專利名稱：鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物用病毒性疾病活疫苗制造領(lǐng)域，尤其是涉及一種鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(DuckHepatitis Virus, DHV ;屬小核糖核酸病毒)引起的小鴨的一種急性傳染病，對小鴨具有高度致死性。嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。臨床上已報(bào)道有多種病毒可引起小鴨病毒性肝炎。已確定有小RNA病毒科I型鴨病毒性肝炎病毒、新血清型鴨病毒性肝炎病毒和I型鴨病毒性肝炎病毒變異株，以及星狀病毒科的2型、3型鴨病毒性肝炎病毒等。我國自1980年在北京分離到本病毒并確定為血清I型鴨病毒性肝炎病毒以來，該病在全國各地均有不同程 度的流行。1950年，Levine和Fabricant首次在美國長島發(fā)現(xiàn)本病,并通過雞胚分離到鴨病毒性肝炎病毒。以后各國均有本病流行的報(bào)道。我國于1963年由上海畜牧獸醫(yī)研究所黃均健首次報(bào)道；北京大學(xué)王平、潘文石等在北京地區(qū)某鴨場分離到了鴨病毒性肝炎病毒。證實(shí)北京地區(qū)有本病發(fā)生。以后發(fā)現(xiàn)全國各地都有本病發(fā)生。本病主要危害I 3周齡的雛鴨，因此防治方法主要針對雛鴨。具體方法大體上可以為兩大類，即雛鴨的被動免疫方法和主動免疫方法。雛鴨的被動免疫方法主要包括對雛鴨注射康復(fù)鴨血清、高免母鴨或母雞的蛋黃勻漿；及用DHV免疫種鴨，使后代雛鴨獲得蛋傳抗體。雛鴨的主動免疫方法就是用各種DHV疫苗(雞胚化弱毒、細(xì)胞毒、強(qiáng)毒滅活苗和弱毒滅活苗等)接種雛鴨，使其自身產(chǎn)生抗體，以達(dá)到防治DVH的目的。而無論是用以上方法免疫種鴨還是雛鴨，均很難在雛鴨10日齡之前產(chǎn)生足夠效價(jià)的抗體，因此雛鴨在1-10日齡爆發(fā)鴨病毒性肝炎死亡率非常高且難以控制。弱毒活疫苗是預(yù)防畜禽傳染病的主要疫苗之一，而目前國內(nèi)沒有一例鴨病毒性肝炎活疫苗問世。究其原因主要有(1)自然分離得到的鴨病毒性肝炎強(qiáng)毒株在人工復(fù)制病例中，不能穩(wěn)定致死5日齡以上的雛鴨，要分離到夠穩(wěn)定致死7-8日齡雛鴨的鴨病毒性肝炎強(qiáng)毒非常困難。而沒有強(qiáng)毒對照，就沒有辦法進(jìn)行疫苗的后續(xù)研發(fā)工作；(2)獲得I株免疫原性良好、毒力穩(wěn)定，且疫苗免疫后抗體產(chǎn)生快，能夠保護(hù)10日齡以內(nèi)雛鴨的鴨病毒性肝炎致弱疫苗毒株也比較困難，研究發(fā)現(xiàn)該病毒致弱后往往免疫原性不佳或易發(fā)生毒力反強(qiáng)。此外，在疫苗保護(hù)劑方面，國內(nèi)疫苗企業(yè)常用的疫苗保護(hù)劑主要是乳糖，牛奶，明膠等，組方簡單，保護(hù)性差。如果在2°C 8°C條件下，保存期只有3 6個月，大多需要在-15°C以下保存。而國內(nèi)傳統(tǒng)的動物用疫苗保護(hù)劑的研制相對滯后，使疫苗的長期保存和長途運(yùn)輸受到很大限制，加上基層防疫部門缺乏必要的冷凍和冷藏設(shè)施，容易造成疫苗因保存不當(dāng)而失效，導(dǎo)致疫苗免疫失敗而造成疫病流行。所以，耐熱保護(hù)劑的研究非常急需，發(fā)達(dá)國家在二十世紀(jì)八十年代就已開始進(jìn)行耐熱保護(hù)劑的研究，目前已經(jīng)基本采用耐熱凍干保護(hù)劑生產(chǎn)凍干疫苗，但由于保護(hù)劑的研究和應(yīng)用屬于專利資料，處于保密狀況中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種克服國產(chǎn)疫苗保存工藝落后現(xiàn)狀，提高疫苗質(zhì)量以及市場競爭力的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)鴨病毒性肝炎病毒活疫苗用耐熱保護(hù)劑，包括以下組分及重量百分比含量明膠3 8%、山梨醇5 10%、
