝細胞生長因子受體，本文稱作c-Met，是一種受體酪氨酸激酶，其已經(jīng)被證明在多種惡性腫瘤中過表達和/或突變，特別地，在多種實體期腫瘤中發(fā)現(xiàn)許多c-Met突變。c-Met配體，肝細胞生長因子(HGF)，也稱作分散因子(SF)，以涉及腫瘤細胞入侵和轉(zhuǎn)移的途徑結(jié)合 c-Met (Ma 等，2003, Cancer and Metastasis Reviews., 22:309_325)。
HGF與c-Met的相互作用起始一連串細胞內(nèi)事件(Derman等，1996, J BiolChem23 ;271(8):4251_4255)。HGF的結(jié)合導(dǎo)致c-Met內(nèi)在酪氨酸激酶活性的激活和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上若干酪氨酸殘基的自體憐酸化(Ma等,2003, Cancer and Metastasis Reviews.,22:309-325)。HGF/c-Met途徑的激活導(dǎo)致廣泛的細胞應(yīng)答，包括細胞分散、血管發(fā)生、增殖、細胞運動性提高、侵入和轉(zhuǎn)移。拮抗作用可以起抑制自體磷酸化和/或誘導(dǎo)表面c-Met的內(nèi)在化和/或下調(diào)c-Met活性的作用。
腫瘤細胞可以侵入組織邊界，降解和重構(gòu)周圍的細胞外基質(zhì)，從而使得腫瘤細胞可以通過細胞外基質(zhì)組織邊界遷移，允許傳播和形成轉(zhuǎn)移。HGF/c-Met信號是介導(dǎo)正常和惡性侵入生長的途徑。已經(jīng)在多種癌癥中鑒定出c-Met的錯義突變，大多數(shù)突變位于激酶結(jié)構(gòu)域中。突變體的特征是酪氨酸激酶活性提高，由此促進c-Met的生物學(xué)作用。
需要治療癌癥，癌癥轉(zhuǎn)移和炎癥的組合物和方法，例如干擾HGF/c-Met fg號途徑的藥劑，在所述信號途徑中c-Met活性有助于侵入和/或轉(zhuǎn)移。
發(fā)明概沭
受體酪氨酸激酶C-Met涉及遷移、侵入和形態(tài)發(fā)生的過程，其伴隨著胚胎發(fā)生和組織再生。若干條證據(jù)已經(jīng)表明c-Met還在腫瘤發(fā)病中發(fā)揮作用。c-Met激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)種系突變的激活與遺傳性乳突狀腎細胞癌(PRCC)的發(fā)病相關(guān)聯(lián)。雖然數(shù)量很少，但是在個別形式的PRCC中，頭頸鱗狀細胞癌中和在胃癌中也已經(jīng)報道了激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變。在多種臨床相關(guān)腫瘤中以 高頻率觀察到c-Met與其獨特配體HGF/SF —起被提高的水平。表達增加與疾病進程、轉(zhuǎn)移和患者死亡率之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)在若干種癌癥中報道，包括膀胱、乳腺和胃癌、平滑肌肉瘤和成膠質(zhì)細胞瘤。
本發(fā)明抗體以高親和性特異性結(jié)合C-Met并調(diào)節(jié)疾病的C-Met作用。期望將拮抗c-Met水平或活性的抗體用于治療增生性疾病或炎性疾病。據(jù)認為可以通過本發(fā)明抗體治療的增生性疾病尤其包括癌癥。期望將激活c-Met水平或活性的抗體用于器官再生、傷口愈合、組織再生等等。
本發(fā)明的實施方案提供選擇性結(jié)合C-Met蛋白的抗體，或這種抗體的免疫活性部分或功能性抗體片段。在一個實施方案中所述抗體或這種抗體的免疫活性部分來自哺乳動物，其具有例如嚙齒動物，人或駱駝科(camelid)動物的來源，或者是人源化抗體。在特定實施方案中，抗c-Met抗體的特征是具有對于靶蛋白c-Met特異性的抗原結(jié)合區(qū)，以及結(jié)合c-Met或其片段的抗體或其部分。所述抗體可以是多克隆或單克隆抗體。在某些實施方案中，所述抗體或這種抗體的免疫活性部分是單克隆抗體。本發(fā)明的其它實施方案包括例如功能性片段(例如抗原結(jié)合部分)，或在非傳統(tǒng)或非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)或框架基礎(chǔ)上提供的這種片段。
在另一個實施方案中，所述抗體或這種抗體的功能性片段以2.0X10_5M或更小，2.0 X KT6M或更小，2.0 X KT7M或更小，2.0 X KT8M或更小，或2.0X 10_9M或更小的Kd結(jié)合革巴蛋白c-Met。在相關(guān)實施方案中，所述抗體或這種抗體的功能性片段對于靶蛋白c-Met具有1.0X 1(Γ2每秒或較小，1.0XlO-3每秒或較小，IX 1(Γ4每秒或較小，或1.0X 1(Γ5每秒或較小的解離速率(off rate) (Koff)。在相關(guān)實施方案中,所述抗體或這種抗體的功能性片段以2.0 X 1(Γ5Μ 或更小，2.0 X 1(Γ6Μ 或更小，2.0 X 1(Γ7Μ 或更小，2.0 X 1(Γ8Μ 或更小，或 2.0XKT9M或更小的Kd結(jié)合祀蛋白c-Met,并抑制HGF結(jié)合c_Met。在相關(guān)實施方案中,所述抗體或其功能性片段拮抗c-Met活性。
在某些實施方案中，所述抗體或這種抗體的功能性片段結(jié)合靶蛋白C-Met并調(diào)節(jié)，即激活(激動)或抑制(拮抗)c-Met活性，該活性包括但不限于磷酸化，特別是自體磷酸化。在某些實施方案中，c-Met磷酸化的激動或激活刺激器官再生、傷口愈合和組織再生活性中的至少一種。在相關(guān)實施方案中，所述器官是腎、肝、胰、肺、胃、腸、皮膚、胸腺或甲狀腺。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體拮抗c-Met，其中拮抗作用導(dǎo)致選自下列的至少一種活性:細胞增殖的抑制，細胞遷移的抑制，細胞存活的抑制，轉(zhuǎn)移的抑制和/或HGS結(jié)合的抑制或c-Met內(nèi)在化作用的誘導(dǎo)。在大多數(shù)實施方案中，可以將本發(fā)明c-Met抗體拮抗劑用于治療增生性疾病，特別是癌癥或炎性疾病。
在相關(guān)實施方案中，通過一種或多種測定法來測定所述結(jié)合，所述測定法可以用來測量抗體拮抗性或激動性的活性。所述測定法測量抗體對c-Met配體的至少一種作用，其至少包括:c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑酶活性的誘導(dǎo)；c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達的誘導(dǎo)；基于電化學(xué)發(fā)光的直接結(jié)合c-Met ;結(jié)合c-Met的酶聯(lián)免疫吸附測定；以及細胞的增殖、存活、遷移或轉(zhuǎn)移。通過與缺少HGF天然配體的對照相比較來測定抗體是否具有拮抗或激動作用。因而拮抗性抗體即使在HGF存在的情況下也阻抑c-Met誘導(dǎo)，而激動性抗體則在HGF缺失的情況下弓I發(fā)誘導(dǎo)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的氨基酸和提供抗體的核苷酸序列以及選自SEQ ID N0:l-30、73-76和85-88的編碼性分離核苷酸序列。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分別由這些核苷酸序列編碼的分離氨基酸序列，以及這些氨基酸序列的保守變體。在另一個相關(guān)實施方案中，SEQ ID NO:1-20中每一個分離的核苷酸序列都編碼抗原結(jié)合輕鏈的氨基酸序列。在又一個相關(guān)實施方案中，SEQ I D NO:21-30中每一個分離的核苷酸序列都編碼抗原結(jié)合重鏈的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供選自SEQ ID NO:31-72、77-84和89-96的分離氨基酸序列，以及這些序列的保守變體。在相關(guān)實施方案中，SEQ ID NO:31-54中每一個分離的氨基酸序列都包括抗原結(jié)合輕鏈。在另一個相關(guān)實施方案中，SEQ ID NO:55-72中每一個分離的氨基酸序列都包括抗原結(jié)合重鏈。
在某一實施方案中，本發(fā)明提供與SEQ ID NO:31-72、77-84和89-96具有至少50，60，70，80，90，95或99%的同一性的分離氨基酸序列。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供與SEQID NO: 1-30，73-76和89-96中所述序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的分離核苷酸序列。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供這些抗體中任一個分離的抗原結(jié)合區(qū)或這些抗體中任一個功能性片段。因而在某些實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQ ID NO:1-20的核苷酸序列編碼的輕鏈。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列編碼的重鏈。在另一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQ ID NO:1-20的核苷酸序列編碼的輕鏈和由選自SEQ ID NO:21-34的核苷酸序列編碼的重鏈。
在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有選自SEQID NO:31-54的氨基酸序列的輕鏈。在另一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的重鏈。在又一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:31-54的氨基酸序列以及這些序列保守變體的輕鏈，和選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列以及這些序列保守變體的重鏈。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由SEQID NO:73的核苷酸序列編碼的IgX輕鏈。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQ ID NO:74-76的核苷酸序列編碼的IgK輕鏈。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列的IgX輕鏈。在另一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列的IgK輕鏈。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的人或人源化抗體或該抗體的功能性片段，所述抗體具有對于c-Met蛋白中發(fā)現(xiàn)的表位有特異性的抗原結(jié)合區(qū)，從而使得該抗體或功能性片段結(jié)合細胞上c-Met表面受體，并預(yù)防或改善癌癥的發(fā)展或轉(zhuǎn)移。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或功能性片段，其具有對靶蛋白c-Met的表位有特異性的抗原結(jié)合區(qū)，所述表位包含c-Met細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的一個或多個氨基酸殘基。在相關(guān)實施方案中，所述表位是構(gòu)象表位。
在又一個實施方案中，如上所述的分離抗體或功能性片段是Fab或scFv抗體片段，或是駱§它科納米抗體(nanobody)。在某些實施方案中所述Fab或scFv是單價的?？贵w的單價性質(zhì)特別適合用于設(shè)計拮抗c-Met蛋白的試劑。在某一實施方案中,任一種IgG抗體是IgG。在相關(guān)實施方案中，以上抗體中的任一種是IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。在特定實施方案中，所述IgG是IgG4。在更加具體的實施方案中，所述IgG4由選自SEQ ID NO:85-88的核苷酸序列編碼。在又一個相關(guān)實施方案中，所述IgG4由與選自SEQ ID NO:85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的核苷酸序列編碼。在另一個相關(guān)實施方案中，所述IgG4具有選自SEQ ID NO:89-96的氨 基酸序列以及這些序列的保守變體。或者，本文的抗c-Met抗體是IgA, IgD, IgE或IgM。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含以上抗體或功能性片段或這些抗體保守變體中的至少一種，以及其可藥用載體或賦形劑。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因細胞，其攜帶編碼以上抗體或其功能性片段中的任一種的基因。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供治療C-Met相關(guān)病癥或狀況的方法，其包括向需要其的受試者施用有效量的以上藥物組合物中的任一種。所述病癥或狀況是癌癥或炎癥。
在一個實施方案中，所述癌癥是食道癌，乳腺癌，腎癌包括但不限于乳突狀腎細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸癌、上皮癌、肺癌、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦癌、胰腺癌，胃癌、胃腸癌、胃癌、結(jié)腸癌、腸癌、肝癌、生殖器癌癥、泌尿器癌癥、黑素瘤或前列腺癌，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它腫瘤。在特定實施方案中，所述癌癥是肝癌或食道癌，或是肉瘤。更加具體地，所述癌癥選自腦癌、胃癌、生殖器癌癥、泌尿器癌癥、前列腺癌、膀胱癌(淺表和肌肉侵入型)、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(包括成膠質(zhì)細胞瘤、間變型星形細胞瘤、少突星形細胞瘤(oligoastrocytoma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤)、食道癌、胃癌、胃腸癌、肝癌、肝細胞癌(HCC)包括小兒HCC、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌、鼻咽癌)、胡爾特爾細胞癌、上皮癌、皮膚癌、黑素瘤包括惡性黑素瘤，間皮瘤，淋巴瘤，骨髓瘤包括多發(fā)性骨髓瘤、白血病、肺癌包括非小細胞肺癌(包括所有組織學(xué)亞型:腺癌、鱗狀細胞癌、支氣管肺泡癌、大細胞癌和腺鱗癌混合型)、小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌包括遺傳性和偶發(fā)性乳突狀腎細胞癌、I型和II型，以及透明細胞腎細胞癌；肉瘤，特別是骨肉瘤、透明細胞肉瘤和軟組織肉瘤(包括肺泡狀和胚胎性橫紋肌肉瘤，肺泡狀柔軟部分肉瘤)；甲狀腺癌(乳突狀和其它亞型)。
