止血組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及粉末形式的止血組合物，其包含原纖維型的膠原，所述膠原包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原的含量，和至少一種單糖，以及任選地至少一種選自凝血因子和糖胺聚糖的化合物。本發(fā)明還涉及用于制備這類組合物的方法，和涉及包含這類組合物和噴霧設(shè)備的單元。
【專利說(shuō)明】止血組合物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及止血組合物的領(lǐng)域，涉及具體化合物或組合物作為止血?jiǎng)┑挠猛?，涉及用于制備止血組合物的方法，和涉及止血的方法。
技術(shù)背景
[0002]傷口，無(wú)論是在外部還是內(nèi)部，創(chuàng)傷還是外科手術(shù)所致的，都經(jīng)常導(dǎo)致流血。這類流血可大致是顯著的。流血是通過(guò)一組稱作“止血”的生理現(xiàn)象而被預(yù)防和停止。止血幫助修復(fù)血管破損和在一般情況下，確保維持脈管和組織完整性。[0003]當(dāng)血管受傷時(shí)，會(huì)觸發(fā)一個(gè)包含多個(gè)階段的天然機(jī)制以阻止血流。首先，血管收縮(vasoconstriction),其使得流血減速,持續(xù)15到60秒并誘導(dǎo)復(fù)雜級(jí)聯(lián)的反應(yīng)。在血小板血栓(platelet plug)周圍形成由纖維蛋白(fibrin)構(gòu)成的纖維網(wǎng)狀物(fibrousmesh):最終的血栓形成并受保護(hù)以防被第十三因子(factor XIII)中途溶解，這穩(wěn)定化了纖維蛋白。最后，纖維蛋白網(wǎng)狀物收緊(縮進(jìn)(retraction))，且傷口的邊緣匯聚:傷口收縮。在穩(wěn)定、交聯(lián)的纖維蛋白內(nèi)，成纖維細(xì)胞可以隨即生長(zhǎng)并組織成為血栓中的連接的基質(zhì)(conjunctive matrix),并最終封閉傷口。
[0004]在循環(huán)的血液中不存在固體纖維蛋白；如果存在，其會(huì)立即堵塞至關(guān)重要的血管。然而，纖維蛋白的前體，纖維蛋白原(fibrinogen)是存在的。在凝血酶(thrombin)的作用下，纖維蛋白原被轉(zhuǎn)化為可溶性的纖維蛋白，其中所述凝血酶的合成由凝血因子活化。
[0005]最后,在傷口成功愈合后的幾天或幾周，纖維蛋白簇(fibrin cluster)在血纖蛋白溶解期間被破壞。
[0006]盡管存在該生物化學(xué)現(xiàn)象，但是，經(jīng)常，特別是在傷口太大或是彌漫性出血(diffuse bleeding)的情況下,有必要“人工”進(jìn)行止血。
[0007]存在幫助獲得止血的“機(jī)械性”解決方案，如按壓、繃帶(ligature)、和電凝法(electrocoagulation),其用于一線治療。然而，在某些情況下這些解決方案效果很小或沒(méi)有效果，如滲出性毛細(xì)血管出血(oozing capillary hemorrhages);多血管器官(hypervascularized organ)如脾或肝的出血；導(dǎo)致彌漫性流血的出血,如骨，和/或在神經(jīng)外科(neurosurgery)中。
[0008]還存在“化學(xué)的”解決方案，特別是在某些現(xiàn)有止血產(chǎn)品中實(shí)現(xiàn)的。所述化學(xué)解決方案的組分通常是“吸收性”或“活性”類型的。
[0009]吸收性止血產(chǎn)品，特別地包括多糖如再生氧化纖維素(regenerated oxidizedcellulose)或藻酸鹽(alginates),主要通過(guò)機(jī)械作用和簡(jiǎn)單吸收而實(shí)現(xiàn)功能。它們經(jīng)常呈現(xiàn)過(guò)度泡脹的問(wèn)題。如果所述泡脹導(dǎo)致液體，特別是血液，的迅速吸收，則當(dāng)用于“封閉的”環(huán)境時(shí)其會(huì)導(dǎo)致不合意的壓力，所述封閉的環(huán)境例如與硬膜(dura mater)接觸或在泌尿外科(urology)中。
[0010]此外，某些產(chǎn)品，特別是包含植物多糖如纖維素或藻酸鹽的那些產(chǎn)品，還可能在它們的再吸收(resorption)期間造成炎性反應(yīng)和/或可以導(dǎo)致宿主不能識(shí)別的降解產(chǎn)物。其結(jié)果是，將這類產(chǎn)物去除以使得它們不留存在體內(nèi)且因此不產(chǎn)生這些不良效果是合意的。[0011 ] 活性止血產(chǎn)品，如含有凝血酶或纖維蛋白的產(chǎn)品，經(jīng)常是衍生自血液的產(chǎn)品。這類產(chǎn)品牽涉變應(yīng)反應(yīng)和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在疾病載體不會(huì)被傳統(tǒng)施用的處理所滅活的情況中。此外，所述下游處理一般是復(fù)雜和/或昂貴的。最后，它們?cè)谑褂们耙话阈枰獪?zhǔn)備，在緊急情況下其可以是限制性的，并且的確很麻煩。
[0012]此外，既含有纖維蛋白也含有凝血酶的產(chǎn)品的作用模式基于在產(chǎn)品中所包含的兩種衍生自血液的產(chǎn)物之間的相互作用。偶爾反應(yīng)可以不與血液相互作用而發(fā)生，在這種情況中所述產(chǎn)物被稱作漂浮的(float)。換句話說(shuō)，所述產(chǎn)物被血液推開(kāi)且血液繼續(xù)流動(dòng)，可能造成產(chǎn)物稀釋或在血液的頂端凝結(jié)并形成膠體，在這種情況下血液的流動(dòng)不受阻斷。因此止血沒(méi)有達(dá)成。
[0013]現(xiàn)在在市場(chǎng)上可以獲得的產(chǎn)品可以是以下面的形式:
[0014]-海綿(sponge)或基質(zhì):該物理形式有助于操作，但是在復(fù)雜的區(qū)域中使用或在腹腔鏡手術(shù)(laparoscopic application)中使用可能是有問(wèn)題的，
[0015]-纖維:該形式可以容易地置于待治療的區(qū)域，如果該區(qū)域是可到達(dá)的話，且可以減少待植入的產(chǎn)品的量；另一方面，其對(duì)于血管是強(qiáng)烈禁忌的(stronglycontraindictated),尤其是要避免纖維進(jìn)入循環(huán)中，因?yàn)檫@類情形會(huì)帶來(lái)栓塞(embolism)的風(fēng)險(xiǎn)，以及粘附在器材上的風(fēng)險(xiǎn)，
[0016]-固化的液體，如生物粘合劑:這類組合物經(jīng)常包含至少兩種產(chǎn)品，其準(zhǔn)備期間混合在一起以進(jìn)行反應(yīng)和聚合。一般所述產(chǎn)品必需在使用前，特別是在手術(shù)室中制備，這使得它們的制備冗長(zhǎng)且需要能夠預(yù)期到它們的使用。
[0017]-噴霧劑:粘合劑可以以噴霧劑的形式，其需要使用特別的設(shè)備以供將注射器連接至提供氣體的設(shè)備，所述氣體對(duì)于推動(dòng)產(chǎn)品是必需的。劑量、分配的同質(zhì)性和/或所堆積的層的厚度是很難調(diào)控或不可能調(diào)控的。
[0018]-粉末:一些由淀粉制成的粉末是市場(chǎng)上可獲得的。粉末對(duì)血液的吸收使得實(shí)現(xiàn)止血粉末。淀粉對(duì)血液沒(méi)有任何生物特性。該粉末的密度和粒度(大小等級(jí))非常小，且粉末在沒(méi)有形成云霧(cloud)的情況下不能噴霧，這不適于腹腔鏡手術(shù)。例如，在W02005/072700中描述的粉末不適于在傷口上均質(zhì)和精確的噴霧，尤其是在腹腔鏡中。
[0019]現(xiàn)有技術(shù)的組合物一般都是以海綿、纖維、或粘稠液體的形式提供的，如纖維蛋白粘合劑，其可以噴霧。然而，現(xiàn)在無(wú)法獲得適于噴霧的粉末。
[0020]因此本發(fā)明的目的是獲得解決以上所提到的所有或一些問(wèn)題的組合物，且特別是在安全性、有效性、易用性和/或成本方面令人滿意的組合物。具體地，所述產(chǎn)品或組合物可以滿足每個(gè)國(guó)家施行的管制性批準(zhǔn)(regulatory approval)。
[0021]更加精確地，本發(fā)明目的在于獲得組合物，其具有令人滿意的吸收能力、良好的止血能力、最小的不良效果(或沒(méi)有不良效果)、良好的錨定(anchor)在傷口邊緣的能力和用于噴霧的可能性、當(dāng)噴霧時(shí)令人滿意的對(duì)血流的穿透、和/或有限的泡脹。
