含有血紅蛋白的脂質(zhì)體及其制造方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種確保血紅蛋白的高封入率并且物理穩(wěn)定性及生物體內(nèi)穩(wěn)定性優(yōu)異的、具有特定的膜組成的、含有血紅蛋白的脂質(zhì)體及其制造方法。所述含有血紅蛋白的脂質(zhì)體中，作為脂質(zhì)體的內(nèi)液，含有血紅蛋白溶液，該脂質(zhì)體的膜由磷脂、膽固醇及高級(jí)飽和脂肪酸的混合脂質(zhì)構(gòu)成，并且所述膽固醇/磷脂的摩爾比為0.7～1.0，所述混合脂質(zhì)中的硬脂酸的含有率為25～30摩爾%。優(yōu)選所述脂質(zhì)體的膜還含有相對(duì)膜構(gòu)成脂質(zhì)的總量為0.8摩爾%以上的聚乙二醇結(jié)合磷脂，該聚乙二醇結(jié)合磷脂結(jié)合至所述膜的外表面。
【專(zhuān)利說(shuō)明】含有血紅蛋白的脂質(zhì)體及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明特別涉及一種確保血紅蛋白的高封入率并且物理穩(wěn)定性及生物體內(nèi)穩(wěn)定性優(yōu)異的、含有血紅蛋白的脂質(zhì)體及其制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]針對(duì)作為擔(dān)負(fù)人工氧運(yùn)送體的氧運(yùn)送的物質(zhì)使用來(lái)自紅細(xì)胞的血紅蛋白的方法，已經(jīng)進(jìn)行了研究，但已知血紅蛋白單體欠缺在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性，另外，由于其毒性作用故而成為多種組織損傷的原因，因此雖然一直在嘗試使用對(duì)血紅蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾以使其穩(wěn)定化的分子，但尚未解決這些問(wèn)題點(diǎn)。
[0003]另一方面，對(duì)于在脂質(zhì)體內(nèi)封入了血紅蛋白的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體而言，在血紅蛋白被封入小胞體內(nèi)的這一方面，模擬了紅細(xì)胞的構(gòu)造，認(rèn)為其可能避免血紅蛋白的毒性作用，已在進(jìn)行將其作為人工氧運(yùn)送體的研究。
[0004]關(guān)于含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，迄今為止，雖然公開(kāi)了用于將血紅蛋白以高收率封入脂質(zhì)體內(nèi)的、膜成分的構(gòu)成(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I)、制造方法(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)2)，但是，針對(duì)將脂質(zhì)體膜(該脂質(zhì)體膜能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)下述條件:在維持血紅蛋白的高收率的同時(shí)，還確保脂質(zhì)體在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性，不使通過(guò)將血紅蛋白封入小胞體內(nèi)而獲得的脂質(zhì)體化的意義喪失)的構(gòu)成成分的含量比例、與平均粒徑、血紅蛋白/脂質(zhì)的比例這類(lèi)物理化學(xué)性質(zhì)組合、并進(jìn)行適當(dāng)設(shè)計(jì)的研究尚不充分。
[0005]制備含有血紅蛋白的脂質(zhì)體時(shí)，為了在防止作為蛋白質(zhì)的血紅蛋白變性的同時(shí)將其封入脂質(zhì)體內(nèi)，需要低溫條件下的乳化處理。對(duì)于作為脂質(zhì)體膜的構(gòu)成材料通常使用的磷脂，與生物膜的相似性高、對(duì)生物體的親和性高，特別是由飽和脂肪酸構(gòu)成的磷脂可作為能安全使用的物質(zhì)被應(yīng)用于醫(yī)藥品，但為飽和磷脂的情況下，相轉(zhuǎn)移溫度高，難于在低溫下形成脂質(zhì)體。
[0006]另一方面，發(fā)現(xiàn)通過(guò)向飽和磷脂中配合膽固醇，相轉(zhuǎn)移溫度的分布發(fā)生變化，進(jìn)而通過(guò)配合脂肪酸，即使在低溫的乳化條件下也能將血紅蛋白摻入脂質(zhì)體內(nèi)，但是也公開(kāi)了如果脂肪酸的量增加過(guò)度則脂質(zhì)體自身將不穩(wěn)定(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。