在給定實施方案中，一種例示性炎癥是由于感染造成的。在一個實施方案中，治療方法將是阻抑病原體感染。在特定實施方案中，感染是細菌感染，包括例如李斯特菌屬(Listeria)細菌的感染。參見例如Shen等，Cell，103:501_10，(2000)。并不意味著局限于作用機制，據(jù)認為細菌利用c-Met結(jié)合蛋白將其自身內(nèi)在化。本發(fā)明抗體將會阻抑這種相互作用，由此阻止內(nèi)在化作用。在另一個實施方案中，所述治療刺激細胞應(yīng)答，例如傷口愈合應(yīng)答。
在某些實施方案中，以上方法的任一種都包括進一步施用化療劑。在相關(guān)實施方案中，化療劑是抗癌劑。 在整篇申請中提供了具體的組合。
在相關(guān)實施方案中，以上方法的任一種都包括進一步施用途徑特異性抑制劑。所述途徑特異性抑制劑可以是化療劑或者可以是生物制劑，例如抗體。途徑特異性抑制劑包括但不限于EGFR、VEGFR等的抑制劑。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供處理有害細胞的方法，其包括將所述細胞與以上抗體或這些抗體的功能性片段中的任一種相接觸。在相關(guān)實施方案中，所述細胞在細胞表面上具有c-Met。在另一個相關(guān)實施方案中，以上方法進一步包括用化療劑或放射處理細胞。
在涉及若干種上述方法的實施方案中，在對受試者給藥或接觸細胞后，這些方法可以進一步包括觀察癌癥進行或轉(zhuǎn)移的改善或延遲。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供鑒定具有C-Met表面受體的細胞的方法，該方法包括將細胞與以上抗體或功能性 片段中的任一種相接觸，從而使得所述抗體或功能性片段具有可檢測的標記。例如，所述標記是放射性的、熒光的、磁性的、順磁性的或化學(xué)發(fā)光的標記。相關(guān)實施方案中，以上方法進一步包括成像或分離細胞的步驟。例如分離細胞是從更大群細胞中分離出具有c-Met的細胞。
在另一個實施方案中，以上人或人源化抗體或抗體片段是合成的抗體，例如通過固相氨基酸合成儀生產(chǎn)的多肽。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括以上抗體或這些抗體的功能性片段中的任一種和其它治療劑。所述其它治療劑選自抗癌劑；抗生素；消炎劑；生長因子和細胞因子。
本發(fā)明還涉及用藥劑的組合來預(yù)防或治療哺乳動物，特別是人的增生性疾病或疾病(如癌癥)的方法，所述藥劑的組合包括:
(a)本發(fā)明的C-Met拮抗劑；和
(b)—種或多種藥學(xué)活性劑；
其中至少一種藥學(xué)活性劑是抗癌治療劑。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含:
(a) c-Met抗體拮抗劑；
(b)藥學(xué)活性劑；和
(C)可藥用載體；
其中至少一種藥學(xué)活性劑是抗癌治療劑。
本發(fā)明還涉及商用包裝件或產(chǎn)品，其包含:
(a) c-Met抗體拮抗劑的藥物制劑；和
(b)同時、共同、單獨或連續(xù)使用的藥學(xué)活性劑的藥物制劑；
其中至少一種藥學(xué)活性劑是抗癌治療劑。
在某一實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體，其具有第一氨基酸序列，其是重鏈例如 SEQ ID NO:55-72 或與選自 SEQ ID NO:55-72 的序列具有至少 60，70，80，90，95 或 99%序列同一性的序列；和第二氨基酸序列，其是輕鏈例如SEQ ID NO:31-54，或與選自SEQ IDNO:31-54的序列具有至少60，70，80，90，95或99%序列同一性的序列。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供免疫綴合物，其具有為上述抗體或片段的第一組分，和為第二種氨基酸序列的第二組分。例如，所述免疫綴合物的第二種化合物是細胞毒素，或是對于不同于c-Met的靶標具有結(jié)合特異性的結(jié)合蛋白或抗體。例如，結(jié)合特異性不同于c-Met的靶標是腫瘤抗原或癌細胞表面上的腫瘤相關(guān)蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明提供任何以上抗體為雙特異性的抗體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供具有任何以上抗體或抗體片段的試劑盒。在一些實施方案中，該試劑盒還包含其可藥用載體或賦形劑。在其它相關(guān)實施方案中，試劑盒中的任何以上抗體都以單位劑量形式存在。在又一個相關(guān)實施方案中，該試劑盒包括用于向受試者施用任何以上抗體，或這些抗體的功能性片段，或針對研究用途或篩選的說明書。
預(yù)計拮抗C-Met活性的治療劑對于廣泛的臨床相關(guān)腫瘤的治療將具有有益效果。本發(fā)明中包括完全人抗體，其直接結(jié)合c-Met的細胞外結(jié)構(gòu)域并阻抑與HGF/SF的相互作用。
附圖簡沭


圖1是本發(fā)明Vh鏈的序列比對，進一步限定了每條鏈的FRl，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3 和 FR4 區(qū)。
圖2是本發(fā)明鏈的序列比對，進一步限定了每條鏈的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3, CDR3 和 FR4 區(qū)。
圖3是本發(fā)明VlK鏈的序列比對，進一步限定了每條鏈的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3, CDR3 和 FR4 區(qū)。
發(fā)明詳沭
本發(fā)明涉及分離的抗體，特別是具有人或人源化氨基酸序列的抗體，其特異性結(jié)合c-Met，特異性結(jié)合c-Met蛋白的細胞外部分并且其抑制c_Met的功能特性。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體源自特定重和輕鏈序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征，例如包含特定氨基酸序列的⑶R區(qū)。本發(fā)明提供分離的抗體，制備這些抗體的方法，檢測這些抗體的測定法，包含這些抗體的免疫綴合物和雙特 異性分子，以及包含本發(fā)明的抗體、免疫綴合物或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及利用所述抗體抑制，即拮抗c-Met功能的方法，以便抑制與細胞受體靶標c-Met的存在相關(guān)聯(lián)的疾病或狀況的發(fā)展，從而治療增生性疾病，例如癌癥或炎癥。在不同的實施方案中本發(fā)明還涉及激活，即激動c-Met磷酸化作用的抗體，和使用激動性抗體的方法，所述抗體刺激例如器官再生、傷口愈合或組織再生。
在給定的實施方案中，炎癥是感染。在一個實施方案中，治療方法將會是阻抑病原體感染。在特定實施方案中，所述感染是細菌感染，包括例如李斯特菌屬細菌的感染。
為了使得本發(fā)明可以被更加容易地理解，將某些術(shù)語定義為具有本文的意義，除非上下文另外說明。其它定義在整個詳述中給出。
“c-Met多肽”或“c_Met受體”或指結(jié)合肝細胞生長因子的受體酪氨酸激酶。具體的實例包括例如由GenBank登錄號NM_000245中提供的核苷酸序列編碼的人多肽，或由GenBank登錄號NP_000236中提供的多肽序列編碼的人蛋白質(zhì)或其細胞外結(jié)構(gòu)域。原始的單鏈前體蛋白質(zhì)在翻譯后被剪切以產(chǎn)生α和β亞基，其通過二硫鍵連接以形成成熟受體。受體酪氨酸激酶c-Met參與細胞過程包括，例如伴隨胚胎發(fā)生和組織再生的遷移、侵入和形態(tài)發(fā)生的過程。
短語“c-Met相關(guān)病癥或狀況”指任何源自c_Met的不利表達或缺乏表達，不利調(diào)控或缺乏調(diào)控，或有害活性或缺乏活性，或可以通過調(diào)節(jié)c-Met表達或活性來進行調(diào)節(jié)、治療或治愈的疾病、病癥或狀況。例如在大部分癌癥患者中，或在其疾病確實由與c-Met途徑相關(guān)的變化驅(qū)動的患者中，可以預(yù)期HGF/c-Met途徑的激活。例如上調(diào)可以歸因于不同的機制，象HGF和/或c-Met的過表達，或通過c-Met突變的組成型激活。c_Met相關(guān)病癥或狀況包括但不限于，例如增生性疾病和紊亂和炎性疾病和紊亂。增生性疾病包括但不限于，例如癌癥，其包括例如，胃癌、食道癌、乳腺癌、腎癌包括乳突狀腎細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸癌、上皮癌、肺癌、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦癌、胰腺癌、胃腸癌、胃癌、腸癌、結(jié)腸癌、肝癌、生殖器癌癥、泌尿器癌癥、黑素瘤、和前列腺癌以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它腫瘤。炎性疾病包括但不限于，例如細菌感染，包括例如由李斯特菌屬細菌引起的感染。在本文和例如在Online Mendelian Inheritance in Man (“OMIM”)端口中描述了其它病癥,例如，OMIN登錄號164860的Met原癌基因和OMM登錄號142409的肝細胞生長因子/散布因子。其它實例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是已知的，例如如Corso等，TRENDS in Mol.Med., 11 (6):2841 (2005)和 Christensen 等，Cancer Letts.,225:1-26 (2005)所綜述的，將這兩篇文獻通過引用方式而合并入本文。
術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和由這些細胞或由肝產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體的產(chǎn)生和/或分泌)的任何活性，其導(dǎo)致選擇性結(jié)合、損傷、破壞或從人體中消除侵入的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞，或者在自身免疫或病理性炎癥的情況下的正常人細胞或組織。
“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指一般由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用例如生長因子結(jié)合受體起始的生物化學(xué)因果關(guān)系，導(dǎo)致信號從細胞一部分傳遞到細胞的另一部分。通常，所述傳遞包括在引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的系列反應(yīng)中一種或多種蛋白質(zhì)上一個或多個酪氨酸，絲氨基或蘇氨酸殘基的特異性磷酸化作用。倒數(shù)第二個過程一般包括核事件，導(dǎo)致基因表達的改變。
“表面受體”包括例如能夠接收信號并能夠?qū)⑦@種信號穿過細胞質(zhì)膜傳遞的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明細胞表面受體的一個實例是c-Met，生長因子蛋白分子，例如肝細胞生長因子(HGF)結(jié)合于其上。
術(shù)語“抗體”包括具有免疫球蛋白樣結(jié)合功能的任何部分。該術(shù)語包括完整的抗體分子和任何抗原結(jié)合片段(即“抗原-結(jié)合部分”)或其單鏈，駱駝科抗體包括例如納米抗體，曬菌體展示結(jié)合構(gòu)建體等等。天然發(fā)生的抗體是糖蛋白，其包含至少兩條通過二硫鍵互聯(lián)的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域:CH1，CH2和CH3組成。只有兩種類型的輕鏈:λ和K。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為\)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。Vh區(qū)和'區(qū)還可以細分為高變區(qū)，稱作互補決定區(qū)(CDR)，其與更加保守的區(qū)，稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域一起交替散布。如在自然中所發(fā)現(xiàn)的，每個Vh和' 由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端至羧基末端按以下順序排布:FR1，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體。
術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或者簡稱為“抗原部分”)表示具有與抗原(例如c-Met的一部分)特異性結(jié)合能力的抗體的全長或一個或多個片段。業(yè)已顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長抗體分子的片段實現(xiàn)。包含抗體的抗原結(jié)合部分的結(jié)合片段的實例包括Fab片段，其是由Vh, (^和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；F (ab) 2片段，其是包括在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；具有VdP CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段；具有抗體鏈單個氨基酸序列的\和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；具有Vh結(jié)構(gòu)域的dAb片段(Ward等，1989, Nature341 ；544-546);和分離的互補決定區(qū)(CDR)。
關(guān)于包含抗原結(jié)合部分的抗體片段，可以包括分離的片段或綴合到化學(xué)或生物學(xué)部分上，或綴合到附于非傳統(tǒng)免疫球蛋白衍生的框架或支架結(jié)構(gòu)上的片段，所述框架或支架結(jié)構(gòu)包括但不限于例如錨蛋白、粘連蛋白、結(jié)構(gòu)域抗體、脂籠蛋白、小模塊式免疫藥物、maxybodies、納米抗體、蛋白質(zhì)A、affilin、Y -晶體蛋白和泛素，以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和預(yù)料到的支架結(jié)構(gòu)。