[0022]具體地，所述組合物目的在于能夠在多數(shù)外科手術(shù)步驟中施用，如剖腹手術(shù)(laparotomy)、腹腔鏡、體腔鏡(coelioscopy)和自動(dòng)外科手術(shù)技術(shù)(robotic surgicaltechnique)、和/或可以噴霧。所述組合物及其代謝物優(yōu)選具有令人滿意的無(wú)害性，具有改進(jìn)的安全性，造成較弱的免疫應(yīng)答或沒(méi)有免疫應(yīng)答，不具致癌性，和/或可再吸收。具體地，再吸收是與止血和愈合的現(xiàn)象相容的，以便能在所述過(guò)程之后留在原位。
[0023]組合物的目標(biāo)還可以是以可以噴霧的形式提供。
[0024]除了解決以上提到的所有或一些問(wèn)題之外，本發(fā)明的目的還可以是獲得下述組合物:
[0025]-使得可獲得產(chǎn)品，特別是包含對(duì)止血作用有用的所有組分的干燥、可噴霧的粉末，特別是在儲(chǔ)藏期間，換句話說(shuō)，以隨時(shí)可用的形式儲(chǔ)藏且在使用前不需要混合的產(chǎn)品，和/或
[0026]-其主要組分或其組分不會(huì)吸收過(guò)多的血液以至存在不合意的壓力的風(fēng)險(xiǎn)，和/或
[0027]-其組分同時(shí)具有止血、機(jī)械和生物化學(xué)、或生物活性，和/或
[0028]-其可以無(wú)需準(zhǔn)備、無(wú)需處理止血產(chǎn)品而立即使用，且其可以例如在腹腔鏡以及在剖腹手術(shù)中使用。
[0029]發(fā)明概述
[0030]根據(jù)第一個(gè)方面,本發(fā)明涉及止血組合物,其包含或構(gòu)成為(constituted of):
[0031]-膠原，其包含重量按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，其是原纖維類型的膠原，
[0032]-至少一種單糖，和
[0033]-任選地，至少一種選自下組的化合物
[0034]〇凝血因子(coagulation factors),特別是凝血酶,其可以特別地來(lái)自血液或通過(guò)生物技術(shù)方法獲得，和
[0035]〇糖胺聚糖(glycosaminoglycans),特別是硫酸軟骨素(chondroitinsulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)及其混合物。
[0036]優(yōu)選地，提出了粉末形式的止血組合物，其包含原纖維類型的膠原，所述原纖維類型的膠原包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)的至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原的含量，以及至少一種單糖。
[0037]本發(fā)明可以具體使得可獲得組合物，其具有特別好的止血特性，同時(shí)產(chǎn)生有限的泡脹，所述止血特性具體是由于所述組合物的大小和/或顆粒的密度的特征以及是由于其組分。
[0038]根據(jù)一種變化，所述組合物不含從血液中直接或間接獲得的組分。例如當(dāng)存在凝血酶時(shí)，其可以是從血液中提取的或是重組凝血酶。非常具體地，組合物構(gòu)成為(isconstituted of)在體內(nèi)迅速降解的和/或生物相容的化合物,換句話說(shuō),其不誘導(dǎo)不合意的應(yīng)答。
[0039]組合物的優(yōu)選但不受限制的， 單獨(dú)或組合的方面為下述:
[0040]-組合物包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)80%至90%范圍的膠原含量。
[0041]-組合物包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)1%至12.5%范圍的單糖含量。
[0042]-組合物包含重量比值范圍為10至50,優(yōu)選19的膠原/單糖。
[0043]-膠原包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)的從85%至95%范圍的纖維膠原和/或原纖維膠原含量。
[0044]-組合物還包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從2%至25%范圍的糖胺聚糖含量。
[0045]-組合物還包含重量比值范圍為從2至40的膠原/總糖化合物，其中總糖化合物的重量是單糖的重量和糖胺聚糖重量之和。
[0046]-組合物還包含凝血因子，特別是凝血酶，其量的范圍為從組合物的0.01IU/mg至20IU/mg。
[0047]-組合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。
[0048]-組合物包含按重量計(jì)至少50%的大小在200μ m和400 μ m之間的顆粒。 [0049]-權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的組合物，其包含
[0050]〇膠原,其量按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為86.36%,
[0051]〇葡萄糖，其量按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為4.54%,
[0052]〇硫酸軟骨素，其量按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為9.09%ο
[0053]-組合物還包含凝血酶,其量為組合物的0.2IU/mg至2IU/mg。
[0054]根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于制備止血組合物的方法，其至少包括下述步驟:
[0055]a)形成包含原纖維類型的膠原的水性懸液，所述原纖維類型的膠原具有重量按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原含量，以及至少一種單糖，其中在該步驟中使用的膠原優(yōu)選通過(guò)堿性提取獲得；
[0056]b)以沉淀、糊或凝膠的形式回收產(chǎn)物，特別是通過(guò)離心或傾析，
[0057]b)干燥產(chǎn)物，
[0058]c)將產(chǎn)物研磨至合意的粒度。
[0059]這種方法可以包括步驟d)之后的步驟e)，其包括添加選自下組的化合物:
[0060]-凝血因子，特別是凝血酶，和
[0061]-糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸及其混合物。
[0062]本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含以上描述的組合物和適于容納和推進(jìn)這類組合物的噴霧設(shè)備。
[0063]附圖簡(jiǎn)述
[0064]其它本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)將從以下描述而變得清楚，所述描述僅作為例示性的目的給出且絕非限制性，且應(yīng)該參考所附的附圖而解讀，其中圖1是如在實(shí)施例13中所描述的電泳結(jié)果的實(shí)例。
[0065]發(fā)明詳述
[0066]在下述描述中，在沒(méi)有相反的陳述的情況下，重量百分?jǐn)?shù)是按相對(duì)于組合物的總干重計(jì)而給出的。
[0067]在本發(fā)明的語(yǔ)境中，“組合物的總干重”指沒(méi)有溶劑，特別是水的組合物的總重量，且因此是相對(duì)于無(wú)水產(chǎn)品的總重量。
[0068]此外，組分的重量和所得的百分?jǐn)?shù)可以對(duì)應(yīng)于這些組分的無(wú)水重量，換句話說(shuō)，當(dāng)組分可以含有水時(shí)，組分不包括水的重量。這也可適用于所獲得的百分?jǐn)?shù)。
[0069]組合物可以包含按相對(duì)于組合物的總重量的總量計(jì)大于或等于70%的膠原含量，特別是按重量計(jì)大于或等于75%，特別是大于或等于77%，事實(shí)上大于或等于80%。
[0070]此外，組合物可以包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)小于或等于99%的膠原含量，特別是按重量計(jì)小于或等于96%，特別是小于或等于93%，事實(shí)上小于或等于90%。
[0071]因此，組合物可以包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從70%至99%范圍的膠原含量，特別是按重量計(jì)從75%至96%范圍，特別是從77%至93%范圍，事實(shí)上從80%至90%范圍。優(yōu)選地，膠原的含量是按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)約86%。
[0072]膠原是哺乳動(dòng)物中的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。膠原由原膠原(tropocollagen, TC)分子組成，所述原膠原分子具有大約280-300nm的長(zhǎng)度和大約1.5nm的直徑。
