專利名稱：靶向HIV-1特異siRNA生物納米粒及其制備和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種具有Hiv-I特異基因沉默作用的SiRNA生物納米粒，本發(fā)明還涉及所述生物納米粒的制備方法，以及在制備防治艾滋病藥物方面的應用。
背景技術(shù)：
基因治療是當前艾滋病治療的新方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)又稱為依賴于RNA的基因沉默機制，是通過雙鏈RNA (double-strand RNA, dsRNA)特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA表達的現(xiàn)象。即在胞質(zhì)中，雙鏈RNA引發(fā)了同源mRNA的降解，故也被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene-silencing, PTGS)。RNAi治療AIDS的研究現(xiàn)狀
siRNAs或miRNAs可以特異地結(jié)合靶mRNA，弓I起靶mRNA降解或翻譯抑制，最終導致基因特異性沉默。RNAi技術(shù)很可能為抗HIV治療的研究打開突破口?；虺聊悬c的確立HIV-I基因組編碼區(qū)由9個開放讀框組成，包括3個結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env),2個調(diào)節(jié)基因(tat、rev)和4個輔助基因(vif、vpr、vpu、nef )。非結(jié)構(gòu)基因曾被認為不是HIV-I病毒復制所必需的“非必需基因”，但是近年來越來越多的研究表明HIV-I的非結(jié)構(gòu)基因在病毒的致病機理、感染性、潛伏上都有著重要的作用，因此本發(fā)明將非結(jié)構(gòu)基因作為抗病毒治療的靶點。HIV-ITat蛋白不僅參與反式激活病毒的表達，還參與AIDS相關(guān)疾病的病理機理，如神經(jīng)毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-I的病毒復制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以與Rev應答元件(Rev response element, RRE)結(jié)合,介導未拼接和不完全拼接的mRNA從胞核向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運，促進病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶的合成，引發(fā)HIV基因表達由早期向晚期的轉(zhuǎn)換。Vpr可以在病毒復制的早期，反式激活HIV-1LTR，促進病毒基因的表達；介導和增強整合前復合體的核轉(zhuǎn)運；改變細胞基因的表達，誘導細胞周期G2/M期阻滯及細胞凋亡。病毒感染因子(Viral Infectivity Factor,Vif)可以抵抗載脂蛋白 B mRNA 編輯酶催化多妝樣蛋白 3G(human protein apoliproteinB mRNA-editingenzyme-catalytic polypeptide-1 ike~3G, AP0BEC3G)的抗病毒活性，增強 HIV-1 毒粒的感染力。研究顯示，HIV的gag和nef基因均可以通過RNAi進行沉默，RNAi方法治療艾滋病已經(jīng)成為艾滋病治療研究的熱點，研究顯示通過RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV復制。但其技術(shù)本身仍存siRNA穩(wěn)定性差、容易降解、無靶向性等問題。以重組病毒載體方式導入的siRNA雖然穩(wěn)定性較高，但是又帶來導入效率及載體基因整合等問題。人間充質(zhì)干細胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)具有多向分化潛能，自身免疫原性低，取材方便。目前美國FDA已經(jīng)批準其用于自身免疫疾病及基因治療載體等多個方面的臨床試驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出針對HIV-I非結(jié)構(gòu)基因vpr，tat, vif, rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并將這些siRNAs序列構(gòu)建到慢病毒載體，在干細胞及其他傳代細胞中進行表達，制備一種含有對HIV特異性沉默的SiRNA的生物顆粒，以用于制備預防和治療艾滋病的藥物。本發(fā)明提供了一種靶向Hiv-I特異性SiRNA慢病毒為載體間充質(zhì)干細胞內(nèi)表達的siRNA生物納米粒，經(jīng)體外HIV活病毒攻擊實驗證實，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治療。本發(fā)明有如下創(chuàng)新點其一，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因vpr，tat, vif, rev基因沉默的6個siRNAs序列本發(fā)明人針對HIV-I病毒基因組的vpr, tat, rev, vif基因的保守區(qū)域設計了 14條干擾RNA序列，經(jīng)實驗篩選，發(fā)現(xiàn)其中以下6條siRNA序列可以特異地靶向HIV-lvpr， tat, vif,rev
