專利名稱：凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒性疫苗的醫(yī)用生物制品，具體涉及一種甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法。
甲型肝炎(甲肝)是一種極易傳染和流行的疾病，一旦傳播很易造成大流行。此病主要發(fā)生在發(fā)展中國家，在一些發(fā)達國家的發(fā)病人數(shù)也較多。我國35歲以上的成年人，甲肝抗體陽性率達90％以上，常引起季節(jié)性的流行。近年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，居住的小環(huán)境有所改善，但大環(huán)境中引起甲肝的甲型肝炎病毒的污染及散布條件卻依然存在且更為嚴重，單純靠改善衛(wèi)生條件難以預(yù)防解決甲肝嚴重流行的問題。因此，發(fā)展安全有效的甲肝疫苗是目前預(yù)防甲肝的主要措施。
自1973年，F(xiàn)einstone等發(fā)現(xiàn)肝炎病毒(Hepatitis A Virus)是傳染性肝炎的的病原體，1979年P(guān)rovost在體外分離培養(yǎng)肝炎病毒，獲得了甲肝病毒株后，為甲肝疫苗的研制開辟了道路。目前，世界上有兩類甲型肝炎疫苗，即甲型肝炎減毒活疫苗和甲型肝炎滅活疫苗，國外主要發(fā)展滅活疫苗，而活疫苗僅有中國、美國等少數(shù)國家在研究和生產(chǎn)。這兩種疫苗各有優(yōu)缺，減毒活疫苗的缺點是穩(wěn)定性差，有效的保存期限短，必須在冷凍條件下保存和運輸，優(yōu)點是價格便宜，免疫原性好，有細胞免疫功能。滅活疫苗的優(yōu)點是免疫原性很強，免疫后體液抗體很高，疫苗穩(wěn)定，保存期較長，缺點是細胞免疫功能不如減毒活疫苗，且價格昂貴。我國于1978年開始研究甲肝減毒活疫苗，“七五”期間被列為國家重大科技攻關(guān)計劃項目，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物學(xué)研究所以及中國藥品生物制品檢定所合作，選育出了二株(H2株和LA-1株)，并在“八五”、“九五”期間繼續(xù)進行了大量研究和臨床試驗，結(jié)果表明，國產(chǎn)的兩種甲肝減毒活疫苗安全可靠、免疫性良好，其免疫效果與國外滅活疫苗相同。
但從現(xiàn)在國產(chǎn)的兩種甲型肝炎減毒活疫苗看，均為液體劑型，其熱穩(wěn)定性較差，不同滴度的疫苗從實驗檢定到現(xiàn)場注射，感染性滴度都有不同程度的下降，平均下降0.5logCCID50/ml左右，減度活疫苗在2-8℃條件下僅能有效保存三個月，-20℃保存期限僅1年。因此，使產(chǎn)品的推廣和應(yīng)用受到很大限制。查新檢索結(jié)果表明，近年來僅見日本有甲型肝炎滅活疫苗的冷凍干燥劑型的研究及商品，未見有凍干甲型肝炎減毒活疫苗的研究報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種熱穩(wěn)定性好，便于運輸和保存的凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)本發(fā)明包括液體甲型肝炎減毒活性疫苗和凍干保護劑，凍干保護劑配方如下(W/V)海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克，磷酸二氫鉀0.34克，雙蒸餾水100毫升，其中的氨基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸。
本發(fā)明的制備方法包括以下步驟1、配制凍干保護劑將海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克和磷酸二氫鉀0.34克加入到100毫升雙蒸餾水中，其中氨基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸；2、取現(xiàn)有的液體甲型肝炎減毒活疫苗與上述保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻后待用；3、在壓力為15磅、溫度為112℃-115.6℃的條件下滅菌30分鐘后，在37℃的條件下培養(yǎng)7天備用；4、將凍干箱內(nèi)溫度預(yù)先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍干箱內(nèi)，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時后，抽真空至8×10-3托時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃后，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0托，并檢測水份含量，當殘余水份≤3％時，升溫至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，并維持7-9小時后，塞上瓶塞，出箱即可，整個凍干過程為25-48小時。