[0007]因此，要求以能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)血紅蛋白的收率及脂質(zhì)體的穩(wěn)定性兩者的比例進(jìn)行配合，但是，即使在作為脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性足夠高的條件下，在生物體內(nèi)，由于與生物體成分的相互作用，存在血紅蛋白漏出(leak)的可能性。血液中游離的血紅蛋白為少量時(shí)，其與血液中的結(jié)合珠蛋白(haptoglobin)結(jié)合，被運(yùn)送至肝臟而被處理，因此對(duì)生物體造成不良影響的可能性較低，但是超過(guò)了其處理量的情況下，血液中將存在游離狀態(tài)的血紅蛋白。血液中珠結(jié)合蛋白的量的幅度相當(dāng)大，難于對(duì)可處理的量進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)定，但是上述脂肪酸(硬脂酸)的配合量比例為35摩爾％以上時(shí)，就認(rèn)為血漿中的血紅蛋白濃度有可能超過(guò)該可處理的濃度范圍。血紅蛋白濃度超過(guò)該可處理的量的范圍的情況下，血漿中將存在游離的血紅蛋白，該血紅蛋白比較容易 分解成2聚體，雖然分解的二聚體在腎小管中被過(guò)濾、排泄進(jìn)尿中，但是已知在血紅蛋白大量漏出的情況下其積蓄在腎小管中、造成毒性影響。進(jìn)而還認(rèn)為:血紅蛋白從血管內(nèi)皮細(xì)胞的間隙漏出到血管外，其容易結(jié)合并捕捉血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的緊張、松弛狀態(tài)的因子一氧化氮(NO)，使得血管平滑細(xì)胞收縮。對(duì)血紅蛋白進(jìn)行了化學(xué)修飾的類(lèi)型的人工氧運(yùn)送體中，作為副作用而成為問(wèn)題的血管收縮以及對(duì)心肌的影響被認(rèn)為與該現(xiàn)象相關(guān)，避免該現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)于將血紅蛋白囊泡(capsule)化這樣的構(gòu)思而言是最重要的問(wèn)題，血紅蛋白從囊泡的漏出將有可能危及該構(gòu)思本身。
[0008]另外，特別是在脂肪酸含量增加的情況下，脂肪酸的特性導(dǎo)致脂質(zhì)體的表面電荷傾向于為陰性，結(jié)果導(dǎo)致產(chǎn)生下述問(wèn)題:補(bǔ)體系統(tǒng)容易活化、生物體內(nèi)脂質(zhì)體不穩(wěn)定性、生物體內(nèi)壽命縮短。
[0009]另外，對(duì)于盡量高效地將物質(zhì)內(nèi)封進(jìn)脂質(zhì)體而言，增大平均粒徑、相對(duì)地使脂質(zhì)體膜變薄，即，盡量減少相對(duì)于血紅蛋白的脂質(zhì)的含量比例是有效的，但另一方面，增大粒徑促進(jìn)向生物體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的摻入，導(dǎo)致血液中的壽命縮短(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)I~2)。另外，通過(guò)增大粒徑，相對(duì)而言，相對(duì)于摻入到內(nèi)部水相中的物質(zhì)而言，膜脂質(zhì)成分的含量相對(duì)變小，內(nèi)部水相中存在的有效成分(即，在含有血紅蛋白的脂質(zhì)體中，該有效成分為血紅蛋白)被給予生物體內(nèi)的情況下，從能減少給予生物體的脂質(zhì)體膜脂質(zhì)的負(fù)荷量這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，具有安全性方面的優(yōu)點(diǎn)。而另一方面，在包含具有能在低溫下乳化的溫度特性的脂質(zhì)膜成分的脂質(zhì)體中，增大粒徑、使得膜相對(duì)變薄的話，僅此就使得脂質(zhì)體自身物理性脆弱、不穩(wěn)定，特別是在生物體內(nèi)，還有血紅蛋白容易發(fā)生漏出的問(wèn)題。
[0010]另外，對(duì)于脂質(zhì)體，已知通過(guò)向脂質(zhì)體膜表面導(dǎo)入聚乙二醇(PEG)結(jié)合磷脂這樣的親水性高分子構(gòu)造，能使得生物體內(nèi)的穩(wěn)定性提高(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)3)，對(duì)于含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，作為避免血漿中脂質(zhì)體凝集、避免因給予脂質(zhì)體而導(dǎo)致的生物體反應(yīng)的手段，也同樣公開(kāi)了通過(guò)聚乙二醇結(jié)合磷脂來(lái)修飾脂質(zhì)體膜表面的方法，但是尚未有考慮了前述為兼具高收率和生物體內(nèi)穩(wěn)定 性的要件而進(jìn)行的研究。