尿素I 3%、脂肪酸鹽0.5 2%、維生素CI 3%、谷氨酸單鈉I 3%、磷酸氫二鉀I 2%、磷酸二氫鉀0.52%、雙蒸水余量。鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的制備方法，包括以下步驟(I)將明膠、山梨醇按上述配比溶于雙蒸水中，控制溫度為108 121°C高壓滅菌15 30min ；(2)將尿素、脂肪酸鹽、維生素C、谷氨酸單鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀按上述配比溶于雙蒸水中，用0.22pm的濾膜除菌，然后其與步驟(I)中制備得到的組分1: (I 1.2)混合，配制成耐熱保護(hù)劑。步驟⑴與步驟⑵中配制溶液按(I 1. 2) I混合，制備成耐熱保護(hù)劑。鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用，將制備得到的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑和鴨病毒性肝炎病毒培養(yǎng)液按重量比為1: (I 1. 2)混合得到混合液，然后進(jìn)行凍干處理，包括以下步驟將分裝好的混合液裝入凍干機(jī)箱體內(nèi)，在2 3h內(nèi)緩慢降溫至-45 °C，在此溫度下維持5 6h，開始抽真空至10_4Pa，然后開始升溫，14 16h內(nèi)升至_20°C，之后以2 5°C /h的速度升溫至20°C，維持5 6h后加塞出箱即可。所述的凍干處理的全部時間為42 46h。所述的鴨病毒性肝炎活疫苗所用病毒包括I型鴨病毒性肝炎病毒、2型鴨病毒性肝炎病毒、3型鴨病毒性肝炎病毒或新型鴨病毒性肝炎病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明為鴨病毒性肝炎弱毒疫苗的研制提供了很好的資源，另外克服國產(chǎn)疫苗保存工藝落后現(xiàn)狀，提高疫苗質(zhì)量以及市場競爭力，發(fā)明了鴨病毒性肝炎活疫苗耐熱型的制備保存工藝，在2 8°C條件下可以保存24個月，疫苗效價(jià)均保持在每頭份彡 IO6 0EID500(2)本發(fā)明與以往家禽活疫苗耐熱保護(hù)劑相比有很大的區(qū)別，鴨病毒性肝炎病毒屬小RNA病毒，無脂蛋白包膜，一般不耐受冷凍干燥。本研發(fā)明的目的是解決無脂蛋白病毒耐受冷凍干燥的問題。山梨醇、尿素、脂肪酸鹽等配方為主的保護(hù)劑，保護(hù)機(jī)理可能主要有以下幾個方面組份山梨醇上的羥基能替代部分結(jié)構(gòu)水，與病毒蛋白外殼中羰基或氨基結(jié)合，且能形成玻璃樣結(jié)晶顆粒，可以有效保持病毒外殼的空間構(gòu)型，保持病毒活性。離子強(qiáng)度改變可保護(hù)蛋白外殼，防止離子強(qiáng)度過高使蛋白質(zhì)容易聚集，減弱羥基形成分子氫鍵的作用。加入尿素、脂肪酸鹽和相關(guān)化合物(主要是模擬細(xì)菌芽胞中的吡啶二羧酸鈣，提高疫苗耐熱性，抵抗各種酶的破壞作用)，有類似于脂蛋白包膜的作用，防止病毒在加熱過程中核衣殼蛋白構(gòu)型變化，以抵抗熱滅活作用。(3)本發(fā)明在耐熱保護(hù)劑組份中去除牛血清白蛋白、胰蛋白胨的熱源蛋白質(zhì)，主要是考慮到降低雛鴨免疫時的熱源應(yīng)激(免疫副反應(yīng))，避免雛鴨因免疫應(yīng)激而死亡。