[0073]術(shù)語(yǔ)“纖維膠原”指代纖維形式的膠原，對(duì)應(yīng)于原纖維的集合(assembly offibrils)。纖維一般具有范圍為從Iym至10 μπι的直徑。術(shù)語(yǔ)“原纖維膠原”指代原纖維形式的膠原。更精確地，原纖維一般具有IOnm至I μπι的直徑。因此，原纖維是由原膠原分子的交錯(cuò)的陣列(staggered array)形成的，且這些原纖維可以排列以形成膠原纖維。纖維和/或原纖維膠原一般是不可溶的，而非原纖維膠原是高度可溶的。
[0074]纖維膠原和原纖維膠原的定義可以具體是由Markus Buehler在“Nature designstough collagen:explaining the nanostructure of collagen fibrils,，，in PNAS, Augustl5, 2006, vol.103, n0.33, pp.12285-12290 中所給出的。
[0075]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多于28種不同的膠原，其可以分類為3個(gè)主要類別:原纖維類型的膠原(collagens of the fibrillar type)、非原纖維類型的膠原(collagens of thenon-fibrilIar type)、和 FACIT 膠原。
[0076]原纖維類型的膠原是大部分包含原纖維和/或纖維膠原且?guī)缀醪话窃w維膠原的膠原(例如I型膠原)。 相似地，非原纖維類型的膠原是大部分包含非原纖維膠原的膠原。一些非原纖維類型的膠原可僅包含非原纖維膠原(consist only in)(例如IV型或V型膠原)。
[0077]膠原的工業(yè)提取和純化一般包括(consists in)將初始組織(initial tissues)去結(jié)構(gòu)化(destructuration)以I)去除所有或大多數(shù)雜質(zhì)蛋白質(zhì),和2)取決于產(chǎn)品的最終用途而獲得所需的結(jié)構(gòu)化(structuration)水平。膠原提取一般在酸性或堿性條件中進(jìn)行以允許將非原纖維的單分子可溶性膠原溶解。最終膠原自然含有纖維/原纖維膠原和非原纖維膠原的混合物。原纖維/纖維膠原和非原纖維膠原之間的比例取決于所挑選的用于提取的組織和提取工藝。
[0078]最終產(chǎn)物不同于通過(guò)將僅原纖維膠原和僅非原纖維膠原人工混合而獲得的膠原。在標(biāo)題為“Extraction of collagen from connective tissue by neutral saltsolutions” (Proceedings of the NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES Volume 41 Number IJanuary 15,1955 by Jerome Gross, John H.Highberger and Francis 0.Schmitt)的文獻(xiàn)中，顯示了在具體的提取工藝之后獲得的原纖維和非原纖維膠原之間的區(qū)別，所述提取工藝-如前文所描述-導(dǎo)致了這兩種膠原的混合物。
[0079]在本發(fā)明的組合物中，膠原是原纖維類型的，且包含其量為按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)至少60%的纖維和/或原纖維膠原，特別是按重量計(jì)至少70%，特別是至少75%，實(shí)際上至少80%。
[0080]更具體地，膠原包含按相對(duì)于組合物中膠原的總重量的重量計(jì)至少85%，特別是至少90%，特別是至少95%，實(shí)際上至少98%的纖維和/或原纖維膠原。
[0081 ] 優(yōu)選組合物包含按相對(duì)于組合物中膠原的總重量的重量計(jì)從85%至95%范圍的纖維和/或原纖維膠原的含量，且最優(yōu)選按重量計(jì)從85%至90%。
[0082]這意指在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物因此包含按相對(duì)于組合物中膠原的總重量的重量計(jì)從5%至15%范圍的非原纖維膠原的含量，且最優(yōu)選按重量計(jì)從10%至15%。
[0083]具有纖維和/或原纖維膠原相對(duì)于非原纖維膠原的這種比值的組合物是非常有利的，特別是用作止血粉末。事實(shí)上，纖維和/或原纖維膠原應(yīng)以足夠以進(jìn)行止血的量存在，而非原纖維膠原也應(yīng)為足以用于產(chǎn)品的粘著(cohesion)的量，且不應(yīng)為太大量以避免過(guò)度的泡脹。
[0084]膠原可以選自I型膠原或I型和III型膠原。膠原可以從多種源組織中提取，特別是來(lái)自所有物種，特別是豬、牛、或馬物種的皮膚和/或腱。 [0085]膠原可以大部分由源自豬、從皮膚和/或腱提取的纖維膠原制得。在膠原從腱提取的情況中，提取可以是如在國(guó)際申請(qǐng)W02010/125086中所描述的。
[0086]前述的膠原，特別是纖維膠原和/或原纖維膠原，可以來(lái)自酸性或堿性提取。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，所述膠原來(lái)自堿性提取。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，膠原可以是如在專利申請(qǐng)F(tuán)R2944706中所描述的。
[0087]優(yōu)選地，膠原來(lái)自堿性提取，其使得能夠在提取的膠原中最大化纖維和/或原纖維膠原的含量。此外，可以優(yōu)化這類堿性提取以控制提取的膠原中的原纖維/纖維膠原和非原纖維膠原的比例。與酸性提取不同，堿性提取允許對(duì)蛋白聚糖的水解。該作用導(dǎo)致組織的去結(jié)構(gòu)化并在不改變纖維形狀的前提下將其分離。在酸性條件中，纖維中內(nèi)部膠原分子的膨脹導(dǎo)致其在工藝中的部分去結(jié)構(gòu)化，其釋放更大量的非原纖維可溶性膠原。
[0088]可以將膠原交聯(lián)，特別是通過(guò)經(jīng)典的交聯(lián)模式如熱脫水；使用橋聯(lián)劑(bridgingagents)，例如甲醛和/或戊二醛；通過(guò)氧化的多糖，如根據(jù)在國(guó)際專利申請(qǐng)W02010/125086中所描述的方法；和/或通過(guò)氧化的支鏈淀粉(amylopectins)或糖原。
[0089]組合物包含至少一種單糖，其單獨(dú)存在或與其它單糖形成混合物。所述單糖可以選自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。存在于本發(fā)明的組合物中、單獨(dú)存在或是與單糖形成混合物的單糖，特別地是葡萄糖。
[0090]組合物可以包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從1%至12.5%范圍的單糖含量，特別是按重量計(jì)從1.5%到10%范圍，特別是按重量計(jì)從2%至8%范圍，且相當(dāng)特別的是按重量計(jì)從2.5%至7.5%范圍。最優(yōu)選地，單糖含量按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為約5% ο
[0091]組合物可以包含范圍為從5至100的膠原/單糖重量比值，特別是從7至65，更特別是從10至50，且還更特別是從11至40。最優(yōu)選地，組合物包含約19的膠原/單糖重量比值。
[0092]所述單糖，特別是核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，且特別是葡萄糖，可以特別的使得可能獲得具有合意的特征、主要包含纖維和/或原纖維膠原和單糖的顆粒，所述合意的特征特別地是大小和密度。將單糖組入膠原的混合物中還允許降低組合物中的電荷，這使得能夠形成適于放置在如管、鼓風(fēng)機(jī)(blower)、噴霧罐的容器中的粉末。
[0093]相當(dāng)特別地，單糖的存在使得更容易和/或更便宜地獲得具有合意的密度和/或大小的顆粒，特別是在改進(jìn)組合物的粉末的止血特性方面。
[0094]在沒(méi)有任何添加劑的情況下研磨膠原會(huì)減少纖維的大小和降低粉末的密度。此外，最終制備物含有大量的電荷，其阻止對(duì)最終產(chǎn)品的處理。因此提出在研磨膠原之前添加單糖，其造成待混合的制備物變硬(hardening)允許迅速的研磨(限制變性)，因此使得能夠制備電荷減少(適于將粉末放置于容器中，例如噴霧罐)、且具有適于噴霧組合物的最終密度的粉末。
[0095]與所預(yù)期的不同，這類對(duì)單糖的添加對(duì)于產(chǎn)品的最終活性沒(méi)有作用。特別地，其不改變最終產(chǎn)品的生物活性。單糖沒(méi)有止血效果。