[0011]作為防止利用上述脂質(zhì)體的補(bǔ)體系統(tǒng)活化、防止向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的摻入促進(jìn)的有效手段，已知通過(guò)聚乙二醇這樣的親水性高分子修飾脂質(zhì)體的膜的方法，雖然公開(kāi)了通過(guò)聚乙二醇結(jié)合磷脂僅修飾脂質(zhì)體膜表面的方法，但是，在前述為了達(dá)成高收率使得脂肪酸的配合量增加的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體中，為了使其膜表面的陰性電荷成為中性狀態(tài)(此時(shí)補(bǔ)體系統(tǒng)難于發(fā)生活化)(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)而必要的條件尚屬未知。
[0012]另外，關(guān)于聚乙二醇結(jié)合磷脂的向脂質(zhì)體膜表面的導(dǎo)入量，依賴(lài)于添加量，向膜的導(dǎo)入量也有所增加，但是并非單純地添加量越多越好，過(guò)量添加導(dǎo)致游離狀態(tài)的、聚乙二醇結(jié)合磷脂的比例增加。有報(bào)道指出，聚乙二醇結(jié)合磷脂自身是通過(guò)兩親性媒介的性狀保持界面活性效果的物質(zhì)，其以高濃度以游離狀態(tài)存在時(shí)，導(dǎo)致脂質(zhì)體等內(nèi)封物質(zhì)漏出(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，另外還有報(bào)道指出聚乙二醇結(jié)合磷脂向脂質(zhì)體膜的導(dǎo)入量有可能影響內(nèi)封物質(zhì)的漏出(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)，進(jìn)而，如果使聚乙二醇結(jié)合磷脂添加量增加的話，則在制造工藝中對(duì)聚乙二醇結(jié)合磷脂進(jìn)行導(dǎo)入處理時(shí)，還存在脂質(zhì)體膜容易不穩(wěn)定化的問(wèn)題。
[0013]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第03/015753號(hào)公報(bào)
[0014]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2005-2055號(hào)公報(bào)
[0015]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)平2-148515號(hào)公報(bào)
[0016]非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1:1shida O 等，Size-dependent exravasation and interstitiallocalization of polyethyleneglycoI liposomes in solid tumor-bearing mice.1nt JPharmacol1999;190:49-56
【權(quán)利要求】
1.一種含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體含有血紅蛋白溶液作為脂質(zhì)體的內(nèi)液，所述脂質(zhì)體的膜由磷脂、膽固醇、高級(jí)飽和脂肪酸及聚乙二醇結(jié)合磷脂的混合脂質(zhì)構(gòu)成，并且所述膽固醇/磷脂的摩爾比為0.7~1.0，所述混合脂質(zhì)中的硬脂酸的含有比例為25~30摩爾％，相對(duì)于膜構(gòu)成脂質(zhì)總量，聚乙二醇結(jié)合磷脂的量為0.8~1.1摩爾％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體的膜中，所述聚乙二醇結(jié)合磷脂結(jié)合至所述膜的外表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，其中，所述含有血紅蛋白的脂質(zhì)體的平均粒徑為200~250nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，其中，血紅蛋白/所述混合脂質(zhì)(質(zhì)量比)為1.1~1.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體，其中，Zeta電位為OmV以上。
6.一種制造權(quán)利要求1~ 5中任一項(xiàng)所述的含有血紅蛋白的脂質(zhì)體的方法。
【文檔編號(hào)】A61K47/24GK103796668SQ201280045275
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月28日
【發(fā)明者】金田伸一, 后藤博, 上田努, 石塚隆伸, 本山慎二 申請(qǐng)人:泰爾茂株式會(huì)社