另外，盡管天然發(fā)生的抗體分子中 存在具有Fv結(jié)構(gòu)域\和Vh的兩條鏈，Vl和Vh由分離的基因編碼，但可以利用重組方法將其用一個合成接頭連接起來，所述合成接頭使其能夠作為單一蛋白鏈重組表達，其中'和Vh區(qū)形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv);參見例如 Bird 等，1988, Science242:423-426 和 Huston 等，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.，85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并以與完整抗體或其其它片段相同的方式對所述片段篩選效用。
“分離的抗體”指基本上不含其它具有不同抗原特性的抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合c-Met上一組氨基酸決定簇的分離抗體，基本上不含特異性和實質(zhì)上結(jié)合c-Met之外抗原的抗體)。不過，特異性結(jié)合c-Met蛋白例如人c-Met的分離抗體與其它抗原具有交叉反應(yīng)性，如來自其它物種的c-Met分子，或與人c-Met氨基酸序列具有高度同一性的蛋白質(zhì)。另外，分離的抗體可以基本上不含其它細胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。
術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指抗體分子的制品，其全部共有單一分子組分。因而單克隆抗體組合物顯示對特定表位單一的結(jié)合特性和親和性。
本文所用的術(shù)語“多克隆抗體”指具有異質(zhì)抗體群的抗體組合物。多克隆抗體通常源自經(jīng)免疫動物或源自選定人的收集(pooled)的血清。
本文所用的術(shù)語“人抗體”意在包括具有可變區(qū)的抗體，其中至少一個并且一般是框架區(qū)和CDR區(qū)都源自人源的序列。另外，如果抗體包含恒定區(qū)，所述恒定區(qū)也源自這種人序列，例如人種系序列，或人種系序列的突變體。本發(fā)明人抗體可以包括不是由人序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變導(dǎo)入的突變?nèi)缛〈?。
術(shù)語“人單克隆抗體”是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，這些抗體具有可變區(qū)，其中框架區(qū)和CDR區(qū)兩者都源自人序列。在一實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤生產(chǎn)，該雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細胞，該動物攜帶包括一般為人源的重鏈轉(zhuǎn)基因和一般為人源的輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，其融合到一般為人源的永生化細胞中。
本文所用的術(shù)語“重組人抗體”，包括通過重組方法制備，表達，生成或分離的人抗體，如從轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)人免疫球蛋白基因的動物(例如小鼠)或尤其制備的雜交瘤中分離的抗體，從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達人抗體的宿主細胞，例如從轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，從重組的組合人抗體文庫中分離的抗體和通過任何其它方法制備，表達，生成或分離的抗體，所述其它方法包括將一種或多種人免疫球蛋白基因序列的全部或一部分剪接到其它DNA序列上。這樣的重組人抗體具有可變區(qū)，其中框架區(qū)和⑶R區(qū)源自人種系免疫球蛋白序列。然而在某些實施方案中，可以對這樣的重組人抗體進行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列為轉(zhuǎn)基因的動物時，進行體內(nèi)體細胞誘變)，從而使得所述重組抗體的Vh區(qū)和'區(qū)的氨基酸序列是盡管來源于人種系Vh和'序列并且與之相關(guān)，但可能并不天然存在于體內(nèi)人抗體種系所有組成成分中的序列。
本文所用的，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別(例如IgA、IgD、IgM、IgE 或 IgG，例如 IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4)。
短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異性的抗體”在本文中可以與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”相互換用。
本文所用的“特異性結(jié)合人c-Met”的抗體意在指以2.0X 1(Γ5Μ或更小，2.0X 1(Γ6Μ或更小，2.0Χ1(Γ7Μ或更小，2.0Χ1(Γ8Μ或更小或2.0Χ1(Γ9Μ或更小的Kd結(jié)合人c-Met的抗體。本文所用的術(shù)語“交叉反應(yīng)性”指結(jié)合其它抗原表位的抗體或抗體群。這可由抗體的低抗體親抗原性或者低特異性引起，或者由具有同一性或者非常相似表位的多個特殊抗原引起。當(dāng)希望一般性結(jié)合相關(guān)組的抗原或如果當(dāng)抗原表位序列在進化上不是高度保守而嘗試跨物種標記時，交叉反應(yīng)性某些時候是所需的。
“與人c-Met之外的抗原交叉反應(yīng)”的抗體指以0.5 X IO^7M或更小，5 X 1(Γ8Μ或更小或2X KT9M或更小的Kd結(jié)合該抗原的抗體。“不與特定抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指如果能完全以1.5X10_8M或更大或5-10X10_7M或5X10_6M或更大的Kd結(jié)合該抗原的抗體。在某些實施方案中，標準結(jié)合測試中，不與抗原交叉反應(yīng)的抗體顯示基本上與這些蛋白質(zhì)不可檢測的結(jié)合。
本文所用的“抑制結(jié)合c-Met”的抗體指抑制HGF/SF配體以IOnM或更小，5nM或更小，InM或更小，0.75nM或更小，0.5nM或更小或0.25nM或更小的&結(jié)合c-Met表面受體的抗體。
本文所用的“抑制c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性”的抗體意指以小于10nM，5nM，2.5nM，1.0nM, 0.5nM或更小的IC5tl抑制c_Met誘導(dǎo)的增生活性或其它誘導(dǎo)活性的抗體。
本文所用的術(shù)語“Kass。?！被颉癒a”意指特定抗體-抗原相互作用的締合比率，本文所用的術(shù)語“Kdis”或“KD”，意指特定抗體-抗原相互作用的解離比率。本文所用的術(shù)語“KD”意指獲自1^對1 (即Kd/Ka)比率并表示為摩爾濃度(M)的解離常數(shù)?？梢岳帽绢I(lǐng)域公認的方法測定抗體的Kd值。測定抗體的Kd的方法是通過利用表面等離子體共振，或利用生物傳感器系統(tǒng)例如Biaco re⑩系統(tǒng)。
本文所用的術(shù)語“激動劑抗體”或“激活性抗體”意指當(dāng)添加至表達C-Met的細胞、組織或器官時，將一種或多種c-Met誘導(dǎo)的活性提高至少20%-40%的抗體。在一些實施方案中，所述抗體激活c-Met活性至少50%，60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%或大于100%。在一些實施方案中，本發(fā)明激動劑抗體將c-Met的至少一種活性提高10倍。一般地，這種提高在缺乏生物學(xué)誘導(dǎo)劑HGF的情況下觀察到。不過，在一些實施方案中，例如測定的對照中，激活性抗體在存在HGF的情況下添加。
本文所用的術(shù)語“親和性”指在單一抗原性位點上抗體和稱作“表位”的抗原部分之間相互作用的強度。在每一個抗原性位點內(nèi)，抗體“臂”的可變區(qū)通過弱非共價力與抗原在抗體的多個原子位置或氨 基酸殘基原子上相互作用；一般地，這種相互作用的數(shù)目越大，抗體對抗原的親和性就越強。
本文所用的術(shù)語“抗體親抗原性”指抗體-抗原復(fù)合物的總體穩(wěn)定性或強度的信息性測量。其由三種主要因素控制:抗體-表位親和性；每種抗原和抗體的價；這些相互作用部分的結(jié)構(gòu)排列或三維構(gòu)型。最終這些因素限定抗體的特異性，即特定抗體結(jié)合精確抗原表位的可能性以及鍵的穩(wěn)定性和持續(xù)時間。
為了獲得具有較高抗體親抗原性的探針，可以構(gòu)建二聚體綴合物(偶聯(lián)到FACS標記上的兩分子抗體蛋白質(zhì)或多肽)，從而使得低親和性的相互作用(例如與種系抗體)更加容易通過FACS檢測。另一種提高抗原結(jié)合的抗體親抗原性方法包括生成c-Met抗體的任何本文所述構(gòu)建體的二聚 體或多聚體。這種多聚體可以通過單個模塊之間的共價結(jié)合生成，例如通過模仿天然C-至-N-末端結(jié)合或通過模仿抗體二聚體，所述抗體二聚體通過其恒定區(qū)保持在一起。改造入Fc/Fc界面的鍵可以是共價的或非共價鍵。此外，可以將Fe之外的二聚或多聚部分用于構(gòu)建抗-C-Met抗體雜合物，例如雙功能性抗體，以生成這種更高級的結(jié)構(gòu)。本文所用對于IgG抗體的“高度親和性”術(shù)語指對于靶抗原具有10_8M或更小，IO-9M或更小或ΙΟ,Μ或更小的Kd的抗體。不過，“高度親和性”結(jié)合可以對其它抗體同種型而變化。例如對于IgM同種型的“高度親和性”結(jié)合指具有IO-7M或更小或IO-8M或更小的Kd的抗體。本文所用術(shù)語“受試者”包括包括人的任何哺乳動物,或非人哺乳動物,或其它動物。術(shù)語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物，例如非人靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛和非哺乳類例如鳥類、兩棲類、爬行動物等。術(shù)語“優(yōu)化的”指核苷酸序列已被改變以利用在生產(chǎn)細胞或生物中優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸序列，所述細胞一般為真核細胞，例如例如畢赤酵母(Pichia)的酵母細胞，哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人細胞。對優(yōu)化的核苷酸序列進行改造，完全或盡可能地保留由最初核苷酸序列，也稱作“親本”序列所編碼的氨基酸序列。本文優(yōu)化的核苷酸已經(jīng)被改造成具有人細胞中優(yōu)選的核苷酸序列密碼子，不過這里還預(yù)想這些序列在其它真核細胞中優(yōu)化表達。本文中由優(yōu)化的核苷酸序列所編碼的抗體的氨基酸序列也稱為優(yōu)化的。在下面的小節(jié)中進一步詳述本發(fā)明的各個方面。評估抗體對于各物種C-Met結(jié)合能力的標準測定法是本領(lǐng)域已知的，包括例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡和RIA。合適的測定法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。參見例如，F(xiàn).Ausubel 等編著，2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingand Wiley Interscience, New York?？贵w的結(jié)合動力學(xué)(例如結(jié)合親和性)也可以通過本領(lǐng)域已知的標準測定法來評定，例如通過Biacore分析。本文描述了評估抗體對于c_Met功能特性的作用(例如誘導(dǎo)受體的內(nèi)在化作用、抑制生長因子結(jié)合c-Met、抑制c-Met自體磷酸化、抑制c-Met途徑激活，由此預(yù)防或改善增殖或激酶測定)的測定法。因此，抑制根據(jù)本領(lǐng)域已知和本文所述方法所測定的這些C-Met功能特性(例如生化、免疫化學(xué)、細胞、生理學(xué)或其它生物學(xué)活性等等)中的一種或多種的抗體相對于缺少抗體所觀察(例如或者存在不相關(guān)特異性的對照抗體)到的涉及統(tǒng)計學(xué)上顯著地拮抗或降低特定活性。抑制c-Met活性的抗體影響這種統(tǒng)計學(xué)上顯著地降低測量參數(shù)的至少10%，至少50%，80%或90%，在某些實施方案中本發(fā)明抗體可以抑制大于95%，98%或99%的c-Met功能活性。一般地，在誘導(dǎo)事件，例如添加HGF之后測量活性的降低?；蛘?，“激動”根據(jù)本領(lǐng)域已知和本文所述方法所測定的這些C-Met功能特性(例如生化、免疫化學(xué)、細胞、生理學(xué)或其它生物學(xué)活性等等)中的一種或多種的抗體相對于缺少抗體所觀察(例如或者存在不相關(guān)特異性的對照抗體)到的涉及統(tǒng)計學(xué)上顯著地提高特定活性。刺激或激動c-Met活性的抗體影響這種統(tǒng)計學(xué)上顯著地提高測量參數(shù)的至少10%，至少50%，80%或90%，在某些實施方案中本發(fā)明抗體可以激動大于95%，98%或99%或更大的c-Met功能活性。

重鉬杭體