下面對本發(fā)明的試驗條件及方法等技術(shù)細節(jié)作詳細描述1、生產(chǎn)疫苗用毒種及毒種繼代生產(chǎn)疫苗用毒種是已經(jīng)大規(guī)模用于制造甲型肝炎減毒活性疫苗的甲型肝炎減毒活疫苗減毒株——H2株，由中國藥品生物制品檢定所和衛(wèi)生部指定的單位保管、發(fā)放。經(jīng)過衛(wèi)生部批準符合疫苗制造要求的人二倍體細胞(KMB17)繁殖，病毒的繁殖周期為28天。凍干疫苗生產(chǎn)用的病毒代次為7代(H2M20K7)，允許使用的代次為7-14代，即H2M20K7-H2M20K14。
(1)毒種檢定早代毒種、生產(chǎn)用毒種由生產(chǎn)部門、質(zhì)量檢定部門會同檢測。
(2)無菌試驗按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
(3)病毒滴度取毒種樣品，作10倍系列稀釋，取至少三個稀釋度分別接種人二倍體細胞，在35℃培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，用ELISA或免疫熒光等檢定所認可的方法判定結(jié)果。病毒滴度應(yīng)大于6.5logCCID50/ml方可使用。
(4)純毒試驗用甲肝病毒特異性高效價免疫血清及甲肝抗體陰性血清與500-1000logCCID50/ml甲肝病毒等量混合，置于37℃水浴中60分鐘，接種人二倍體細胞，35℃培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，用ELISA或免疫熒光法或其他方法判定，結(jié)果甲肝病毒應(yīng)完全被中和。
(5)外原因子檢查①血吸附試驗每消化一批細胞應(yīng)留5％(不少于500ml)作為細胞對照，觀察細胞至少14天。取其中25％培養(yǎng)瓶于第七天時，用雞、豚鼠紅細胞混合液進行吸附試驗，于4-8℃放置30分鐘后判定，如為陰性，再移至20-25℃放置30分鐘后判定，結(jié)果應(yīng)為陰性。
凡有可疑細胞病變或血吸附試驗可疑陽性者，應(yīng)用同種不同批的細胞，另取10ml接種人和猴傳代細胞，各留一瓶細胞在對照，置于35-37℃觀察14天，結(jié)果應(yīng)為無細胞病變。
②非血吸附病毒檢查在對照細胞觀察結(jié)束后，取10ml細胞培養(yǎng)合并液，接種同種不同批的細胞，另取10ml接種人和猴傳代細胞，各留一瓶細胞作對照，置于35-37℃觀察14天，結(jié)果應(yīng)為無細胞病變。
③病毒液外原因子檢查取純毒試驗中和后的病毒液接種人、猴傳代細胞及同種不同批的人二倍體細胞，各設(shè)未接種的細胞作對照，觀察14天。若未證明有外源因子，并在觀察期間因非特異性原因廢棄的細胞不超過20％，試驗為通過。
④猴體試驗每早代毒種、生產(chǎn)用毒種批做猴體試驗。取HAV抗體陰性，ALT指標正常，體重1.5-4.5kg的健康恒猴或紅面猴5只，于下肢靜脈注射1.0ml毒種樣品。猴體于0、4、8周肝穿做組織病理檢查。0、2、4、6、8周采血檢測ALT及HAV抗體。
判定符合下列情況者判定合格。
a、至少4只猴血抗體陽轉(zhuǎn)；b、血清ALT有一過性(1周次)升高者超過2只猴；c、肝組織無與接種樣品有關(guān)的病理改變。
有下列情況者應(yīng)重試a、接種猴抗體陽轉(zhuǎn)率低于4/5；b、抗體陽轉(zhuǎn)率前后兩周內(nèi)血清ALT異常升高超過兩周次；d、試驗猴不能排除其它原因所致的肝組織病理改變。
重試方法與初試相同，重試后仍出現(xiàn)上述情況之一者，判定不合格。
⑤免疫原性檢測每代生產(chǎn)用毒種制備的首批疫苗，按常規(guī)接種甲肝易感染者，于免疫前、免疫后6-8周采血，血清抗體陽轉(zhuǎn)率不應(yīng)低于95％，可供分析人數(shù)不少于40人。如不合格，該批生產(chǎn)用毒種及所制備的疫苗均應(yīng)廢棄。
2、疫苗制造(1)人二倍體細胞所用細胞為衛(wèi)生部批準的人二倍體細胞株，如KMB17等人二倍體細胞株。二倍體細胞傳代，使用及檢定按《中國生物制品規(guī)程》“人二倍體細胞建株，檢定及制備疫苗規(guī)程”中“B二倍體細胞用于疫苗生產(chǎn)的要求”進行。
(2)培育方法取生產(chǎn)用毒種按一定比例稀釋，接種于人二倍體細胞，35℃培養(yǎng)至病毒增殖高峰期間，洗換培養(yǎng)液。疫苗液經(jīng)過凍融及超聲波等后處理即可。
3、配制保護劑將保護劑各組份按常規(guī)方法配制成溶液后，15磅高壓滅菌30分鐘后，在37℃的溫度條件下培養(yǎng)7天備用。
4、疫苗凍干取上述檢測合格的液體疫苗按體積比1∶1的比例加入保護劑，混合均勻后及時在冰浴中進行分裝，每只西林瓶中裝1ml混合液，然后采用適宜的凍干工藝進行凍干處理后即可。
5、產(chǎn)品的檢驗(1)物理檢驗產(chǎn)品應(yīng)為白色疏松體，溶解后應(yīng)為無色透明、澄清無異物的液體。
(2)殘余水份含量≤3％。
(3)無菌檢查按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行，成品不做支原體檢查。