靶向siRXAs序列名稱卬列兮序列
vprVpr—sh4SEQ ID MO: I gagtgaagc t gt tagacat
tatTat-1x4SEQ II) NO;2 gtgttgctttcattgccaa
Tal、rev tat and rev-1x6 SEQ ID NO:3 gacicaicaagcticicia
revrev-Ixl ISKQ ID XO:4 ggtggaatctcctacagta
￥ifvilMSEQ ID NO:5 tatcaagcaggacataaca
VifVif-2SEQ ID NO:6 agagactggcatttgggtc其二，本發(fā)明構(gòu)建了含有HIV env基因的重組慢病毒載體，篩選到能夠穩(wěn)定表達HIV跨膜蛋白gpl20和gp41的hMSC-env細胞系。該細胞系的名稱為XXXX，已于年月日保藏于XXXX，保藏號為XXXX所述細胞系可用于制備siRNA的生物納米粒。由于gpl20蛋白對⑶4分子具有親和性，使制備的siRNA生物納米粒具有靶向性。其三，本發(fā)明制備了一種含有HIV特異性siRNA的間充質(zhì)干細胞生物納米粒該生物納米粒載有上述靶向HIV-I特異性siRNA，所述siRNA的序列如上表所示的SEQID NO:I SEQ ID NO:6。該生物納米粒還具有以下特征I)大小在 10_500nm 之間；2)具有人間充質(zhì)干細胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜；3)鑲嵌病毒的膜蛋白gpl20。本發(fā)明在人CD4+T淋巴細胞和人造血干細胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中檢測了獲得的生物納米粒對HIV活病毒的抑制效率。經(jīng)此實驗證實，該生物納米粒可作為藥物直接用于治療和預防艾滋病。其五，本發(fā)明提供了上述含有HIV特異性siRNA的間充質(zhì)干細胞生物納米粒的制備方法
方法是將含有上述siRNA序列(I 6個)的雙鏈DNA構(gòu)建到永久性表達目的基因的重組慢病毒載體中，在293T細胞中包裝出重組慢病毒；用收獲的重組病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素篩選出表達siRNA的hMSC細胞系，經(jīng)篩選表達siRNA的hMSC細胞系可以持續(xù)高效的表達siRNA ;體外連續(xù)收獲細胞培養(yǎng)液，超速離心濃縮，獲得含有siRNA的生物納米粒。本發(fā)明的優(yōu)點和效果本發(fā)明結(jié)合siRNA的高效性和hMSC的低免疫原性，在提高siRNA的穩(wěn)定性的同時避免載體整合帶來的安全性問題。具體而言，選用針對HIV特異性的siRNA，以攜帶特異性的siRNA重組慢病毒將其導入到永生化的間充質(zhì)細胞中，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復制，以吐胞的形式將帶有永生化間充質(zhì)細胞膜的siRNA生物納米粒分泌到細胞外，經(jīng)過濃縮純化后，用于HIV-I的基因治療。本發(fā)明方法提供的含有HIV特異性siRNA的生物顆粒具有以下優(yōu)點
I、提高了穩(wěn)定性利用生物膜包被的方式提高了 siRNA的穩(wěn)定性；2、提高了安全性，適用范圍廣本方法與現(xiàn)有技術(shù)的病毒載體導入方式相比又大大提高了安全性。其中間充質(zhì)干細胞制備的顆粒具有較為廣泛的組織親和性，同時免疫原性較低，從而適用范圍更加廣泛;3、更具有靶向性針對siRNA無靶向性的問題，本發(fā)明還構(gòu)建了穩(wěn)定表達HIV-1gp 120蛋白的永生化的間充質(zhì)細胞株，由于gpl20蛋白對CD4分子具有親和性使得制備的siRNA生物顆粒具有靶向性。4、可抑制HIV活病毒本發(fā)明在人CD4+T淋巴細胞和人造血干細胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中檢測了獲得的生物納米粒對HIV活病毒的抑制效率，證實了其可直接作為防治艾滋病的藥物，以及在HIV基因治療方面具有的其它潛在價值。


圖I是siRNA/miRNA真核表達載體結(jié)構(gòu)圖；A: siRNA/miRNA 真核表達載體 pSR-GFP/Neo ；B siRNA/miRNA 真核表達載體 pcDNA6. 2Gff/EmGFP-miR)；圖2為倒置熒光顯微鏡下觀察vpr特異性siRNA對GFP-Vpr融合蛋白表達的抑制情況；圖3為流式細胞儀檢測vpr特異性siRNA對GFP-Vpr融合蛋白表達的抑制作用，圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為siRNA樣品編號；圖4為實時熒光定量PCR技術(shù)對vpr mRNA拷貝數(shù)進行相對定量；圖5為vpr特異性siRNA抑制假病毒在TZMBL細胞中的感染力(圖中點為藍斑)；圖6為倒置突光顯微鏡下觀察vpr特異性miRNA對Vpr_dsRed融合蛋白表達的抑制作用，圖中control中細胞發(fā)出紅色熒光；