因?yàn)椋景l(fā)明所使用的產(chǎn)品鴨病毒性肝炎弱毒活疫苗主要使用在出生I日齡的雛鴨上，雛鴨免疫機(jī)能和環(huán)境抵抗力很弱的情況下接受熱源蛋白質(zhì)刺激，容易產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)激，從而出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。


圖1為實(shí)施例2的凍干曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。前期的準(zhǔn)備工作I型鴨病毒性肝炎制苗病毒液的獲得(I) I型鴨病毒性肝炎病毒的分離將采集的病鴨的肝臟在滅菌的乳缽內(nèi)充分研磨，用滅菌生理鹽水制成1: 5懸液，凍融3次，3000r/min離心，15min,取上清液，加2000IU/mL青、鏈霉素，37°C作用60min。取9 10日齡SPF雞胚20枚，分為2組，每組10枚，第I組為試驗(yàn)組，經(jīng)尿囊腔途徑接種病料，0. 2mL/胚；第2組為對照組，經(jīng)尿囊腔途徑接種無菌生理鹽水，0. 2mL/胚。接種后繼續(xù)孵化，每日照蛋2次，收獲24 144h死亡胚尿囊液，冷凍保存、備用，觀察胚體及內(nèi)臟病變。按常規(guī)方法對分離毒進(jìn)行檢測和鑒定。(2) I型鴨病毒性肝炎病毒的傳代致弱將分離毒株經(jīng)9日SPF齡雞胚尿囊腔接種，0. 2mL/枚，連續(xù)傳代，進(jìn)行I型鴨病毒性肝炎病毒雞胚致弱毒培育，選擇48 96小時死亡的雞胚，置4°C冰箱放置24小時，無菌操作，取出卵黃以外的全胚，用組織搗碎機(jī)制成勻漿，加入雙抗。分裝，置_70°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?3) I型鴨病毒性肝炎病毒致弱毒株的檢測取第25、35、45、55、65、67、71、76、81、86、91、96、101 代次雞胚組織毒，分別進(jìn)行病
毒毒價(jià)(ELD5tl),穩(wěn)定性(毒力返強(qiáng))，免疫原性，免疫產(chǎn)生期以及安全性等檢測。結(jié)果表明從67代起，病毒毒力穩(wěn)定在IO6 tlELD5tl, 71 86代的病毒液毒力非常穩(wěn)定(在本動物體內(nèi)連續(xù)傳10代均未出現(xiàn)毒力返強(qiáng))，且具有非常好的免疫原性，免疫后3天即可產(chǎn)生中和抗體，免疫后5天抗體達(dá)到最高峰值且可維持至少6周。選取第71代弱毒作為生產(chǎn)疫苗的原始種毒，選取72 76代作為生產(chǎn)疫苗的基礎(chǔ)種毒，用于生產(chǎn)安全有效的I型鴨病毒性肝炎活疫苗。
二 . 3型鴨病毒性肝炎制苗病毒液的獲得(I) 3型鴨病毒性肝炎病毒的分離將采集的病鴨的肝臟在滅菌的乳缽內(nèi)充分研磨，用滅菌生理鹽水制成1: 5懸液，凍融3次，3000r/min離心，15min,取上清液，加2000IU/mL青、鏈霉素，37°C作用60min。取9 10日齡SPF雞胚20枚，分為2組，每組10枚，第I組為試驗(yàn)組，經(jīng)尿囊腔途徑接種病料，0. 2mL/胚；第2組為對照組，經(jīng)尿囊腔途徑接種無菌生理鹽水，0. 2mL/胚。接種后繼續(xù)孵化，每日照蛋2次，收獲24 144h死亡胚尿囊液，冷凍保存、備用，觀察胚體及內(nèi)臟病變。按常規(guī)方法對分離毒進(jìn)行檢測和鑒定。(2) 3型鴨病毒性肝炎病毒的傳代致 弱將分離毒株經(jīng)9日SPF齡雞胚尿囊腔接種，0. 