(4)病毒滴定及穩(wěn)定性試驗每批凍干疫苗，取3-5支樣品混合進行病毒滴定，再取3-5支放37℃7天，與前者同時進行病毒滴定。置于37℃下放7天后滴度下降不得超過1個logCCID50/ml，疫苗滴度不得低于logCCID50/ml。
(5)安全試驗用1-16g小白鼠4只，每只腹腔注射1ml，注射后應(yīng)密切觀察，30分鐘內(nèi)不應(yīng)有異常反應(yīng)，觀察3天應(yīng)健康存活。
(6)殘余牛血清蛋白含量測定用檢定所認可的方法測定，殘余牛血清蛋白含量應(yīng)≤50ng/ml。
實施例1(1)按下列組分配制保護劑溶液(W/V)
海藻糖 2克 賴氨酸 0.5克明 膠 0.2克 人白蛋白1克NaCl0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克雙蒸餾水100毫升上述配制好的保護劑溶液在壓力為15磅、溫度為112℃條件下高壓下滅菌30分鐘后，在37℃的條件下培養(yǎng)7天后待用。
(2)在100級超凈臺內(nèi)將液體甲型肝炎減毒活疫苗與配制好的保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻后，分裝在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1ml。
(3)將凍干箱內(nèi)溫度預(yù)先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍干箱內(nèi)，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時后，抽真空至8×10-3托時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃后，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0托，并檢測水份含量，當殘余水份≤3％時，將溫度高至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，并維持7-9小時后，塞上瓶塞，出箱即可。整個凍干過程持續(xù)48小時。
實施例2(1)按下列組分配制保護劑溶液(W/V)海藻糖 6克 精氨酸 1克明 膠 0.5克人白蛋白 0.8克NaCl0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克雙蒸餾水100毫升上述配制好的保護劑溶液在壓力為15磅、溫度為115.6℃條件下高壓下滅菌30分鐘后，在37℃的條件下培養(yǎng)7天后待用。
(2)在100級超凈臺內(nèi)將液體甲型肝炎減毒活疫苗與配制好的保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻后，分裝在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1毫升。
(3)將凍干箱內(nèi)溫度預(yù)先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍干箱內(nèi)，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時后，抽真空至8×10-3托時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃后，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0托，并檢測水份含量，當殘余水份≤3％時，將溫度高至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，并維持7-9小時后，塞上瓶塞，出箱即可。整個凍干過程持續(xù)48小時。
實施例3(1)按下列組分配制保護劑溶液(W/V)海藻糖 14克 甘氨酸 4克明 膠 0.8克 人白蛋白0.4克NaCl 0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克雙蒸餾水 100毫升上述配制好的保護劑溶液在壓力為15磅、溫度為113℃的條件下高壓下滅菌30分鐘后，在37℃的條件下培養(yǎng)7天后待用。
(2)在100級超凈臺內(nèi)將液體甲型肝炎減毒活疫苗與配制好的保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻后，分裝在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1毫升。
(3)將凍干箱內(nèi)溫度預(yù)先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍干箱內(nèi)，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時后，抽真空至8×10-3托時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃后，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0托，并檢測水份含量，當殘余水份≤3％時，將溫度高至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，并維持7-9小時后，塞上瓶塞，出箱即可。整個凍干過程持續(xù)48小時。