[0096]此外，這類單糖的添加不使得其作為發(fā)泡劑起作用，如在W001/97873中的情況。在TO01/97873中，對(duì)稀釋的溶液加熱導(dǎo)致形成明膠?？梢灾瞥筛邼舛鹊拿髂z以獲得非常濃的溶液，但是最終產(chǎn)品含有明膠而非膠原。已知明膠不如膠原止血性好，因?yàn)檠“寰奂枰嬖谀z原原纖維和天然膠原的結(jié)構(gòu)，這在明膠中是不存在的。
[0097]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，組合物包含，或事實(shí)上組成為顆粒，所述顆粒包含或?qū)嶋H上組成為膠原和單糖，特別是選自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物的糖，特別是葡萄糖。
[0098]組合物可以包含至少一種，特別是一種，凝血因子。所述凝血因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。優(yōu)先地，所述凝血因子是凝血酶。
[0099]所述凝血因子，特別是凝血酶，可以來(lái)自動(dòng)物來(lái)源(從動(dòng)物組織或體液中提取)或來(lái)自重組來(lái)源(通過(guò)培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾細(xì)胞而產(chǎn)生)。所述凝血因子可以例如是從人組織中提取的凝血酶。
[0100]當(dāng)存在凝血因子，特 別是凝血酶時(shí)，其含量可以按組合物的總重量的重量計(jì)小于0.1%。
[0101]在凝血酶的情況中，一般使用國(guó)際單位(international unit, IU)。因此，組合物可以包含從組合物的0.01IU/mg至20IU/mg范圍的凝血酶含量，特別是從0.05IU/mg至10IU/mg,特別是從0.lIU/mg至5IU/mg，特別是從0.2IU/mg至2IU/mg。最優(yōu)選凝血酶的含量-如果有的話-是組合物的約0.83IU/mg。
[0102]除了單糖，組合物還可以包含至少一種其它糖化合物，其可以是糖胺聚糖。這類糖化合物可以是組合物的一部分，所述組合物含或不含凝血因子如凝血酶。
[0103]所述糖胺聚糖可以選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸及其混合物，特別是硫酸軟骨素。
[0104]糖胺聚糖可以使得改進(jìn)粉末吸收血液的速度成為可能。更特別地，糖胺聚糖可以加速血液與止血產(chǎn)品的接觸，特別是與膠原和凝血酶的接觸。
[0105]組合物可以包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從2%至25%范圍的糖胺聚糖含量，特別是按重量計(jì)從3%至20%范圍，特別是按重量計(jì)從4%至15%范圍，相當(dāng)特別的是按重量計(jì)從5%至12.5%范圍。最優(yōu)選糖胺聚糖的含量-如果有的話-是按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)約9%。
[0106]組合物可以包含重量比值為從2.5至50范圍的膠原/糖胺聚糖，特別是從3.5至35，更特別是從5至25，且還更特別是從6.5至20。
[0107]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，組合物包含至少一種，特別是一種單糖以及至少一種，特別是一種，糖胺聚糖，特別是如以上所定義的單糖和糖胺聚糖，且特別是以上面所定義的量。
[0108]糖化合物相當(dāng)特別地是單糖和糖胺聚糖。
[0109]組合物可以包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從2%至25%范圍的糖含量,特別是按重量計(jì)從5%至23%范圍，特別是按重量計(jì)從7%至21%范圍，相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從10%至18%范圍。
[0110]組合物可以包含重量比值為從2至40范圍的膠原/糖，特別是從2.5至30，更特別是從3至20，且還更特別地是從3.5至15。
[0111]表述方法“糖化合物的總重量”指以上所定義的單糖的重量和以上所提到的其它糖化合物的重量之和。
[0112]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明包含或事實(shí)上組成為:
[0113]-膠原，其主要包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，和
[0114]-至少一種，特別是一種，單糖。
[0115]相當(dāng)特別地，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0116]-膠原，其量特別為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從70%至99%范圍，特別是按重量計(jì)從75%至96%范圍，特別是按重量計(jì)從77%至93%范圍，特別是按重量計(jì)從80%至90%范圍，其中所述膠原包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，和
[0117]-至少一種單糖，特別是葡萄糖。其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從1%至12.5%范圍，特別是按重量計(jì)從1.5%至10%范圍，特別是按重量計(jì)從2%至8%范圍，和相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從2.5%至7.5%范圍。
[0118]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0119]-膠原，其主要包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0120]-至少一種，特別是一種，單糖，
[0121]-至少一種，特別是一種，凝血因子。
[0122]相當(dāng)特別地，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0123]-膠原，其量特別地是按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從70%至99%范圍，特別是按重量計(jì)從75%至96%范圍，特別是按重量計(jì)從77%至93%范圍，事實(shí)上是按重量計(jì)從80%至90%范圍，其中所述膠原含量包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0124]-至少一種單糖，特別是葡萄糖，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從1%至12.5%范圍，特別是按重量計(jì)從1.5%至10%范圍，特別是按重量計(jì)從2%至8%范圍，且相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從2.5%至7.5%范圍，和
[0125]-至少一種，特別是一種，凝血因子，特別是凝血酶，其量為組合物的從0.01IU/mg至20IU/mg范圍，特別是從0.05IU/mg至10IU/mg,特別是從0.lIU/mg至5IU/mg,事實(shí)上是從 0.2IU/mg 至 2IU/mg。
[0126]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0127]-膠原，其主要包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量的，
[0128]-至少一種，特別是一種，單糖，和
[0129]-至少一種，特別是一種，糖胺聚糖。[0130]相當(dāng)特別地，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0131]-膠原，其量特別為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從70%至99%范圍，特別是按重量計(jì)從75%至96%范圍，特別是按重量計(jì)從77%至93%范圍，事實(shí)上是按重量計(jì)從80%至90%范圍，其中所述膠原包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0132]-至少一種單糖，特別是葡萄糖，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從1%至10%范圍，特別是按重量計(jì)從1%至12.5%范圍，特別是按重量計(jì)從1.5%至10%范圍，特別是按重量計(jì)從2%至8%范圍，且相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從2.5%至7.5%范圍，和