2mL/枚，連續(xù)傳代，進(jìn)行I型鴨病毒性肝炎病毒雞胚致弱毒培育，選擇48 96小時死亡的雞胚，置4°C冰箱放置24小時，無菌操作，取出卵黃以外的全胚，用組織搗碎機(jī)制成勻漿，加入雙抗。分裝，置_70°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?3) 3型鴨病毒性肝炎病毒致弱毒株的檢測取第25、35、45、55、65、67、71、76、81、86代次雞胚組織毒，分別進(jìn)行病毒毒價(jià)(ELD5tl),穩(wěn)定性(毒力返強(qiáng))，免疫原性，免疫產(chǎn)生期以及安全性等檢測。結(jié)果表明從45代起，病毒毒力穩(wěn)定在106_°ELD5Q，55 71代的病毒液毒力非常穩(wěn)定(在本動物體內(nèi)連續(xù)傳10代均未出現(xiàn)毒力返強(qiáng))，且具有非常好的免疫原性，免疫后3天即可產(chǎn)生中和抗體，免疫后5天抗體達(dá)到最高峰值且可維持至少6周。選取第55代弱毒作為生產(chǎn)疫苗的原始種毒，選取56 60代作為生產(chǎn)疫苗的基礎(chǔ)種毒，用于生產(chǎn)安全有效的3型鴨病毒性肝炎活疫苗。實(shí)施例1I型鴨病毒性肝炎活疫苗耐熱型保存工藝(I)將明膠5%、山梨醇10%按上述配比溶于雙蒸水中，控制溫度為108 121°C高壓滅菌30min ;將尿素2%、維生素Cl %、谷氨酸單鈉3%、磷酸氫二鉀2%、磷酸二氫鉀0.52%按上述配比溶于雙蒸水中，用0.22pm的濾膜除菌，然后其與步驟(I)中制備得到的組分按1:1混合，配制成耐熱保護(hù)劑。(2) I型鴨病毒性肝炎病毒經(jīng)過培養(yǎng)后，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和病毒含量的測定，將合格的病毒液和配制好的凍干保護(hù)劑1:1混合后，充分搖勻，定量分裝后立即進(jìn)行冷凍干燥。(3)將分裝好的疫苗裝入凍干機(jī)箱體內(nèi)，在3小時內(nèi)緩慢降溫至_45°C，在此溫度下維持6個小時后，開始抽真空至10_4帕后，在開始升溫，7小時內(nèi)升至_20°C，之后以每小時2°C的速度升溫至20°C，維持6小時加塞出箱。凍干全程為42個小時。實(shí)施例2I型鴨病毒性肝炎活疫苗耐熱型保存工藝(I)將明膠5%、山梨醇10%按上述配比溶于雙蒸水中，控制溫度為108 121°C高壓滅菌30min ;將尿素2 %、脂肪酸鹽I %、維生素Cl %、谷氨酸單鈉3 %、磷酸氫二鉀2 %、磷酸二氫鉀0. 52%按上述配比溶于雙蒸水中，用0. 22 y m的濾膜除菌，然后其與步驟(I)中制備得到的組分按1:1混合，配制成耐熱保護(hù)劑。(2) I型鴨病毒性肝炎病毒經(jīng)過培養(yǎng)后，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和病毒含量的測定，將合格的病毒液和配制好的凍干保護(hù)劑1:1混合后，充分搖勻，定量分裝后立即進(jìn)行冷凍干燥。
(3)將分裝好的疫苗裝入凍干機(jī)箱體內(nèi)，在2小時內(nèi)緩慢降溫至-45°C，在此溫度下維持8個小時后，抽真空至10_4帕，開始升溫，8小時內(nèi)升至-20°C，之后以每小時2°C的速度升溫至20°C，維持8小時加塞出箱。凍干全程為46個小時。凍干產(chǎn)品的測試將不同實(shí)施案例凍干的產(chǎn)品，置于100°C、37°C、2 8°C條件下保存，不同時間取樣，測定病毒含量及其物理性狀，結(jié)果見表1、2、3。表I凍干制品置于100°C間接煮沸10分鐘后的物理性狀和滴度的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.