本發(fā)明抗體是重組抗體，如實施例中所述進行分離和結(jié)構(gòu)表征?？贵wVh核苷酸序列分別顯示于SEQ ID NO:21-30中。表C-E提供本發(fā)明不同抗體的Vh核苷酸序列實例?？贵w\核苷酸序列分別顯示于SEQ ID NO:1-20中。(表C-E提供本發(fā)明不同抗體的\核苷酸序列實例)。抗體IgA和K輕鏈核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:73-76和表C-E中。抗體IgG4核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:85-88和表C-E中。本發(fā)明其它抗體包括已經(jīng)被突變，但與上述序列具有至少60，70，80，90，95或99%同一性的核苷酸?？贵wVh氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO:55_72和表A-B和E中?？贵wVl氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO:31-54和表A-B和E中。IgA輕鏈氨基酸序列分別顯示于SEQID NO:77-80和表A-B和E中?？贵wIgK輕鏈氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO:81-84和表A-B和E中?？贵wIgG4氨基酸序列分別顯不于SEQ ID NO:89-96和表A-B和E中。本發(fā)明其它抗體包括已經(jīng)被突變，但保留與上述序列至少60，70，80，90，95或99%同一性的氨基酸。由于這些抗體每種都能夠結(jié)合C-Met細胞外部分上的位點，所以可以將VH/\ (核苷酸序列和氨基酸序列)，VH/IgX輕鏈(核苷酸序列和氨基酸序列)dPVH/IgK輕鏈(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以產(chǎn)生本發(fā)明抗c-Met結(jié)合分子的其它組合?？梢岳蒙鲜龊蛯嵤├?例如ELISA)的結(jié)合測定法對這些抗體的c-Met結(jié)合進行測試。本發(fā)明抗體的VH，VL, IgA輕鏈和IgK輕鏈序列特別適于進行新的組合，因為這些抗體使用源自相同或相似種系序列的VH，'，Ig λ輕鏈和IgK輕鏈序列，并且因而顯示結(jié)構(gòu)相似性。因此，在一方面，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其至少具有:包含選自SEQ ID NO:55- 72的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh);含選自SEQ ID NO:31-54的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(');其中所述抗體特異性結(jié)合c-Met。重和輕鏈組合的實例至少包括:SEQ ID NO:65的VjP SEQ ID NO:32的Vl ;*SEQID NO:66 的 Vh 和 SEQ ID NO:34 的 \ ;或 SEQ ID NO:67 的 Vh 和 SEQ ID NO:37 的 \ ;或SEQ ID NO:68 的 Vh 和 SEQ ID NO:38 的八；或 SEQ ID NO:69 的 Vh 和 SEQ ID NO:51 的八；或 SEQ ID NO:70 的 Vh 和 SEQ ID NO:52 的 \ ;或 SEQ IDNO:71 的 Vh 和 SEQ ID NO:53 的Vl ;或 SEQ ID NO:72 的 Vh 和 SEQID NO:54 的 \ ;或 SEQ ID NO:55 的 Vh 和 SEQ ID NO:31的八；或 SEQ ID NO:58 的 Vh 和 SEQ ID NO:36 的八；或 SEQ ID NO:61 的 Vh 和 SEQ ID NO:41的\ ;或SEQ ID NO:62的V1^P SEQ IDNO:45的V”表A-B舉例說明了本發(fā)明不同抗體的Vh和\氨基酸序列的“混合和匹配”實例。圖1-3是舉例說明Vh和\氨基酸序列實例的表，舉例說明了可以由替代結(jié)構(gòu)提供的FR和CDR區(qū)，以提供具有與本文抗體相同或相似c-Met拮抗活性的構(gòu)建體。因此，在另一方面，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其至少具有:包含選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的Vh區(qū)和包含選自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列的IgX輕鏈,其中所述抗體特異性結(jié)合C-Met。Vh/Ig λ輕鏈組合的實例至少包括:SEQ ID NO:66的Vh和SEQ ID NO:77的Ig λ輕鏈；或SEQ ID NO:65的Vh和SEQ ID NO:78的Ig λ輕鏈；或包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的Vh區(qū)和SEQ ID NO:79的Ig λ輕鏈；或SEQ ID NO:70的Vh區(qū)和SEQ ID NO:80的IgA輕鏈。因此，在另一方面，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其至少具有:包含選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的Vh區(qū)和包含選自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列的IgK輕鏈,其中所述抗體特異性結(jié)合c-Met。Vh/Ig K輕鏈組合的實例至少包括:SEQ ID NO:71的Vh區(qū)和SEQID NO:81的Ig κ輕鏈；或SEQ ID NO:68的Vh區(qū)和SEQ ID NO:82的Ig κ輕鏈；或SEQ ID NO:67的Vh區(qū)和SEQ ID NO:83 的 IgK 輕鏈；或 SEQ ID NO:72 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO:84 的 IgK 輕鏈。在另一方面，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其至少具有:包含選自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列的Vh鏈和包含選自SEQID NO:1-20的核苷酸序列的\鏈。因而重和輕鏈組合的實例至少包括:包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列的VHg和包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ IDNO:23的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQID NO:24的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的VHg和包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)。參見表A-B舉例說明了本發(fā)明不同抗體的Vh和\核苷酸序列的“混合和匹配”配對的實例，以便更具體的示例Vh和\核苷酸序列的配對。在另一方面，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其至少具有:包含選自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列的Vh鏈和包含選自SEQID NO:73的核苷酸序列的IgA輕鏈。因而VH/Ig λ輕鏈組合的實例包括:包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:73的核苷酸序列的IgA輕鏈。在另一方面，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其至少具有:包含選自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列的Vh鏈和包含選自SEQID NO:74-76的核苷酸序列的IgK輕鏈。因而Vh和Ig K輕鏈組合的實例至少包括:包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:74的核苷酸序列的IgK輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列的％區(qū)和包含SEQ ID NO:75的核苷酸序列的IgK輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:76的核苷酸序列的IgK輕鏈可變區(qū)。本文所用的人抗體包含重或輕鏈可變區(qū)，其是特定種系序列的“產(chǎn)物”或“源于”特定種系序列，條件是抗體的可變區(qū)獲自使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)包括用目標抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的 轉(zhuǎn)基因小鼠或用目標抗原篩選在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫。可以通過比較人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列并選擇與人抗體序列在序列上最接近(即最大的％同一性)的人種系免疫球蛋白序列，來鑒定是人種系免疫球蛋白序列的產(chǎn)物或源于人種系免疫球蛋白序列的人抗體。是特定人種系免疫球蛋白序列的產(chǎn)物或源于特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體可能包含與種系序列相比有差異的氨基酸。這種差異歸因于例如至少一個天然發(fā)生的體細胞突變或有意導(dǎo)入的定點突變。不過，選定的人抗體一般與人種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90%相同，并且包含這樣的氨基酸殘基，即當(dāng)與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如小鼠種系序列)比較時，所述氨基酸殘基鑒定人抗體為人源的。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上可以與種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列具有至少60%，70%, 80%, 90%或至少95%或甚至至少96%，97%, 98%或99%的同一性。一般，源自特定人種系序列的人抗體將會顯示與人種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列不超過10個氨基酸的差異。在某些情況下，人抗體將會顯示與種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列不超過5個，甚至不超過4，3，2或I個氨基酸的差異。
同一性抗體
在又一個實施方案中，本發(fā)明抗體至少具有與本文所述抗體的氨基酸和核苷酸序列具有同一性或同一性的可變區(qū)重和輕鏈核苷酸序列，或可變區(qū)重和輕鏈氨基酸序列，或IgA核苷酸序列，或Ig X氨基酸序列，或IgK核苷酸序列，或Ig K氨基酸序列，或IgG4核苷酸序列，或IgG4氨基酸序列，其中所述抗體保留本發(fā)明抗C-Met抗體的所需功能特性，即顯示親本功能活性。所述親本功能活性可以是拮抗性的或激動性的。在大多數(shù)實施方案中，所述活性是拮抗性的。
例如，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其具有Vh區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分，從而所述Vh區(qū)包含與選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列具有至少80%，85%，90%, 95%或99%同一性的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:31-54的氨基酸序列具有至少80%，85%，90%，95%或99%同一性的氨基酸序列，其中所述抗體特異性結(jié)合c-Met并且所述抗體顯示下列功能性拮抗特性中的至少一種:所述抗體誘導(dǎo)c-Met受體的內(nèi)在化作用、所述抗體抑制蛋白質(zhì)生長因子結(jié)合c-Met、所述抗體抑制c-Met的自體磷酸化，由此阻止c-Met途徑的激活、所述抗體抑制源自信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的c-Met途徑上調(diào)、或所述抗體抑制c_Met結(jié)合，由此預(yù)防或改善細胞增殖，存活，遷移，侵入或形態(tài)變化，尤其是預(yù)防或改善癌癥，例如腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移。
在備選的實施方 案中，所述抗體是響應(yīng)性的并且激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。在一個實施方案中，所述細胞應(yīng)答是傷口愈合應(yīng)答。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其具有IgX輕鏈的抗原結(jié)合部分，從而所述Ig A輕鏈包含與選自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述抗體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示下列功能特性中的至少一種:所述抗體激活誘導(dǎo)c-Met受體的內(nèi)在化作用、所述抗體抑制蛋白質(zhì)生長因子結(jié)合c-Met，由此用這種抑制阻止受體的激活，例如阻止源自c-Met激活和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑上調(diào)、或者所述抗體預(yù)防或改善細胞增殖，細胞存活，遷移，侵入或形態(tài)變化、或者所述抗體拮抗c-Met活性，由此預(yù)防或改善癌癥，例如腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移。
在備選的實施方案中，所述抗體激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其具有IgK輕鏈的抗原結(jié)合部分，其中所述Ig K輕鏈具有與選自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；所述抗體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示以上和整個說明書中提供的功能特性中的至少一種。在備選的實施方案中，所述抗體激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體是IgG4，從而IgG4具有與選自SEQ ID NO:89-96的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；所述抗體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示以上和整個說明書中提供的功能特性中的至少一種。在備選的實施方案中，所述抗體是激動性的，并且激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。