[0133]-至少一種糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從2%至25%范圍，特別是按重量計(jì)從3%至20%范圍，特別是按重量計(jì)從4%至15%范圍，相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從5%至12.5%范圍。 [0134]根據(jù)還另一個(gè)實(shí)施方案，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0135]-膠原，其主要包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0136]-至少一種，特別是一種，單糖，
[0137]-至少一種，特別是一種，凝血因子，和
[0138]-至少一種，特別是一種，糖胺聚糖。
[0139]相當(dāng)特別地，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0140]-膠原，其量特別為按相對(duì)于組合物的總重量特別是干重的重量計(jì)從70%至99%范圍，特別是按重量計(jì)從75%至96%范圍，特別是按重量計(jì)從77%至93%范圍，特別是按重量計(jì)從80%至90%范圍，其中所述膠原包含按相對(duì)于膠原總重量的重量計(jì)至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0141]-至少一種單糖，特別是葡萄糖，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從1%至10%范圍，特別是按重量計(jì)從1.5%至12.5%范圍，特別是按重量計(jì)從1.5%至10%范圍，特別是按重量計(jì)從2%至8%范圍，且相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從2.5%至7.5%范圍，
[0142]-至少一種凝血因子，特別是凝血酶，其量為組合物的從0.01IU/mg至20IU/mg范圍，特別是從0.05IU/mg至10IU/mg范圍，特別是從0.lIU/mg至5IU/mg范圍，事實(shí)上是從0.2IU/mg 至 2IU/mg 范圍，和
[0143]-至少一種糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)從2%至25%范圍，特別是按重量計(jì)從3%至20%范圍，特別是按重量計(jì)從4%至15%范圍，相當(dāng)特別地是按重量計(jì)從5%至12.5%范圍。
[0144]根據(jù)一個(gè)相當(dāng)具體的實(shí)施方案，組合物包含或事實(shí)上組成為:
[0145]-原纖維類型的膠原，大部分包含纖維和/或原纖維膠原，所述原纖維類型的膠原是通過(guò)例如在堿性介質(zhì)(basic medium)中提取而獲得的,且量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)約85%，
[0146]-葡萄糖，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)約4.9%，
[0147]-凝血酶，其量為組合物的0.2IU/mg至2IU/mg，和
[0148]-硫酸軟骨素，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)約10%。
[0149]根據(jù)另一個(gè)具體的實(shí)施方案，組合物包括或事實(shí)上組成為:[0150]-原纖維類型的膠原，大部分包含纖維和/或原纖維膠原，所述原纖維類型的膠原是通過(guò)例如在堿性介質(zhì)中提取而獲得的，且量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)約85%，
[0151]-葡萄糖，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)5%，
[0152]-硫酸軟骨素，其量為按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)10%。
[0153]在本發(fā)明的語(yǔ)境中，表述“約X%的量”指正負(fù)20%的變化，換句話說(shuō)，約10%的量意指從8%至12%，特別是正負(fù)10%的變化，事實(shí)上是正負(fù)5%的變化。
[0154]當(dāng)添加凝血酶時(shí)，將凝血酶粉末與已經(jīng)制備的膠原/單糖的均質(zhì)分子混合物物的粉末混合。當(dāng)添加硫酸軟骨素時(shí)，將凝血酶首先添加至硫酸軟骨素粉末，并將該混合物添加至之前的膠原/單糖混合物(已經(jīng)研磨成粉末)。凝血酶不受糖或膠原穩(wěn)定化。凝血酶從不與單糖的溶液接觸(與W098/57678相反)，這阻止蛋白質(zhì)的任何變性和粉末的再水化(rehydration),這會(huì)使得無(wú)法再適當(dāng)?shù)貙⒎勰└稍铩?br> [0155]組合物可以以幾種形式的固體粉末提供，特別是可噴霧的粉末。本發(fā)明的組合物優(yōu)選是可噴霧的粉末。
[0156]粉末形式的組合物可以具體包含或組成為:
[0157]-顆粒，其包含或組成為原纖維類型的膠原和至少一種單糖，特別是葡萄糖，其中特別地所述顆粒具有如在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所定義的大小、粒度和/或密度，和
[0158]-任選地，顆粒，其包含或組成為至少一種糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素，和/或至少一種凝血因子，特別是凝血酶，其中特別地所述顆粒具有如在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所定義的大小、粒度和/或密度。
[0159]粉末形式的本組合物，相當(dāng)特別地可噴霧粉末，可以有利地具有大于0.4g/mL，相當(dāng)特別地大于或等于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。事實(shí)上，當(dāng)將粉末用作止血?jiǎng)r(shí)，其密度必須足以防止血流對(duì)產(chǎn)品的任何稀釋和排斥。提供給具有大于0.4g/mL的密度的粉末組合物防止粉末被血液沖走。
[0160]當(dāng)手動(dòng)施用時(shí)，外科醫(yī)師應(yīng)當(dāng)以紗布(a gauze)壓制粉末而在壓制最后不去除產(chǎn)
品O
[0161]當(dāng)意圖將粉末組合物噴霧在流血的傷口上時(shí)，優(yōu)選這類組合物具有高得多的密度以允許粉末顆粒在從噴霧器中射出時(shí)達(dá)到一定的動(dòng)能。事實(shí)上，氣體不能完美地移動(dòng)具有低密度的粉末以抵達(dá)傷口而不形成云霧，而這與在多數(shù)情況中所需要的精確的施用不相容。具有較高的密度還使得噴霧器能夠賦予粉末足夠的動(dòng)能以使粉末較好的沖擊至傷口上。因此，粉末組合物優(yōu)選具有高于0.4g/mL的致密密度。甚至更優(yōu)選粉末組合物具有小于或等于0.6g/mL的致密密度。
[0162]獲得具有這類密度特征的粉末組合物的一種方式包括:研磨干燥的膠原的餅(cake of dry collagen),此種餅是膠原的硬而致密的制備物。所需的密度不可通過(guò)研磨膠原的凍干的制備物而達(dá)到，因?yàn)樵撟罱K顆粒將會(huì)是扁平的且因此不能噴霧，其具有重要的靜電電荷。例如，如在W001/97873中制備的產(chǎn)品不能制成具有這樣的密度和這樣可噴霧特征的粉末。
[0163]在W02005/072700中描述的粉末具有非常低的密度，且該粉末因此不能被噴霧以抵達(dá)目標(biāo)器官，特別是在腹腔鏡中。特別地，其在需要沖擊以防止來(lái)自血流的排斥的時(shí)候不會(huì)抵達(dá)傷口。[0164]本組合物，特別是粉末形式的組合物，相當(dāng)特別地是可噴霧的，可以優(yōu)選具有高于0.4g/mL的致密密度，特別是高于0.41g/mL。
[0165]還更優(yōu)選地，組合物粉末的致密密度高于0.4g/mL,且最優(yōu)選小于或等于0.6g/
mLo
[0166]散裝密度(bulk density) —般大于或等于0.3g/mL,相當(dāng)特別地大于或等于
0.31g/mL。
[0167]散裝密度有利地高于0.3g/mL，相當(dāng)特別地高于0.31g/mL。
[0168]這些密度是根據(jù)在實(shí)施例中所描述的規(guī)程而測(cè)量的。