上述實施例給出了本發(fā)明的優(yōu)選操作條件，但本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容不受實施例的局限。表1凍干劑型與液體劑型的甲肝減毒活性疫苗在45℃下感染性滴度變化疫苗批號 45℃0天 45℃1天 45℃3天(logCCID50/ml) (logCCID50/ml)(logCCID50/ml)960112 6.836.8 5.33960112液體苗6.835.17 ＜4.0960122 7.0 7.0 5.83960122液體苗7.0 5.5 ＜4.0960227 7.5 7.33 6.17960227液體苗7.5 6.33 ＜4.0表2凍干劑型與液體劑型甲肝減毒活性疫苗在37℃下感染性滴度變化單位(logCCID50/ml)疫苗批號 0天 2天 5天 7天 10天 14天 21天 30天9607036.7 6.7 6.67 6.7 6.33 6.17 5.83 4.59607036.7 6.7 6.33 5.83 5.55.04.5 ＜3.0(液體苗)9607047.0 7.0 7.0 6.8 6.67 6.56.17 5.09607047.0 7.0 6.83 6.33 6.05.77 5.0 3.67(液體苗)9607056.67 6.67 6.67 6.7 6.33 6.17 5.83 ＜4.09607056.67 6.67 6.5 5.83 5.17 4.0＜3.0＜3.0(液體苗)9703167.67 7.67 7.7 7.6 7.33 7.05.83 ＜4.09703167.67 7.67 7.5 6.77 6.04.33 ＜3.0＜3.0(液體苗)9706246.0 6.0 6.0 5.83 5.55.04.0 ＜3.09706246.0 6.0 6.0 5.17 4.53.5＜3.0＜3.0(液體苗)9708216.5 6.5 6.5 6.33 6.05.54.17 ＜3.09708216.5 6.5 6.33 5.5 4.46 3.5＜3.03.0(液疫苗)9709116.83 6.83 6.77 6.77 6.33 6.04.5 ＜3.09709116.83 6.83 6.5 5.67 4.53.5＜3.0＜3.0(液體苗)表3凍干劑型與液體劑型甲肝減毒活性疫苗在室溫下感染性滴度變化單位(logCCID50/ml)疫苗批號0周 2周 4周 8周 12周960703 6.7 6.7 6.7 6.33 5.0960703 6.7 6.175.334.0 ＜3.0(液體苗)960704 7.0 7.0 7.0 6.5 5.0960704 7.0 6.676.0 5.0 4.0(液體苗)960705 6.67 6.676.676.5 5.33960705 6.67 6.175.5 4.5 3.0(液體苗)970316 7.67 7.677.5 7.5 6.0970316 7.67 7.676.775.5 4.0(液體苗)970911 6.83 6.836.676.5 5.33970911 6.83 6.836.175.0 4.0(液體苗)表4凍干劑型與液體劑型甲肝減毒活性疫苗在2-8℃下感染性滴度變化單位(logCCID50/ml)疫苗批號0天對照 6月 12月 18月 24月960112 6.83 6.836.8 6.77 6.5960112液體苗6.83 6.5 5.23 ＜3.0＜3.0960122 7.0 7.176.83 7.0 7.0960122液體苗7.0 6.675.5 ＜3.0＜3.0960227 7.5 7.677.33 7.5 7.33960227液體苗7.5 7.336.33 4.5 ＜3.0960303 7.17 7.177.0 7.0 7.0960303液體苗7.17 7.336.0 4.67 ＜3.0970316 7.67 7.7 7.67 7.5 7.5970316液體苗7.67 7.5 6.83 4.0 ＜3.表5 對不同批次凍干疫苗接種小白鼠安全性觀察疫苗批次接種數(shù)量(只)不良反應(yīng)數(shù)量(只)不良反應(yīng)率(％)9601125 0 09601125 0 09602275 0 09603035 0 09603205 0 09603165 0 09706245 0 09708215 0 09709115 0 0表6恒猴免疫后抗-HAV總抗體水平
表7恒猴免疫后血清ALT變化疫苗 恒猴數(shù)ALT水平-1 2 4 6810 12液體疫苗15 31±3.2 34±2.2 35±1.7 28±3.1 22±4.7 30±4.1 31±2.8凍干疫苗15 29±3.7 38±1.1 36±1.3 31±3.8 29±3.7 28±3.3 30±2.1空白對照526±1.7 30±3.1 26±2.8 33±3.5 27±2.2 29±2.6 31±1.7表8 恒猴免疫后肝臟病理變化疫苗 恒猴數(shù) 肝臟病理檢測0 4 8 12液體疫苗 15 0 0 0 0凍干疫苗 15 0 0 0 0空白對照 5 0 0 0 0