鴨病毒性肝炎病毒活疫苗用耐熱保護(hù)劑，其特征在于，該保護(hù)劑包括以下組分及重量百分比含量 明膠3 8%、 山梨醇5 10%、 尿素I 3%、 脂肪酸鹽O. 5 2%、 維生素CI 3%、 谷氨酸單鈉I 3%、 磷酸氫二鉀I 2%、 磷酸二氫鉀0.52%、 滅菌雙蒸水余量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)將明膠、山梨醇按上述配比溶于雙蒸水中，控制溫度為108 121°C高壓滅菌15 30min ； (2)將尿素、脂肪酸鹽、維生素C、谷氨酸單鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀按上述配比溶于雙蒸水中，用O. 22μπι的濾膜除菌，然后其與步驟(I)中制備得到的組分混合，配制成耐熱保護(hù)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，步驟(I)與步驟(2)中配制溶液按(I 1. 2) I混合，制備成耐熱保護(hù)劑。
4.如權(quán)利要求1所述的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用，其特征在于，將制備得到的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑和鴨病毒性肝炎病毒培養(yǎng)液按重量比為I (I 1. 2)混合得到混合液，然后進(jìn)行凍干處理，包括以下步驟將分裝好的混合液裝入凍干機(jī)箱體內(nèi)，在2 3h內(nèi)緩慢降溫至-45°C，在此溫度下維持5 6h，開始抽真空至10_4Pa，然后開始升溫，14 16h內(nèi)升至_20°C，之后以2 5°C /h的速度升溫至20°C，維持5 6h后加塞出箱即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的凍干處理的全部時間為42 46h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用，所述的鴨病毒性肝炎活疫苗所用病毒包括I型鴨病毒性肝炎病毒、2型鴨病毒性肝炎病毒、3型鴨病毒性肝炎病毒或新型鴨病毒性肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎活疫苗用耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用，將凍干保護(hù)劑基質(zhì)按一定的比例混合、配制，將保護(hù)劑分別進(jìn)行無菌處理，對可以進(jìn)行高壓滅菌的保護(hù)劑組份溶于雙蒸水中，108～121℃滅菌15～30分鐘；將不耐高壓滅菌的保護(hù)劑組份按配比溶于雙蒸水中用0.22μm的濾膜除菌，再將兩者混合成為耐熱保護(hù)劑，然后將該耐熱保護(hù)劑和鴨病毒性肝炎病毒液進(jìn)行1∶1～1.2混合，采用相應(yīng)的凍干曲線凍干，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明為鴨病毒性肝炎弱毒活疫苗的研制提供了很好的資源，克服國產(chǎn)疫苗保存工藝落后現(xiàn)狀，在2～8℃條件下保存24個月，疫苗效價(jià)均保持在每羽份≥106.0EID50。
文檔編號A61K47/42GK103007289SQ201210448030
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者蘇敬良, 賴 志, 漆世華, 高俊鋒, 胡彥斌, 孫慶歌, 馬晶晶 申請人:上海創(chuàng)宏生物科技有限公司