[0169]本發(fā)明的組合物有利地具有范圍為從I秒至600秒的止血能力，特別是從I秒至200秒，更特別是從I秒至60秒，事實(shí)上是從I秒至40秒。止血能力是根據(jù)在實(shí)施例中呈現(xiàn)的規(guī)程測(cè)量的。
[0170]本發(fā)明的組合物有利地包含按重量計(jì)至少50%的顆粒，其大小在200 μ m和400 μ m之間。
[0171]構(gòu)成粉末的顆粒有利地具有從10 μ m至500 μ m的平均粒度范圍，特別是從50 μ m至 400 μ m。
[0172]有利地，按重量計(jì)至少90%，特別是按重量計(jì)100%的構(gòu)成所述粉末的顆?？梢源┻^(guò)篩網(wǎng)，所述篩網(wǎng)的篩目是500 μ m,特別是400 μ m。
[0173]按重量計(jì)至少90%重，且特別是按重量計(jì)至少95%的構(gòu)成所述粉末的顆?？梢员缓Y目為10 μ m,顯著地20 μ m,事實(shí)上30 μ m,事實(shí)上50 μ m的篩網(wǎng)保留。
[0174]選擇該再分配(repartition)以允許噴霧粉末。顆粒大小太小的話，粉末過(guò)于粉狀以致不能適當(dāng)?shù)氐诌_(dá)目標(biāo)，且具有過(guò)高的顆粒大小使得粉末不能噴霧。
[0175]組合物的主要化合物，特別是膠原，可以在20分鐘處具有范圍從0.7至I的溶脹比(swelling ratio),如根據(jù)在實(shí)施例中所描述的規(guī)程所測(cè)量的(見(jiàn)實(shí)施例4)。
[0176]組合物，特別是當(dāng)所述組合物包含至少一種糖胺聚糖時(shí)，且特別是當(dāng)所述組合物包含硫酸軟骨素時(shí)，可以在20分鐘處具有從5至15的溶脹比，特別是從8至12，且相當(dāng)特別地是從10至12，如根據(jù)在實(shí)施例中所描述的規(guī)程而測(cè)量的(見(jiàn)實(shí)施例5)。
[0177]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，組合物是以可噴霧的干燥粉末的形式而提供的。
[0178]粉末形式的組合物特別地包含:
[0179]-包含膠原和單糖的顆粒，和
[0180]-任選地，至少一種糖胺聚糖和/或凝血酶。
[0181]組合物可以包含:
[0182]-包含膠原、單糖、和任選地至少一種糖胺聚糖和/或凝血因子的顆粒，
[0183]-包含膠原、單糖、和任選地凝血因子和任選地糖胺聚糖顆粒的顆粒
[0184]-包含膠原和單糖的顆粒以及包含至少一種糖胺聚糖和/或凝血因子的顆粒。
[0185]在本發(fā)明的語(yǔ)境中，表述“干燥的粉末”意指組合物包含有限的溶劑含量，特別是水。所述有限的含量可以是按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)小于20%，特別是按重量計(jì)小于15%，特別是按重量計(jì)小于10%，且相當(dāng)特別地是按重量計(jì)小于5%。
[0186]所述干燥的形式可以通過(guò)將所使用的溶劑簡(jiǎn)單地蒸發(fā)、通過(guò)脫水或通過(guò)有機(jī)溶劑獲得。[0187]干燥粉末形式的組合物可以特別地通過(guò)噴霧而施用。
[0188]特別地，本發(fā)明涉及包含試劑盒，其包含:
[0189]-根據(jù)本發(fā)明的組合物，和
[0190]-噴霧設(shè)備。
[0191]所述組合物是如根據(jù)本發(fā)明說(shuō)明書(shū)所定義的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于噴霧粉末形式的藥物組合物的噴霧設(shè)備。
[0192]特別地，所述設(shè)備可以包含壓縮氣體的儲(chǔ)備，其中通過(guò)激活裝置的激活，特別是通過(guò)觸發(fā)器(trigger)，而將所述壓力釋放。 [0193]所述設(shè)備可以包含:
[0194]-激活裝置，
[0195]-粉末儲(chǔ)備，特別包含根據(jù)本發(fā)明的粉末，
[0196]-氣體儲(chǔ)備,其連接至粉末儲(chǔ)備，
[0197]-連接至粉末儲(chǔ)備的噴霧器，
[0198]-與激活手段偶聯(lián)的閥門(mén)A，其中當(dāng)激活裝置靜止時(shí)所述閥門(mén)A關(guān)閉且因此阻斷氣體儲(chǔ)備和粉末儲(chǔ)備之間的氣體的流通，且其中當(dāng)激活裝置被激活時(shí)所述閥門(mén)開(kāi)啟以輸送氣體的注入(an injection of gas)以噴霧至少部分的粉末。
[0199]可以將氣體儲(chǔ)備與供應(yīng)壓縮氣體的裝置，例如壓縮氣體的系統(tǒng)或壓縮氣體的罐(tank)偶聯(lián),特別是為了使得系統(tǒng)自主(autonomous)。
[0200]設(shè)備可以在氣體儲(chǔ)備和供應(yīng)裝置之間包含閥門(mén)B，其中所述閥門(mén)B與激活裝置偶聯(lián)。
[0201]閥門(mén)B默認(rèn)處在開(kāi)啟位置，除非當(dāng)激活裝置被激活時(shí)，在該情況中其關(guān)閉。
[0202]因此，當(dāng)閥門(mén)A開(kāi)啟時(shí)，閥門(mén)B關(guān)閉，反之亦然。這使得能夠遞送預(yù)定量的壓縮氣體以遞送粉末的劑量，而防止污染物接觸設(shè)備的內(nèi)部。
[0203]當(dāng)設(shè)備不與供應(yīng)氣體的裝置偶聯(lián)時(shí)，優(yōu)選閥門(mén)B關(guān)閉。這可以幫助限制污染設(shè)備內(nèi)部的風(fēng)險(xiǎn)。
[0204]相當(dāng)特別地，粉末儲(chǔ)備是以圓筒的形式，其包含幾個(gè)劑量的粉末。所述圓筒可以與由氣流所激活的推進(jìn)器偶聯(lián)，其使得在激活裝置激活后粉末能夠被噴霧，且因此旋轉(zhuǎn)圓筒并改變粉末的劑量。
[0205]存在于圓筒中的劑量可以密封以使得無(wú)菌，所述密封特別是具有當(dāng)氣流穿過(guò)所述的劑量時(shí)會(huì)掀開(kāi)(tears open)的組件。這使得有可能將劑量保存在無(wú)菌的環(huán)境中。
[0206]劑量的體積可以是約0.2cm3至Icm3,特別是約0.3cm3。
[0207]所使用的氣體可以是空氣、二氧化碳或任意惰性氣體(inert gas)。
[0208]特別地，設(shè)備是如在歐洲專利EP11163820.1和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/479，805中描述的，其都在2011年4月27日提交，并通過(guò)提述并入本文。
[0209]本發(fā)明還涉及用于制備止血組合物的方法，特別地如上面所定義的，其包括至少以下步驟:
[0210]a)形成水性懸液，其包含、或事實(shí)上組成為，原纖維類型的膠原——主要包含纖維和/或原纖維膠原——和單糖，如葡萄糖，
[0211]b)以沉淀、糊或凝膠形式回收產(chǎn)物，特別是通過(guò)離心或傾析，[0212]c)干燥產(chǎn)物，例如通過(guò)蒸發(fā)。
[0213]d)將產(chǎn)物研磨至合意的粒度,特別是通過(guò)錘式粉碎機(jī)(hammer mill),和
[0214]e)任選地，添加凝血酶和/或硫酸軟骨素，特別是以固體形式，特別是以粉末形式添加。
[0215]步驟a)中形成包含纖維/原纖維膠原和單糖的水性懸液導(dǎo)致單糖在膠原分子周圍的再分配(repartition)。此外，膠原和單糖分子種之間緊密的接觸導(dǎo)致在脫水后形成硬的餅，其適于通過(guò)研磨獲得具有所需的高密度的粉末。與之相反，將膠原粉末和葡萄糖粉末混合無(wú)法獲得均質(zhì)和可噴霧的粉末，特別是因?yàn)槊芏群碗姾傻木壒省?br> [0216]在步驟a)中，膠原可以以從30g/L至150g/L范圍的濃度存在。
[0217]可將單糖以如在說(shuō)明書(shū)中所定義的量添加至懸液或添加至均質(zhì)膠原糊中，且更特別地為按相對(duì)于膠原重量的重量計(jì)2%至5%。
[0218]在步驟a)中單糖可以以從0.3g/L至10g/L范圍的濃度而存在。
[0219]步驟a)的膠原的水性懸液可以是酸，且特別是包含酸如鹽酸。所述酸可以以從
0.01M至0.5M范圍的濃度而存在，且特別是從0.02M至0.1M，事實(shí)上是約0.05M。所述懸液可以為均質(zhì)糊的形式。
[0220]步驟b)可以包括將懸液傾入鑄模(mold)中。
[0221]進(jìn)行步驟c)以獲得盡可能厚的餅(比所期望的最終粒度更好(superior thefinal granulometry wanted)),其具有非常高的密度且餅內(nèi)部具有盡可能少的氣泡(小于5%)。
[0222]步驟d)可以繼以篩選粉末的步驟，特別是用于獲得合意的粒度。