在多個實施方案中，所述抗體可以顯示本文所討論拮抗功能特性中的一種或更多種，兩種或更多種，或三種或更多種。所述抗體可以是例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其具有Vh區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分，從而Vh區(qū)由與選自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所編碼；輕鏈可變區(qū)由與選自SEQ ID NO:1-20的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所編碼；編碼的抗體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示以上和整個說明書中提供的功能特性中的至少一種。在備選的實施方案中，所述抗體激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。
在又一個實施例中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其具有IgX輕鏈的抗原結(jié)合部分，從而IgA輕鏈由與選自SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所編碼；編碼的抗體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示以上和整個說明書中提供的功能特性中的至少一種。在備選的實施方案中，所述抗體是激動性的并且激活c-Met磷酸化作用，刺激細胞應(yīng)答。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其具有IgK輕鏈的抗原結(jié)合部分，其中IgK輕鏈由與選自SEQ ID NO:74-76的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所編碼；所述抗 體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示以上和整個說明書中提供的功能特性中的至少一種。在備選的實施方案中，所述抗體激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的重組抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體是IgG4，其中所述IgG4由與選自SEQ ID NO:85-88的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列所編碼；編碼的抗體特異性結(jié)合c-Met，并且所述抗體顯示以上和整個說明書中提供的功能特性中的至少一種。在備選的實施方案中，所述抗體是激動性的并且激活刺激細胞應(yīng)答的c-Met磷酸化作用。
在多個實施方案中，所述抗體可以顯示本文所討論的拮抗功能特性中的一種或更多種，兩種或更多種，或三種。所述抗體可以是例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
在其它實施方案中，Vh和/或\氨基酸序列可以與以上給出的序列具有50%，60%,70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 的同一性。具有分別與 SEQ ID NO:31-72 的 Vh 和 Vl區(qū)具有高度(即80%或更大)同一性的Vh和\區(qū)的抗體，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID NO:31-72的核酸分子，隨后利用本文所述功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，重鏈和/或輕鏈核苷酸序列的可變區(qū)可以與以上給出的序列具有 60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分別與 SEQ ID NO:21-30的可變區(qū)重鏈和SEQ ID NO:1-20的可變區(qū)輕鏈具有高度(即80%或更大)同一性的可變區(qū)重鏈和輕鏈的抗體，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)包含SEQ ID NO:1-30的核酸分子，隨后利用本文所述功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，IgX輕鏈氨基酸序列可以與以上給出的序列具有50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分別與 SEQ ID NO:77-80 的 Ig 入輕鏈具有高度(即80%或更大)同一性的IgX輕鏈的抗體，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID NO:77-80的核酸分子，隨后利用本文所述功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，IgX輕鏈核苷酸序列可以與以上給出的序列具有60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%的同一性。具有分別與SEQ ID N0:73的Ig入輕鏈具有高度(即80%或更大)同一性的IgA輕鏈的抗體，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)包含SEQ ID NO:73的核酸分子，隨后利用本文所述功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，IgK輕鏈氨基酸序列可以與以上給出的序列具有50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分別與 SEQ ID NO:81-84 的 IgK 輕鏈具有高度(即80%或更大)同一性的Ig K輕鏈的抗體，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID NO:81-84的核酸分子，隨后利用本文所述功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，IgK輕鏈核苷酸序列可以與以上給出的序列具有60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性。具有分別與 SEQ ID NO:74-76 的 IgK 輕鏈具有高度(即80%或更大)同一性的IgK輕鏈的抗體，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)包含SEQ ID NO:74-76的核酸分子，隨后利用本文所述的功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即，上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，所述抗體是可以與以上給出的氨基酸序列具有50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的同一性的 IgG4。分別與 SEQ ID NO:89-96 的 IgG4 組合物具有高度(即80%或更大)同一性的IgG4，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID NO:89-96的核酸分子，隨后利用本文所述的功能測定法對編碼的源于誘變而改變的抗體測試保留的功能(即，上面給出的功能)而獲得。
在其它實施方案中，所述抗體是與以上給出的核苷酸序列具有60%，70%, 80%, 90%，95%, 96%, 97%, 98% 或 99% 同一性的 IgG4。分別與 SEQ ID NO:85-88 的 IgG4 具有高度(即80%或更大)同一性的IgG4，可以通過誘變(例如定點或PCR-介導(dǎo)的誘變)包含SEQ ID NO:85-88的核酸分子，隨后利用本文所述的功能測定法對編碼的改變的抗體測試保留的功能(即上面給出的功能)而獲得。
本文所用的兩個氨基酸序列或兩個核苷酸 序列之間的百分比同一性等同于所述兩種序列之間的百分比同一性，這些術(shù)語在本文中可以交換使用。兩種序列之間的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)X 100)，為了優(yōu)化兩種序列的比對，該函數(shù)應(yīng)考慮需要引入的缺口數(shù)目以及每個缺口長度。兩個序列之間的序列比較和百分比同一性測定可以利用數(shù)學(xué)運算法來完成，如下面非限制性實施例中所述的。
兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的百分比同一性可以利用并入ALIGN程序(版本 2.0)的 E.Meyers 和 ff.Miller 的算法(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17,1988)來測定，并使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分為12以及缺口罰分為4的參數(shù)。此外，可以用已經(jīng)并入到GCG軟件包的GAP程序(可得自http://www.gcg.com)中的Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法，使用 Blossom62 矩陣或 PAM250 矩陣以及缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6、或4和長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6，測定兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的百分同一丨I"生。
此外或備選地，本發(fā)明蛋白質(zhì)序列還可以進一步用作“查詢序列”，對公共數(shù)據(jù)庫進行搜索，以便例如鑒定相關(guān)序列。這樣的搜索可以用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215 =403-10的XBLAST程序(版本2.0)來進行。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用XBLAST程序，分值=50，字長=3來進行，以獲得與本發(fā)明抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得加入缺口的比對以供比較,可以如 ALtschul 等，1997，Nucleic Acids Res.,25 (17):3389-3402 中所述，利用Gapped BLAST。當(dāng)用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用相應(yīng)程序(例如XBLAST 和 NBLAST)的缺省參數(shù)。參見 http://www.ncb1.nlm.nih.gov。
根據(jù)已知技術(shù)可以測定允許核苷酸序列雜交到本文所示核苷酸序列上的條件。核苷酸的雜交在降低的嚴謹性，中等嚴謹性或甚至是嚴謹條件下進行。根據(jù)6+0%和多核苷酸的長度而定，示例性低嚴謹條件是37° C的包含35-40%甲酰胺與5XDenhardt氏溶液，0.5%SDS和I X SSPE的緩沖液。示例性中等嚴謹性條件是42° C的包含40-45%甲酰胺與5X Denhardt氏溶液，0.5%SDS和IXSSPE的緩沖液。示例性高度嚴謹性條件是42° C或更高的溫度的包含50%甲酰胺與5XDenhardt氏溶液，0.5%SDS和IXSSPE的緩沖液。參見J.Sambrook 等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二版)(Cold SpringHarbor Laboratory)。
在任何以上示例性嚴謹條件下的核苷酸序列雜交都是在溶液中進行并在濾膜上收集?；蛘咴谌魏我陨鲜纠試乐敆l件下的核苷酸序列雜交都是在凝膠中進行的，例如DNA印跡法。
具有保守性修 飾的抗體
在某些實施方案中，本發(fā)明抗體具有包括選自SEQ ID NO:55-72的序列的Vh區(qū)和包括選自SEQ ID NO:31-54的序列的輕鏈可變區(qū)，從而這些序列中的一種或多種具有基于本文所述抗體的特定氨基酸序列或其保守性修飾，并且所述抗體具有本發(fā)明抗c-Met抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供分離的抗體或其具有Vh鏈和'鏈的抗原結(jié)合部分，從而Vh鏈具有選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列及其保守性修飾，'鏈具有選自SEQ IDNO:31-54的氨基酸序列及其保守性修飾；所述抗體特異性結(jié)合c-Met ;并且所述抗體顯示下列功能特性中的至少一種:所述抗體激活誘導(dǎo)c-Met受體的內(nèi)在化作用，所述抗體抑制蛋白質(zhì)生長因子結(jié)合c-Met，由此用這種抑制阻止受體的激活，例如阻止源自c-Met激活和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑上調(diào)，或者所述抗體預(yù)防或改善細胞增殖，細胞存活，遷移，侵入或形態(tài)變化，或者所述抗體拮抗c-Met活性，由此預(yù)防或改善癌癥例如腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移。
在備選的實施方案中，所述抗體是激動性的并且激活刺激細胞應(yīng)答的C-Met磷酸化作用。
在某些實施方案中，本發(fā)明抗體是具有選自SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列的IgA輕鏈，從而這些序列中的一種或多種具有源自本文所述抗體的氨基酸序列并具有保守性修飾的氨基酸序列，從而衍生的抗體保留本發(fā)明抗c-Met抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供分離的親本抗體或其具有Ig X輕鏈的抗原結(jié)合部分，從而Ig X輕鏈具有選自SEQID NO:77-80的氨基酸序列及其保守修飾；所述抗體特異性結(jié)合c-Met ;并且所述抗體顯示本文所述的功能性拮抗特性中的至少一種。
在備選的實施方案中，所述抗體是激動性的并且激活刺激細胞應(yīng)答的c Met磷酸化作用。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供具有IgK輕鏈的抗體，所述IgK輕鏈具有選自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列，從而這些抗體中的一種或多種具有源自本文所述抗體的氨基酸序列并具有其保守性修飾，并且其中所述抗體顯示本發(fā)明親本抗c-Met抗體的功能特性。因此，本發(fā)明提供具有IgK輕鏈的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，從而IgK輕鏈具有選自SEQ ID NO:81-84的氨基酸序列及其保守性修飾形式；所述抗體特異性結(jié)合c-Met ;并且所述抗體顯示本文提供的功能特性中的至少一種。