圖7為倒置熒光顯微鏡下觀察tat特異性siRNA對Tat-dsRed融合蛋白表達的抑制作用，圖中亮點為細胞發(fā)出的紅色熒光；圖8為流式細胞儀檢測tat特異性siRNA對Tat-dsRed融合蛋白表達的抑制作用圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為siRNA樣品編號；圖9為Western Blot檢測tat特異性siRNA對Tat-dsRed融合蛋白表達的抑制作用，圖中上面條帶為tat-red融合蛋白(40KD)，下面條帶為GAPDH蛋白(39KD)；圖10為實時熒光定量PCR技術(shù)對tatmRNA拷貝數(shù)進行相對定量，圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為對照和siRNA樣品編號；圖11為tat特異性siRNA抑制假病毒在TZMBL細胞中的感染力，圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為tat-siRNA樣品編號，白色柱狀圖siRNA量為O. I μ g，灰色圖siRNA量為
O.2μ g ； 圖12為Western Blot檢測tat特異性miRNA對Tat-daRed融合蛋白表達的抑制作用；圖13為構(gòu)建的重組慢病毒plvx-shRNAl和plvx_shRNA2 ；圖14為建立的穩(wěn)定表達siRNA間充質(zhì)干細胞系；生物材料保藏信息保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏物名稱穩(wěn)定表達gpl20和gp41的間充質(zhì)干細胞系hMSC_env保藏編號CGMCCNO. 6707保藏日期2012-10_2具體實施例方式以下實施例中所用的試劑、質(zhì)粒等來源如下
權(quán)利要求
1.一種生物納米粒，含有靶向Hiv-I特異性siRNA，所述SiRNA選自SEQ ID NO: I SEQ ID NO:6所示序列的I 6種。
2.權(quán)利要求I所述的生物納米粒，還具有以下特征 1)大小在10-500nm之間； 2)具有人間充質(zhì)干細胞(HumanMesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜； 3)鑲嵌病毒的膜蛋白gpl20。
3.權(quán)利要求I或2所述的生物納米粒使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因沉默的功能，所述非結(jié)構(gòu)基因選自vpr, tat, vif或rev中的一種或多種。
4.權(quán)利要求I或2所述的生物納米粒在制備治療和預防艾滋病藥物中的應用。
5.權(quán)利要求I所述的生物納米粒的制備方法，將含有SEQID NO: I SEQ ID N0:6所示序列的I 6種的雙鏈DNA構(gòu)建到永久性表達目的基因的重組慢病毒載體中，在293T細胞中包裝出重組慢病毒；用收獲的重組病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素篩選出表達siRNA的hMSC細胞系，經(jīng)篩選表達siRNA的hMSC細胞系可以持續(xù)高效的表達siRNA ;體外連續(xù)收獲細胞培養(yǎng)液，超速離心濃縮，獲得含有siRNA的生物納米粒。
6.SEQ ID NO: I SEQ ID NO:6 所示序列的 siRNAs。
7.權(quán)利要求6所述siRNAs的功能，是使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因沉默，每個siRNA針對的靶向HIV-I非結(jié)構(gòu)基因如下所示
8.一種可表達HIV-I跨膜蛋白gpl20hMSC-env細胞系，名稱為hMSC-env，保藏編號為CGMCC NO. 6707。
9.權(quán)利要求8所述細胞系在制備siRNA的生物納米粒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明獲得了一種含有靶向HIV-1特異性siRNA的生物納米粒，該生物納米粒具有HIV-1特異基因沉默作用。所述siRNA選自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列的1～6種。本發(fā)明在人CD4+T淋巴細胞和人造血干細胞(Human Hematopoietic Stem Cell,hHSC)中檢測了獲得的生物納米粒對HIV活病毒的抑制效率，證實了其可直接作為防治艾滋病的藥物。
文檔編號A61P31/18GK102895675SQ20121041050
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者滕智平, 馬晶, 郝彥哲, 楊怡姝, 孫曉梅, 曾毅 申請人:曾毅, 滕智平, 楊怡姝