[0223]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟a)包括形成包含按重量計(jì)95%的原纖維類型的膠原和按重量計(jì)5%的葡萄糖的混合物。在已經(jīng)將該混合物干燥(步驟b))和研磨(步驟c))后，添加按相對(duì)于混合物的總重量的重量計(jì)10%的硫酸軟骨素，使得最終組合物包含:
[0224]-膠原:其按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為86.36% ；
[0225]-葡萄糖:其按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為4.54% ；
[0226]-硫酸軟骨素:其按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)為9.09% ；
[0227]當(dāng)也添加凝血酶時(shí)，其代表按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)低于0.01%的最終含量。在上述的混合物中，凝血酶的量可以是組合物的0.083IU/mgo
[0228]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得的粉末。
[0229]對(duì)于所有前述的粉末產(chǎn)品，很明顯可能施以大致徹底的研磨以根據(jù)研磨的類型及其持續(xù)時(shí)間獲得具有不同粒度的粉末。
[0230]根據(jù)其另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如上所定義的組合物作為止血?jiǎng)┑挠猛尽?br> [0231]根據(jù)其還另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及藥物組合物或藥物，其包含、或事實(shí)上組成為，如以上所定義的組合物，特別是作為止血?jiǎng)?br> [0232]根據(jù)其另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如上所定義的組合物用于制備藥物或藥物組合物的用途，特別是止血性藥物或藥物組合物。
[0233]根據(jù)其另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及止血方法，其包括將如以上所定義的組合物沉積和/或噴霧在動(dòng)物的身體的出血的部分。特別地，所述組合物可以用于外科手術(shù)步驟，特別是剖腹手術(shù)、腹腔鏡、體腔鏡、和自動(dòng)步驟(robotic procedures)。[0234]本發(fā)明還涉及止血方法，其包括將本發(fā)明的組合物噴霧的步驟。
[0235]根據(jù)其另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及將如以上所定義的組合物用作生物粘合劑。
[0236]根據(jù)其還另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如以上所定義的組合物作為瘢痕形成劑(cicatrizing agent)用于內(nèi)部和外部傷口的用途。表述“瘢痕形成劑”指使得與其接觸的組織獲得臨床上令人滿意的瘢痕形成成為可能的產(chǎn)品。
實(shí)施例
[0237]實(shí)施例1:用于測(cè)量密度的規(guī)程
[0238]將待測(cè)試的產(chǎn)品(600mg)，特別是粉末形式的產(chǎn)品，引入5mL的帶刻度的量筒(graduated cylinder)中。測(cè)量了產(chǎn)品的高度并記錄了相應(yīng)的體積。將測(cè)量重復(fù)3次。然后將產(chǎn)品物通過(guò)在堅(jiān)硬表面上敲擊100次而將產(chǎn)品壓縮(pack) 3次。再次測(cè)量產(chǎn)品的高度和對(duì)應(yīng)的體積。由此獲得了壓縮前和壓縮后的產(chǎn)品的密度，分別稱為散裝密度和致密密度。
[0239]實(shí)施例2:用于體外測(cè)量止血能力的規(guī)程
[0240]在整個(gè)測(cè)量過(guò)程中將檸檬酸化(約0.1M)的人血液在水浴中保持在37°C。將要測(cè)量的產(chǎn)品(IOmg)沉積于帶有扣蓋(snap-on cap)的5mL聚丙烯試管中，然后添加檸檬酸化的新鮮血液(2mL)。然后添加CaCl2使得血液中的CaCl2終濃度為15mM，然后將試管封閉。將內(nèi)含物通過(guò)劇烈地反轉(zhuǎn)(10次)混合，然后將試管浸沒(méi)在水浴中；每10秒將試管回復(fù)至垂直位置。記錄形成血塊所需的時(shí)間并與止血能力相對(duì)應(yīng)。
[0241]實(shí)施例3:用于測(cè)量顆粒大小的規(guī)程
[0242]將已知量的產(chǎn)品，特別是粉末，通過(guò)50 μ m，100 μ m, 200 μ m, 300 μ m和400 μ m篩網(wǎng)
過(guò)篩2分鐘(每次篩選)。將來(lái)自每次篩選的級(jí)分稱重。確定粒度范圍的比例。
[0243]實(shí)施例4:用于測(cè)量組合物的多數(shù)化合物的泡脹的規(guī)程
[0244]將組合物,特別是膠原(40mg至70mg)在稱量舟(weighing boat)中稱量。將6mL的0.15M NaCl沉積于另一個(gè)稱量舟中。將待測(cè)試的化合物沉積于0.15M NaCl上(t=0)。在20分鐘后，去除過(guò)量的液體并稱量泡脹了的產(chǎn)品。溶脹比對(duì)應(yīng)于吸收的水的量相比于干燥的初始產(chǎn)品的重量。
[0245]實(shí)施例5:用于測(cè)量組合物的泡脹的規(guī)程
[0246]稱量了 15mL的燒瓶(以mg計(jì)的mQ)，然后添加X(jué) mg的干燥組合物的粉末(以mg計(jì)的IVx)。添加0.15M水性NaCl溶液(2mL)并允許組合物泡脹20分鐘；然后將燒瓶在
I,OOOrpm 離心。
[0247]以巴斯德吸管將過(guò)量的NaCl去除并通過(guò)將燒瓶反轉(zhuǎn)到濾紙上而消除了微滴(droplets);然后稱量帶有潮濕粉末的燒杯(以mg計(jì)的Iii1)。
[0248]溶脹比是如下所述計(jì)算的:(Oii1-m。) / (m0+x-m0))。
[0249]實(shí)施例6:通過(guò)堿性提取制備原纖維類型的膠原
[0250]將豬真皮的片(30kg)以丙酮脫脂，并允許其在IOOkg的0.05M NaOH溶液中泡脹3小時(shí)。以切割碎機(jī)(cutting mill)將真皮精細(xì)地切碎并將所獲得的糊以50升的0.05MNaOH稀釋。然后使混合物·在壓力下通過(guò)Imm篩網(wǎng)。然后以HCl將所獲得的糊調(diào)節(jié)至pH6_7.5并通過(guò)離心或經(jīng)過(guò)1_篩網(wǎng)過(guò)濾收集所獲得的糊。
[0251]根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法以丙酮將滲余物(retentate)脫水。因此脫水的滲余物包含原纖維類型的膠原，其具有相對(duì)于非原纖維膠原的大量的纖維/原纖維膠原。一般地，此種提取的膠原包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)從85%至95%的纖維/原纖維膠原，和按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)5%至15%的非原纖維膠原。
[0252]實(shí)施例7:制備止血粉末#1
[0253]將30g如在實(shí)施例6中所制備的原纖維類型的膠原添加至IL的0.02M水性HCl溶液，然后攪拌混合物5小時(shí)。接著，向所獲得的均質(zhì)糊添加量為按相對(duì)于膠原的重量的重量計(jì)2%(0.6g)的粉末化的果糖。
[0254]將混合物均質(zhì)化I小時(shí)并且然后傾倒出并脫水。在干燥后，使用7，OOOrpm的Fitzpatrick錘式粉碎機(jī)在受控的加熱下以25g/min的速率將干燥的產(chǎn)物研磨。然后將產(chǎn)物通過(guò)機(jī)械過(guò)篩(mechanical sifting)篩選以消除大小大于400 μ m的顆粒。
[0255]然后向粉末添加量為按相對(duì)于粉末的干物質(zhì)的重量計(jì)2%的硫酸皮膚素(0.612g)。
[0256]然后使用球磨機(jī)(ball mill)將混合物均質(zhì)化，以粉末的15IU/mg的量將凍干的凝血酶添加至混合物，且最后使用球磨機(jī)將混合物均質(zhì)化。
[0257]實(shí)施例8:制備止血粉末#2
[0258]將7.5kg如在實(shí)施例6中制備的原纖維類型的膠原添加至50L的0.05M水性HCl溶液，然后攪拌混合物16小時(shí)。 接著，向所獲得均質(zhì)糊中添加量為按相對(duì)于膠原的重量的重量計(jì)5%的粉末化的果糖(375g)。