在備選的實施方案中，所述抗體激活刺激細胞應(yīng)答的C-Met磷酸化作用。
在其它實施方案中，本發(fā)明抗體是IgG4，其具有選自SEQ ID NO:89_96的氨基酸序列，其中這些序列中的一種或多種具有源自本文所述抗體親本氨基酸序列的氨基酸序列或其保守性修飾，并且所述抗體顯示本發(fā)明抗c-Met抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體是IgG4，其中:IgG4具有選自SEQ ID NO:89-96的氨基酸序列及其保守性修飾；所述抗體特異性結(jié)合c-Met ;并且所述抗體顯示本文所述功能性拮抗特性中的至少一種。
在備選的實施方案中，所述抗體是激動性的并且激活刺激細胞應(yīng)答的C-Met磷酸化作用。
在多個實施方案中，所述抗體可以顯示出上面討論列出的拮抗功能特性中的一種或更多種，兩種或更多種，或三種或更多種。這些抗體可以是例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
本文所用的術(shù)語“保守性序列修飾”意指這樣的氨基酸修飾，其不會顯著影響或改變包含所述氨基酸序列的抗體的結(jié)合特異性。這類保守性修飾包括本文所述的氨基酸取代，添加和缺失。通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)，例如定點誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變，將修飾導(dǎo)入本發(fā)明抗體中。
保守性氨基酸取代用具有化學(xué)和物理學(xué)相似側(cè)鏈的不同氨基酸殘基來替代氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族是本領(lǐng)域已知的。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電核極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，^分枝側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因而，本發(fā)明抗體CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以用來自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸替代，并且可以利用本文所述的功能測定法對變化的抗體測試保留的功能。
抗體框架
可以采用許多種抗體/免疫球蛋白框架或支架結(jié)構(gòu)，只要得到的多肽包括一種或多種結(jié)合區(qū)，其對于本文示例性序列的c-Met蛋白具有特異性。這類框架或支架結(jié)構(gòu)包括人免疫球蛋白或其片段(例如本文其它處所披露的那些)的5種主要同種型，并包括其它動物物種的免疫球蛋白，其優(yōu)選為人源化方面的。單一重鏈抗體例如在駱駝科動物中鑒定的那些在這一方面特別令人感興趣。新的框架、支架結(jié)構(gòu)和片段不斷被本領(lǐng)域技術(shù)人員所發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。
或者，可以采用已知的或未來的非免疫球蛋白框架和支架結(jié)構(gòu)，只要其包含特異性針對c-Met蛋白的結(jié)合區(qū)。本文將這些化合物稱作“包含c-Met-特異性結(jié)合區(qū)的多肽”。已知的非免疫球蛋白框架或支架結(jié)構(gòu)包括Adnectins (纖連蛋白)(CompoundTherapeutics, Inc., Waltham, MA),錨蛋白(Molecular Partners AG, Zurich,瑞士)，結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)和 Ablynx nv (Zwi jnaarde,比利時))，脂籠蛋白(Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising,德國)，小模塊式免疫藥物(TrubionPharmaceuticals Inc., Seattle,WA),maxybodies (Avidia,Inc.(Mountain View,CA)),蛋白質(zhì) A (Affibody AG,瑞典)和 affilin ( y 晶體蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,德國)。
結(jié)合與本發(fā)明抗c-Met抗體相同表位的抗體
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供抗體，其與本文提供的本發(fā)明各種抗c-Met抗體結(jié)合相同表位。在標準c-Met結(jié)合測定中，可以基于與本發(fā)明其它抗體交叉競爭的能力(例如以統(tǒng)計學(xué)上顯著意義的結(jié)合的競爭性抑制)而鑒定這些另外的抗體。抑制抗體(已知具有結(jié)合人c-Met能力)結(jié)合的受試抗體的能力表明受試抗體可以與該抗體競爭。根據(jù)非限制性理論，這樣的抗體可以與其所競爭的抗體結(jié)合人c-Met上相同或相關(guān)的(例如結(jié)構(gòu)類似或空間接近)的表位。如實施例中所述可以制備和分離這類抗體。
駱駝科抗體
已經(jīng)對由胳馬它和單峰胳馬它家族成員(雙峰馬它(Camelus bactrianus)和Calelusdromaderius)獲得的抗體蛋白質(zhì)進行了關(guān)于大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和在人受試者中的抗原性表征，所述駱§它和單峰駱§它家族成員包括新大陸成員例如美洲騎(llama)物種(Lama paccos,大羊§它(Lama glama)和大羊騎(Lama vicugna))。在自然界中發(fā)現(xiàn)來自這種哺乳動物科的某些IgG抗體缺少輕鏈，因而具有與具有兩條重鏈和兩條輕鏈的典型四鏈結(jié)構(gòu)明顯不同的結(jié)構(gòu)，所述四鏈結(jié)構(gòu)是來自其它動物的抗體的特征。參見PCT/EP93/02214 (1994年3月3日公開的W094/04678)。
駱駝科抗體的區(qū)域，被鑒定為Vhh的小的單一可變結(jié)構(gòu)域，可以通過遺傳工程改造來獲得產(chǎn)生對靶標具有高度親和性的小蛋白，導(dǎo)致一種低分子量抗體來源的蛋白質(zhì)，稱作“駱駝科納米抗體”。見1998年6月2日發(fā)布的美國專利5，759，808 ;還見Stijlemans,B.等，2004, J Biol Chem,279:1256-1261 ；Dumoulin, M.等，2003, Nature,424:783-788 ；Pleschberger, M.等，2003, Bioconjugate Chem,14:440-448 ；Cortez-Retamozo, V.等，2002, Int J Cancer，89:456-62 ;和 Lauwereys，M.等，1998，EMB0J，17:3512_3520。駱駝科抗體和抗體片段經(jīng)改造過的文庫可以，例如從Ablynx,Ghent,Belgium商購。如本領(lǐng)域?qū)τ谄渌侨嗽纯贵w已知的，可以重組改變駱駝科抗體的氨基酸序列，以獲得更加近似人序列的序列，即納米抗體可以被人源化。因而駱駝科抗體對人的天然低抗原性可以再減弱。
駱駝科納米抗體具有人IgG分子大約十分之一的分子量，并且所述蛋白只有幾納米的物理直徑。小尺寸的一個結(jié)果是駱駝科納米抗體結(jié)合對于較大抗體蛋白而言為功能上不可識別的抗原性位點的能力，即駱駝科納米抗體可用作檢測抗原的試劑，而所述抗原對于利用經(jīng)典免疫技術(shù)而言是隱蔽的，駱駝科納米抗體還可用作可能的治療劑。小尺寸的又一個結(jié)果例如是駱駝科納米抗體能夠結(jié)合到靶蛋白凹槽或狹縫中特定位點而產(chǎn)生抑制性結(jié)果，因此能夠形成這樣的能力，其比經(jīng)典高分子量抗體更近似地模仿經(jīng)典低分子量藥物的功能。
低分子量和緊湊的尺寸還導(dǎo)致駱駝科納米抗體極端熱穩(wěn)定，對于極端pH穩(wěn)定和對于蛋白水解消化穩(wěn)定，并且具有低抗原性。另一個結(jié)果是駱駝科納米抗體容易從循環(huán)系統(tǒng)移入組織內(nèi)，即外滲，甚至穿過血腦屏障并因而可以進行改造來治療影響神經(jīng)組織的病癥。納米抗體還可以促進藥物轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障。參見公布于2004年8月19日的美國專利申請20040161738。這些特征結(jié)合對人的低抗原性表明極大的治療潛力。另外，這些分子可以在原核細胞例如大腸桿菌(E.coli)中完全表達,其作為與噬菌體的融合蛋白而表達，這樣表達的蛋白質(zhì)是功能性的。
因此，本發(fā)明一個特征是對靶蛋白C-Met具有高度親和性的駱駝科抗體或納米抗體。在本文某些實施方案中，駱駝科抗體或納米抗體天然產(chǎn)生于駱駝科動物中，即利用本文對其它抗體所述的技術(shù)，在用靶蛋白c-Met或其肽片段免疫后由駱駝科動物產(chǎn)生，或在轉(zhuǎn)基因駱駝科動物中重組產(chǎn)生。或者，對抗c-Met駱駝科納米抗體進行改造，即，如本文實施例中所述以c-Met作為靶標，利用淘選方法例如由噬菌體文庫通過選擇來產(chǎn)生，所述噬菌體展示適當(dāng)誘變的駱駝科納米抗體蛋白?？梢酝ㄟ^遺傳工程來進一步定制改造的納米抗體，以便在受體受試者體內(nèi)具有45分鐘到兩周的半衰期。
經(jīng)改誥或修飾的杭體
可以利用具有一種或多種本文所示的￥11和/或'序列，IgX輕鏈序列或IgK輕鏈序列的抗體作為起始材料(即作為親本序列)來制備本發(fā)明抗體，以改造衍生修飾的抗體，所述抗體是經(jīng)修飾的抗體，與起始抗體相比其可以具有變化和改善的特征。可以通過在一個或兩個可變區(qū)(即％和/或VJ或只在IgX輕鏈內(nèi)，或只在IgK輕鏈內(nèi)，在一個或多個⑶R區(qū)和/或在一個或多個框架區(qū)內(nèi)修飾一個或多個殘基來改造抗體。此外或備選地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的 殘基，例如改變抗體的效應(yīng)子功能來改造抗體。
可以進行的一類可變區(qū)改造是⑶R移植?？贵w主要通過位于重和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，在各種抗體間CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列更加多變。由于CDR序列負責(zé)大多數(shù)的抗體-抗原相互作用，有可能通過構(gòu)建表達載體來表達模仿特定天然發(fā)生抗體的特性的重組抗體，所述表達載體包括來自天然發(fā)生抗體的CDR序列，其移植到來自具有不同特性的不同抗體框架序列上(參見例如Riechmann，L.等，1998，Nature，332:323-327 Jones, P.等，1986，Nature，321:522-525 ；Queen, C.等，1989, Proc.Natl.Acad ;參見 U.S.A.86:10029-10033 ;授予 winter 的美國專利 5，225，539，和授予 Queen 等的美國專利 5，530，101 ；5, 585，089 ；5, 693，762 和 6，180，370)。
這類框架序列可以獲自包括種系抗體基因序的公共DNA數(shù)據(jù)庫或公開發(fā)表的參考文獻。例如，人重和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(可從互聯(lián)網(wǎng)獲得，網(wǎng)址為 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase),以及在 Kabat, E.A.，等，1991，Sequence of Protein of Immunological Interest,第5版，U.S.,Department of Healthand human Services, NIH 出版號 91-3242 ；Tomlinson, 1.M.,等，1992, J.Mol.Biol., 227:776-798 ;和 Cox, J.P.L.等，1994，Eur.J Immunol.,24:827-836 中發(fā)現(xiàn)；每一篇的內(nèi)容都通過引用的方式而合并入本文。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些情況下誘變框架區(qū)內(nèi)的殘基對于保持或提高抗體的抗原結(jié)合能力是有益的(參見例如，授予Queen等的美國專利5，530，101 ；5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370)。
另一種類型的可變區(qū)修飾是￥11和/或Vl的⑶Rl，⑶R2和/或⑶R3區(qū)內(nèi)氨基酸殘基的突變，由此提高目標抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和性)，稱作“親和性突變”?？梢赃M行定點誘變或PCR介導(dǎo)的誘變來導(dǎo)入突變，通過本文所述的和在實施例中提供的體外或體內(nèi)測定法來評估對于抗體結(jié)合或另一種目標功能特性的重要影響?？梢砸氡Ｊ匦孕揎?如上面討論的)。突變可以是氨基酸取代，添加或缺失。一般CDR區(qū)內(nèi)不超過一個，兩個，三個，四個或五個殘基被改變，盡管還可以預(yù)想另外的變化。
本發(fā)明經(jīng)改造的抗體包括那些抗體，其中對Vh和/或\，和/或Ig入輕鏈，和/或IgK輕鏈內(nèi)的框架殘基進行修飾，以便例如改善抗體的特性。一般進行這類框架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個框架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)種系序列的框架殘基。更加具體地，已經(jīng)進行過體細胞突變的抗體可以包含與該抗體源自的種系序列不同的框架殘基。通過比較抗體框架序列與該抗體源自的種系序列可以鑒定這類殘基。為了將框架區(qū)序列回復(fù)為其的種系構(gòu)型，通過例如定點誘變或PCR介導(dǎo)的誘變將體細胞突變回復(fù)突變?yōu)榉N系殘基。這類回復(fù)突變的抗體也包括在本發(fā)明中。
另一種類型的框架修飾包括在框架區(qū)內(nèi)，或甚至在一個或多個⑶R區(qū)內(nèi)突變一個或多個殘基，以便除去T細胞表位，由此減弱抗體的潛在免疫原性。這種方法也稱作“去免疫”并在Carr等的美國專利公開20030153043中作進一步描述。