表9恒猴免疫后排毒情況疫苗 恒猴子 免疫若干天后排毒情況編號24681216182022262830液體疫苗1++ABA B B C B A + -2++AAA B C C A A + +3++ABB B C C A B + +4++ABB B C C B A + -5++AAB B B C B A + -凍干疫苗6++ABB B C C A B + -7++AAA B C C B A - -8++ABA B B C A A - -9++ABB B C C B A + +10 ++ABB B C C B B + +空白對照11 ----- - - - - - - -12 ----- - - - - - - -13 ----- - - - - - - -14 ----- - - - - - - -15 ----- - - - - - - -注+表示陽性A表示1∶10陽性B表示1∶100陽性C表示1∶1000陽性-表示陰性上述試驗表明，凍干疫苗在45℃、37℃及室溫下分別保存1天、7天、28天，其感染性滴度維持不變，而在相同條件下液體疫苗的感染性滴度則明顯下降，凍干疫苗在2-8℃下保存24個月，其感染性滴度無顯著變化，而液體疫苗在6個月后其感染性滴度則明顯下降，到18個月時感染性滴度平均下降2.5-3.0logCCID50/ml。這說明凍干疫苗的穩(wěn)定性明顯高于液體疫苗。此外，小鼠、猴體試驗證明凍干甲型肝炎減毒活疫苗具有良好的安全性和免疫效果。
權(quán)利要求
1.一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗，該疫苗包括液體甲型肝炎減毒活性疫苗和凍干保護劑，其特征在于凍干保護劑配方如下(W/V)海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克，磷酸二氫鉀0.34克，雙蒸餾水100毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干甲型肝炎減毒活疫苗，其特征在于其中的氨基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸。
3.一種權(quán)利要求2所述的凍干甲型肝炎減毒活疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟(1)配制凍干保護劑將海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克和磷酸二氫鉀0.34克加入到100毫升雙蒸餾水中，其中的氨基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸；(2)取現(xiàn)有的液體甲型肝炎減毒活疫苗與上述保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻后待用；(3)在壓力為15磅、溫度為112℃-115.6℃的條件下滅菌30分鐘后，在37℃的條件下培養(yǎng)7天備用；(4)將凍干箱內(nèi)溫度預(yù)先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍干箱內(nèi)，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時后，抽真空至8×10-3托時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃后，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0托，并檢測水份含量，當殘余水份≤3％時，升溫至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，并維持7-9小時后，塞上瓶塞，出箱即可，整個凍干過程為25-48小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法,屬于病毒性疫苗的醫(yī)用生物制品。它包括液體甲型肝炎減毒活性疫苗和凍干保護劑,凍干保護劑由海藻糖,氨基酸,明膠,人白蛋白,氯化鈉,氯化鉀,磷酸氫鈉,磷酸二氫鉀,雙蒸餾水組成,并經(jīng)過與之相適應(yīng)的凍干工藝處理制得。該疫苗穩(wěn)定性好,可在2—8℃的條件下有效保存1—2年。
文檔編號A61K9/19GK1247091SQ9911503
公開日2000年3月15日 申請日期1999年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月22日
發(fā)明者胡云章, 邵聰文, 譚順革, 金煒翔, 侯宗柳, 何繼紅, 姬秋彥, 陳洪波, 任麗萍, 龍潤?quán)l(xiāng) 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所