[0259]將混合物均質(zhì)化3小時(shí)且然后分布至板上并脫水。在干燥后，通過(guò)使用在12，OOOrpm的錘式粉碎機(jī)在受控的加熱下的以5g/min的速率通過(guò)分級(jí)研磨干燥的產(chǎn)物。然后通過(guò)機(jī)械過(guò)篩篩選產(chǎn)物以消除大小大于400 μ m的顆粒和大小小于50 μ m的顆粒。
[0260]測(cè)量了粒度以驗(yàn)證其分布為按重量計(jì)60%的樣品具有大于200 μ m的粒度。
[0261]然后向粉末添加量為按粉末的干物質(zhì)的重量計(jì)20%的純化的硫酸軟骨素(1.575kg)。使用球磨機(jī)將混合物均質(zhì)化。
[0262]最終，向混合物中添加量為粉末的10IU/mg的凍干的凝血酶。如同之前，使用球磨機(jī)將混合物均質(zhì)化。
[0263]實(shí)施例9:制備止血粉末#3
[0264]將1000g如在實(shí)施例6中制備的原纖維類型的膠原添加至60mL的0.02M水性HCl溶液，然后攪拌混合物5小時(shí)。接著，向所獲得的均質(zhì)糊添加量為按相對(duì)于膠原的重量的重量計(jì)5%的粉末化的葡萄糖(50g)。
[0265]將混合物均質(zhì)化I小時(shí)并傾倒出和脫水。在干燥后，使用Fitzpatrick錘式粉碎機(jī)以7，OOOrpm在受控的加熱下以25g/min的速率將干燥的產(chǎn)物研磨。然后將產(chǎn)物通過(guò)機(jī)械過(guò)篩篩選以消除大小大于400 μ m的顆粒和大小小于50 μ m的顆粒。
[0266]然后向粉末添加量為按粉末的干物質(zhì)的重量計(jì)10%的硫酸軟骨素(105g)。然后使用球磨機(jī)將混合物均質(zhì)化。
[0267]這類的粉末組合物具有約0.408g/mL的致密密度。
[0268]實(shí)施例10:制備止血粉末#4
[0269]將500g如在實(shí)施例6中制備的原纖維類型的膠原添加至30mL的0.02M水性HCl溶液，然后攪拌混合物5小時(shí)。下一步，向所獲得的均質(zhì)糊添加按相對(duì)于膠原的重量的重量計(jì)5%的粉末化的葡萄糖(25g)。
[0270]將混合物均質(zhì)化I小時(shí)并然后傾倒出和脫水。在干燥后，使用7，OOOrpm的Fitzpatrick錘式粉碎機(jī)在受控的加熱下以25g/min的速率將干燥產(chǎn)物研磨。然后將產(chǎn)物通過(guò)機(jī)械過(guò)篩篩選以消除大小大于400 μ m的顆粒和大小小于50 μ m的顆粒。
[0271]然后向粉末添加量為按粉末的干物質(zhì)的重量計(jì)10%的混合了凝血酶粉末的硫酸軟骨素(52.5g)。以0.85U/mg的最終量向混合物中添加凝血酶。然后使用球磨機(jī)將混合物均質(zhì)化。
[0272]這類粉末組合物具有約0.425g/mL的致密密度。
[0273]實(shí)施例11:基于粉末#3的止血膠原的性能
[0274]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)期間測(cè)試了如在實(shí)施例9中所制備的含有膠原、葡萄糖、硫酸軟骨素，不含凝血酶的基于膠原的粉末#3。
[0275]該實(shí)驗(yàn)的規(guī)程如下:
[0276]-在左旁正中肝葉表面上造成大小為大約10*10*l-3mm3的傷口。
[0277]-然后在30秒期間施用測(cè)試中產(chǎn)物。施用了足量的產(chǎn)物以覆蓋傷口；將測(cè)試材料使用紗布通過(guò)溫和按壓保持在傷口位點(diǎn)。
[0278]-然后做了出血評(píng)級(jí)(bleedinggrading)以評(píng)價(jià)所達(dá)到的止血的百分?jǐn)?shù)。如果達(dá)到了臨床可接受的止血，則停止實(shí)驗(yàn)。否則，再完成另一輪按壓-評(píng)級(jí)，最多5輪按壓。在每一輪都更新接受實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物。
[0279]用下述產(chǎn)物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn):不帶任何止血組合物的紗布(稱為“對(duì)照”)，由止血粉末#3所覆蓋的紗布(稱為“GHP#3”)，來(lái)自Davol的止血紗布“Avitene” (稱作“Avitene”，由膠原纖維構(gòu)成)，來(lái)自Ethicon的止血紗布“Surgicel ”(稱為“Surgicel ”，由氧化纖維素(oxidized cellulosis)構(gòu)成)。
[0280]結(jié)果在下述表1中總結(jié)，其顯示了每種產(chǎn)物所達(dá)到的止血的百分?jǐn)?shù):
[0281]表1
[0282]
【權(quán)利要求】
1.一種粉末形式的止血組合物，其包含 -原纖維類型的膠原，所述膠原包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原含量，以及 -至少一種單糖。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)80%-90%范圍的膠原含量。
3.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)1%到12.5%范圍的單糖含量。
4.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含從10到50范圍，且優(yōu)選為19的膠原/單糖重量比值。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的組合物，其中所述膠原包含按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)85%到95%范圍的纖維膠原和/或原纖維膠原含量。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)2%到25%范圍的糖胺聚糖含量。
7.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含在2到40范圍的膠原/總糖化合物的重量比值，其中總糖化合物的重量是單糖的重量和糖胺聚糖的重量之和。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含凝血因子，特別是凝血酶，其量的范圍為0.01IU/mg至20IU/mg組合物。
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含按重量計(jì)至少50%的顆粒，所述顆粒的大小在200 μ m和400 μ m之間。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的組合物，其包含: -按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)86.36%的量的膠原， -按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)4.54%的量的葡萄糖， -按相對(duì)于組合物的總重量的重量計(jì)的9.09%的量的硫酸軟骨素。
12.權(quán)利要求11的組合物，還包含凝血酶，其量為0.2IU/mg至2IU/mg組合物。
13.一種用于制備止血組合物的方法，其至少包括以下步驟: a)形成包含原纖維類型的膠原和至少一種單糖的水性懸液，所述原纖維類型的膠原具有按相對(duì)于膠原的總重量的重量計(jì)的至少70%的纖維膠原和/原纖維膠原含量， b)以沉淀、糊、或凝膠形式回收產(chǎn)物，特別是通過(guò)離心或傾析， c)干燥產(chǎn)物， d)將產(chǎn)物研磨至合意的粒度。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述在步驟a)中使用的膠原是通過(guò)堿性提取獲得的。
15.權(quán)利要求13或14任一項(xiàng)的方法，還包括在步驟d)之后的步驟e)，其包括添加至少一種選自下組的化合物: -凝血因子，特別是凝血酶，以及 -糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、及其混合物。
16.權(quán)利要求1至12的組合物或可以通過(guò)如權(quán)利要求13所定義的方法而獲得的組合物，其用于與止血?jiǎng)┫嗤挠猛尽?br> 17.—種試劑盒，其包含 -權(quán)利要求1至12和16任一項(xiàng)的組合物，和 -噴霧設(shè)備。`
【文檔編號(hào)】A61P7/04GK103635202SQ201280031849
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月27日
【發(fā)明者】C.加格尼厄, P.福里斯特, S.皮科特 申請(qǐng)人:比奧馬普公司