除了在框架或⑶R區(qū)內(nèi)制作的修飾之外或備選地，可以對本發(fā)明抗體進行改造以便在Fe區(qū)內(nèi)包括修飾，一般地以改變抗體的一種或多種功能特性，例如血清半衰期，補體結(jié)合，F(xiàn)e受體結(jié)合，和/或抗原依賴型細胞毒性。另外，可以對本發(fā)明抗體進行化學(xué)修飾(例如，可以將一個或多個化學(xué)部分附著在抗體上)或進行修飾以便改變其糖基化，再來改變抗體的一種或多種功能特性。下面進一步詳述這些實施方案中的每一種。Fe區(qū)的殘基編號是Kabat的EU索引的編號。
在一個實施方案中，對CHl的鉸鏈區(qū)進行修飾從而改變(例如提高或降低)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。在Bodmer等的美國專利5，677，425中對這一方法作進一步描述。改變CHl的鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目，以便例如促進輕和重鏈的組裝，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。
在另一個實施方案中，對抗體的Fe鉸鏈區(qū)進行突變以便降低抗體的生物學(xué)半衰期。更加具體地，將一個或多個氨基酸突變導(dǎo)入Fe-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)，從而使得抗體相對于天然Fe-鉸鏈結(jié)構(gòu)域SpA結(jié)合具有受損的葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SpA)結(jié)合。在Ward等的美國專利6，165，745中對這一方法 作了進一步詳述。
在另一個實施方案中，對抗體進行修飾以便提高其生物學(xué)半衰期。多種方法是可能的。例如，在授予Ward的美國專利6，277，375中所述，可以導(dǎo)入下列突變中的一種或多種:T252L、T254S、T256F?；蛘?，如在 Presta 等的美國專利 5，869，046 和 6，121，022 中所述為了提高生物學(xué)半衰期，可以在CHl或CL區(qū)內(nèi)改變抗體以便包含取自IgG的Fe區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)內(nèi)的補救(salvage)受體結(jié)合表位。
在又一個實施方案中，可以通過用不同氨基酸殘基替代至少一個氨基酸殘基來改變Fe區(qū)，以便改變抗體的效應(yīng)子功能。例如，可以用不同的氨基酸殘基代替一個或多個氨基酸，從而使得抗體對效應(yīng)子配體具有改變的親和性但保留親本抗體的抗原-結(jié)合能力。對于其親和性改變的效應(yīng)子配體可以是例如Fe受體或補體的Cl組分。在Winter等的美國專利5，624，821和5，648，260中對這一方法作了進一步詳述。
在另一個實施方案中，可以用不同的氨基酸殘基代替選自氨基酸殘基的一個或多個氨基酸，從而使得抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或減弱或消除的補體依賴性細胞毒性(⑶C)。在Idusogie等的美國專利6，194, 551中對這一方法作了進一步詳述。
在另一個實施方案中，改變一個或多個氨基酸殘基，由此改變抗體結(jié)合補體的能力。在Bodmer等的PCT公開文本W(wǎng)094/29351中對這一方法作了進一步描述。
在又一個實施方案中，通過修飾一個或多個氨基酸而修飾Fe區(qū)，以便提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或來提高抗體對Fe y受體的親和性。在Presta的PCT公開文本W(wǎng)000/42072中對這一方法作了進一步描述。另外，已經(jīng)對人IgGl上對Fe YRl，F(xiàn)e Y RII，F(xiàn)e YRIII和FcRn的結(jié)合位點進行作圖并已經(jīng)描述了結(jié)合改善的變體(參見 Shields, R.L.等，2001J.Biol.Chem.276:6591_6604)。具有這類經(jīng)修飾 Fe 區(qū)的抗體在本文組合物的范圍內(nèi)。
在又一個實施 方案中，對抗體糖基化進行修飾。例如，可以制備糖苷化(aglycoslated)的抗體(即缺少糖基化作用的抗體)。例如可以改變糖基化以提高抗體對c-Met靶抗原的親和性。這種糖修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)糖基化作用的一個或多個位點來實現(xiàn)。例如可以進行一個或多個氨基酸取代，其導(dǎo)致一個或多個可變區(qū)讀碼框內(nèi)糖基化作用位點的消除，由此消除該位點上的糖基化作用。這種糖苷化作用(aglycosylation)可以提高抗體對抗原的親和性。在Co等的美國專利5，714，350和6，350, 861中對這種方法作了進一步詳述。
此外或備選地，可以制備具有改變的糖基化類型的抗體，例如具有巖藻糖基殘基數(shù)量減少的hypofucosylated抗體或具有等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化作用模式提高抗體的ADCC活性。這種糖修飾可以通過，例如在具有改變的糖基化作用酶學(xué)機制的宿主細胞中表達抗體來實現(xiàn)。具有改變的糖基化作用機制的細胞已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述并且可以用作宿主細胞，其中表達本發(fā)明重組抗體，由此產(chǎn)生具有改變的糖基化作用的抗體。例如，Hang等的EP1，176，195描述了具有功能被破壞的FUT8基因的細胞系，所述FUT8基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，從而使得在這種細胞中表達的抗體顯示hypofucosylation。Presta的PCT公開文本W(wǎng)003/035835描述了 CHO細胞系變體，Lecl3細胞，其將巖藻糖附著于Asn (297)-連接的糖上的能力減弱，也導(dǎo)致在該宿主細胞中所表達抗體的 hypofucosylation (還參見 Shields, R.L.等，2002, J.Biol.Chem., 277:26733-26740)。Umana等的PCT公開文本W(wǎng)099/54342描述了這樣的細胞系，其經(jīng)改造來表達糖蛋白修飾型糖基轉(zhuǎn)移酶(例如0 (1，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII))，從而使得在經(jīng)改造細胞系中表達的抗體顯示增多的等分GlcNac結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致抗體ADCC活性提高(還參見 Umana 等，1999，Nat.Biotech.，17:176-180)。
本發(fā)明所預(yù)期的抗體的另一種修飾是聚乙二醇化?？梢詫⒖贵w聚乙二醇化，例如以提高抗體的生物學(xué)(例如血清)半衰期。為了對抗體聚乙二醇化，一般在一個或多個PEG基團共價連于抗體或抗體片段上的條件下將抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物)反應(yīng)。聚乙二醇化可以通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水性聚合物)?；磻?yīng)或通過烷化反應(yīng)來實施。本文所用的術(shù)語“聚乙二醇”意在包括已被用來衍生其它蛋白質(zhì)的任何形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二酰亞胺。在某些實施方案中，待聚乙二醇化的抗體是糖苷化的抗體。聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以應(yīng)用于本發(fā)明抗體。參見例如Nishimura等的 EPO154316 和 Ishikawa 等的 EP0401384。
改造抗體的方法
如上面所討論的，具有本文所示VH, Vlj, IgA輕鏈或IgK輕鏈序列的抗c-Met抗體可以通過修飾Vh和/或 '，和/或Ig X輕鏈，和/或Ig K輕鏈序列中的殘基，或通過修飾連接其的恒定區(qū)而改造其它抗c-Met抗體。因而，本發(fā)明另一方面，本發(fā)明抗c-Met抗體的結(jié)構(gòu)特征被用來生成結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗c-Met抗體，其保留本發(fā)明親本拮抗或激動性抗體的至少一種功能特性，例如結(jié)合人c-Met還有抑制c-Met的一種或多種功能特性(例如,誘導(dǎo)內(nèi)在化作用、阻止激活、例如源自信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上調(diào)、預(yù)防或改善細胞增殖，存活，遷移，侵入或形成變化、或者所述抗體抑制c-Met受體結(jié)合，預(yù)防或改善癌癥，例如腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移)，或在激動性的情況下，激活c-Met磷酸化作用以及刺激細胞應(yīng)答，以及本文所提供的功能特性。
例如，如上所討論的，可以將本發(fā)明抗體的一個或多個CDR區(qū)，或其突變與已知框架區(qū)和/或其它CDR重組組合以生成另外的，重組改造的本發(fā)明抗c-Met抗體。其它類型的修飾包括前節(jié)中所述的那些。改造方法用作親本序列的起始材料是本文提供的一個或多個Vh和/或' 序列或其一個或多個⑶R區(qū)。為了生成改造的抗體，不必實際制備(即表達為蛋白質(zhì))具有本文提供的一個或多個Vh和/或\序列，或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。而是，將包含在核苷酸或氨基酸序列中的信息用作本領(lǐng)域已知突變技術(shù)中的起始材料來生成源自起始序列的“二代”序列，隨后制備“二代”核苷酸序列并表達為蛋白質(zhì)。
因此，在某些實 施方案中，本發(fā)明提供制備抗C-Met抗體的方法，所述抗體具有作為起始親本材料的Vh抗體序列和'抗體序列，所述Vh抗體序列具有選自SEQ ID NO:55-72的序列，所述\抗體序列具有選自SEQ ID NO:31-54的序列。該方法包括改變Vh和/或\抗體親本序列內(nèi)至少一個氨基酸殘基以生成至少一種經(jīng)改變的抗體序列；和將所述經(jīng)改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供制備抗c-Met抗體的方法，該抗體包括具有選自SEQ ID NO:77-80的序列的IgA輕鏈抗體序列，并改變Ig入輕鏈抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基以生成至少一種經(jīng)改變的抗體序列；和將所述經(jīng)改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。
在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供制備抗C-Met抗體的方法，該抗體包括具有選自SEQ ID NO:81-84的序列的IgK輕鏈抗體序列，并改變Ig IgK輕鏈抗體序列內(nèi)至少一個氨基酸殘基以生成至少一種經(jīng)改變的抗體序列；和將所述經(jīng)改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。
所述經(jīng)改變的抗體可以顯示本文所討論的功能特性中的一種或更多種，兩種或更多種，或三種或更多種。
可以利用本領(lǐng)域已有的和/或本文所述的標準測定法，例如在實施例中給出的那些(例如ELISA)，來評估所述經(jīng)改變的抗體的功能特性。
在本發(fā)明改造抗體的方法的某些實施方案中，可以在全部或部分抗C-Met抗體編碼序列上隨機或選擇性地導(dǎo)入突變，并且如本文所述可以表達得到的經(jīng)修飾抗c-Met抗體并篩選結(jié)合活性和/或其它功能特性。突變方法已在現(xiàn)有技術(shù)中描述過。例如，Short的PCT公開文本W(wǎng)002/092780描述了利用飽和誘變、合成性連接組裝或其組合來生成和篩選抗體突變的方法?；蛘週azar等的PCT公開文本W(wǎng)003/074679描述了利用計算機篩選法來優(yōu)化抗體的生理化學(xué)特性的方法。
本發(fā)明抗體
下面提供了本發(fā)明抗體的核苷酸和多肽序列。親本或初篩抗體的氨基酸和核苷酸序列分別在表A和表C中提供。與親本抗體相比親和性修飾的抗體的氨基酸和核苷酸序列分別在表B和表D中提供。
表A:親本抗c-Met Fab抗體的重和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列
權(quán)利要求
1.包含對靶蛋白C-Met具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)的分離的人或人源化抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段結(jié)合c-Met。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段以2.0XKT5M或更小，2.0XKT6M或更小，2.0XKT7M或較小，2.0XKT8M或較小以及2.0X KT9M或較小的Kd結(jié)合靶蛋白c-Met。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段對于靶蛋白c-Met具有1.0Χ1(Γ2每秒或較小，1.0Χ1(Γ3每秒或更小，1Χ1(Γ4每秒或更小或1.0X 10_5每秒或更小的解離速率(Ktjff)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段以2.0XKT5M或更小，2.0XKT6M或更小，2.0XKT7M或更小，2.0XKT8M或更小以及2.0X 10_9Μ或更小的Kd結(jié)合靶蛋白c-Met，并抑制HGF結(jié)合c_Met。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其功能性片段，其中所述抗體或其功能性片段結(jié)合靶蛋白c-Met并調(diào)節(jié)c-Met磷酸化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的抗體或其功能性片段，其中激活c-Met磷酸化刺激選自器官再生，傷口愈合和組織再 生的活性中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的抗體或其功能性片段，其中所述器官選自腎、肝、胰、肺、腸、皮膚、胸腺和甲狀腺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體與c-Met的結(jié)合由選自下列多種拮抗性或激動性的測定法中的至少一種測定:配體誘導(dǎo)的c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑酶活性；配體誘導(dǎo)的c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達；配體與c-Met基于電化學(xué)發(fā)光的結(jié)合；配體結(jié)合c_Met的酶聯(lián)免疫吸附測定；和細胞的增殖，存活，遷移或轉(zhuǎn)移。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其功能性片段的分離的抗原結(jié)合區(qū)。
10.分離的核苷酸序列，其選自SEQID NO:1-30、73-76和85-88。
11.由根據(jù)權(quán)利要求10的核苷酸序列編碼的分離的氨基酸序列，以及所述氨基酸序列的保守變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的核苷酸序列，其中SEQID NO:1_20中的每一種都編碼抗原結(jié)合輕鏈。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的核苷酸序列，其中SEQID NO:21-30中的每一種都編碼抗原結(jié)合重鏈。
14.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含由選自SEQID NO:1-20的核苷酸序列編碼的輕鏈。
15.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含由選自SEQID NO:21-30的核苷酸序列編碼的重鏈。
16.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含由選自SEQID NO:1-20的核苷酸序列編碼的輕鏈，和由選自SEQ ID NO:21-30的核苷酸序列編碼的重鏈。
17.選自SEQID NO:31-72、77-84和89-96的分離的氨基酸序列及其保守變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的分離的氨基酸序列，其中SEQID NO:31-54中的每一種都包含抗原結(jié)合輕鏈。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的分離的氨基酸序列，其中SEQID NO:55-72中的每一種都包含抗原結(jié)合重鏈。
20.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含具有選自SEQID NO:31-54的氨基酸序列的輕鏈。
21.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含具有選自SEQID NO:55-72的氨基酸序列的重鏈。
22.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含具有選自SEQID NO:31-54的氨基酸序列的輕鏈及其保守變體，且包含具有選自SEQ ID NO:55-72的氨基酸序列的重鏈及其保守變體。
23.分離的氨基酸序列，其與SEQID勵:31-72、77-84和89-96具有至少50，60，70，.80，90，95 或 99%的同一性。
24.分離的核苷酸序列，其與SEQID NO:1-30、73-76和85-88中所示序列具有至少60，.70，80，90，95 或 99%的同一性。
25.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含由選自SEQID NO:73的核苷酸序列編碼的IgA輕鏈。
26.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含由選自SEQID NO:74-76的核苷酸序列編碼的IgK輕鏈。
27.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含如選自SEQID NO:77-80的氨基酸序列所示的IgA輕鏈。
28.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含如選自SEQID NO:81-84的氨基酸序列所示的IgK輕鏈。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體，其是IgG。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的分離的抗體，其是IgGl,IgG2，IgG3或IgG4。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的分離的抗體，其中所述IgG4由選自SEQID NO:85-88的核苷酸序列編碼。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的分離的抗體，其中所述IgG4由與選自SEQID NO:85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的核苷酸序列編碼。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的分離的抗體，其中所述IgG4如選自SEQID NO:89-96的氨基酸序列及其保守變體所示。
34.一種包含對c-Met表位有特異性的抗原結(jié)合區(qū)的分離的人或人源化抗體或其功能性片段，其中所述抗體或功能性片段結(jié)合細胞上的c-Met表面受體，并預(yù)防或改善癌癥的進行或轉(zhuǎn)移，或預(yù)防或改善炎癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項的分離的抗體或功能性片段，其是Fab或scFv抗體片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的分離的抗體，其是IgG。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的分離的抗體，其是IgGl,IgG2，IgG3或IgG4。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的分離的抗體，其中所述IgG4由選自SEQID NO:85-88的核苷酸序列編碼。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的分離的抗體，其中所述IgG4由與選自SEQID NO:85-88的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的同一性的核苷酸序列編碼。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的分離的抗體，其中所述IgG4包含選自SEQID NO:89-96的氨基酸序列及其保守變體。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項的分離的抗體或功能性片段，其是Fab片段或scFv抗體片段或駱駝科納米抗體。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一項的分離的抗體或其功能性片段，其中所述表位是構(gòu)象表位。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的表位，其中表位包含c-Met細胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的殘基。
44.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的抗體或功能性片段的至少一種，以及可藥用載體或賦形劑。
45.一種轉(zhuǎn)基因動物，其攜帶編碼根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的抗體或其功能性片段的基因。
46.一種治療c-Met相關(guān)病癥或狀況的方法，其包括向需要其的受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求44的藥物組合物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述病癥或狀況是癌癥或炎癥。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述癌癥選自腦癌、胃癌、生殖器癌癥、泌尿器癌癥、前列腺癌、膀胱癌(淺表和肌肉侵入型)、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(包括成膠質(zhì)細胞瘤、間變型星形細胞瘤、少突星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤)、食道癌、胃癌、胃腸癌、肝癌、肝細胞癌(HCC)包括小兒HCC、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌、鼻咽癌)、胡爾特爾細胞癌、上皮癌、皮膚癌、黑素瘤包括惡性黑素瘤，間皮瘤，淋巴瘤，骨髓瘤包括多發(fā)性骨髓瘤、白血病、肺癌包括非小細胞肺癌(包括所有組織學(xué)亞型:腺癌、鱗狀細胞癌、支氣管肺泡癌、大細胞癌和腺鱗癌混合型)、小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌包括遺傳性和偶發(fā)性乳突狀腎細胞癌I型和II型，以及透明細胞腎細胞癌；肉瘤，特別是骨肉瘤、透明細胞肉瘤和軟組織肉瘤(包括肺泡狀和胚胎性橫紋肌肉瘤、肺泡狀柔軟部分肉瘤)；甲狀腺癌(乳突狀和其它亞型)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述癌癥選自肝癌和食道癌。
50.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述方法還包括施用化療劑。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述化療劑是抗癌劑。
52.治療有害細胞的方法，其包括將細胞與根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的抗體或其功能性片段相接觸。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述細胞具有c-Met。
54.根據(jù)權(quán)利要求52或53的方法，還包括用化療劑或放射來處理細胞。
55.根據(jù)權(quán)利要求46-54中任一項的方法，其中在施用或接觸后，該方法還包括觀察癌癥進行或轉(zhuǎn)移的改善或延遲。
56.一種鑒定包含c-Met的細胞的方法，該方法包括將細胞與根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的抗體或抗體片段相接觸，其中所述抗體或片段還包括可檢測標記。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述標記是放射性的，熒光的，磁性的，順磁性的或化學(xué)發(fā)光的標記。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，還包括成像或分離細胞的步驟。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的人抗體或人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體是合成抗體。
60.根據(jù)權(quán)利要求44的藥物組合物，還包括另外的治療劑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的藥物組合物，其中另外的治療劑選自抗癌劑；抗生素；消炎劑；生長因子和細胞因子。
62.一種分離的抗體，其具有第一氨基酸序列，其是選自SEQ ID NO:55-72的重鏈及與選自SEQ ID NO:55-72的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的序列同一性的序列;和第二氨基酸序列，其是選自SEQ ID NO:31-54的輕鏈及與選自SEQ ID NO:31-54的序列具有至少60，70，80，90，95或99%的序列同一性的序列。
63.包含第一組分的免疫綴合物，所述第一組分是根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的抗體或其片段。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的免疫綴合物，其包括具有第二種氨基酸序列的第二組分。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的免疫綴合物，還包括細胞毒素。
66.根據(jù)權(quán)利要求64的免疫綴合物，其中第二序列是對不同于c-Met的靶標具有結(jié)合特異性的結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體。
67.根據(jù)權(quán)利要求64的雙特異性抗體。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的雙特異性抗體，其中結(jié)合特異性不同于c-Met的靶標是癌細胞表面上的腫瘤抗原或腫瘤相關(guān)蛋白。
69.包含根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項的抗體或其片段的試劑盒。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的試劑盒，還包括可藥用載體或賦形劑。
71.根據(jù)權(quán)利要求69的試劑盒，其中所述抗體以單位劑量的形式存在并且還包括向受試者給 藥的使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)合蛋白靶標c-Met，特別是結(jié)合位于c-Met細胞外結(jié)構(gòu)域中的表位的抗體和片段，還提供了所述抗體的使用方法和試劑盒，以及用于治療有害細胞，特別是與c-Met相關(guān)狀況例如癌癥、轉(zhuǎn)移或炎癥相關(guān)聯(lián)的細胞的方法。
文檔編號A61P35/00GK103183738SQ20131007300
公開日2013年7月3日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者D·R·斯托弗, J·普拉斯勒, C·博格爾, B·布洛克斯 申請人:諾瓦提斯公司