專利名稱：一種接骨片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種接骨片的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
接骨片記載于衛(wèi)生部標準WS3-B-0402-90，由川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g作為原料藥制成，能散瘀、活血、止痛、用于跌打損傷， 筋傷骨折，瘀血腫痛。
現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有接骨片在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道，而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種接骨片的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種接骨片在制備抑制小鼠白血病細胞NFS-60細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的
一種接骨片的制備方法，由川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成取川芎、當歸、醋炙乳香、醋炙沒藥，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體 積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50。。，CO2流量l_3ml/g生藥· min，萃取時間 150-180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到 D102大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
上述一種接骨片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
上述一種接骨片的制備方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
上述一種接骨片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C， CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間160min。
上述接骨片在制備抑制小鼠白血病細胞NFS-60細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中，接骨片每片O. 5g，每次2片，一日2次，采用本發(fā)明制備成的接骨片每片O. 5g，每次僅需I片，一日服用2次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。 此結(jié)論可以通過下述試驗證明。
試驗一、不同方法制備的接骨片中阿魏酸含量的比較
1、儀器及試藥本發(fā)明接骨片按實施例3方法制備，使用195g原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。原接骨片，按部頒標準方法制備，使用195g原料藥，經(jīng)提取制成 1000片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
2、方法
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數(shù)按阿魏酸峰計算，應(yīng)不低于3000。
對照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時的阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本發(fā)明接骨片和原接骨片，研細，混勻，取lg，精密稱定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超聲處理10分鐘，離心，取上清液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。
3、結(jié)果
結(jié)果表明，本發(fā)明接骨片中阿魏酸的含量為2. 34mg/片；而原接骨片中阿魏酸的含量為O. 65mg/片，在服用量減少的情況下，阿魏酸含量有很大提高。
上述研究表明，采用本發(fā)明制備的接骨片，有效成分含量高于部頒標準法制備的接骨片。
具體實施方式

以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1
取川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g，將川芎、當歸、醋炙乳香、醋炙沒藥，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度301，0)2流量lml/g生藥·π η，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D102 大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥， 得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒， 干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
經(jīng)檢測，成品中阿魏酸的含量為2. 55mg/片。
實施例2
取川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g，將川芎、當歸、醋炙乳香、醋炙沒藥，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥· min，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D102 大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒， 干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
經(jīng)檢測，成品中阿魏酸的含量為2. 54mg/片。
實施例3
取川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g，將川芎、當歸、醋炙乳香、醋炙沒藥，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥· min，萃取時間160min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D102 大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥， 得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒， 干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
經(jīng)檢測，成品中阿魏酸的含量為2. 34mg/片。
實施例4 :接骨片抑制NFS-60細胞增殖的實驗研究資料
I實驗材料
1.1實驗用細胞株
小鼠白血病細胞(NFS-60)，南京正寬醫(yī)藥科技有限公司實驗室細胞庫， DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
1. 2實驗藥物
研究藥物本發(fā)明接骨片按實施例3方法制備。·
藥液儲液稱取IOOmg接骨片，溶于5ml無水乙醇中，O. 2 μ m濾器過濾，500 μ I doff管分裝，-20°C存儲，同時O. 2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
1. 3實驗試劑
DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419);NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批號2010382);無水乙醇(南京化學試劑有限公司批號080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ;PBS (實驗室自配)；
1. 4實驗器材
萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD 公司型號SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號BT323S);全自動高壓滅菌鍋 (日本SANK)公司型號MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號 DHG9123A);冰箱(西門子公司型號KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號ΚΑ-1000) ;0. 2μπι濾器(MILLIP0RE型號SLGP033RB) ;IOcm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
2實驗方法
I) NFS-60 細胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)， 當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml O. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3X 104個/ml。
2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入接骨片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液) ，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復孔。
7)結(jié)果以藥物對細胞的抑制率表示
細胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
3統(tǒng)計處理
采用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以 mean + S. D.表不。
4實驗結(jié)果
MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對NFS-60細胞增殖抑制有差異(p〈0. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0. 01)，當劑量達到 15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0· 001)。
表I接骨片對NFS-60細胞增殖抑制影響研究(X + SD)
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注與對照組比較，*P〈0.01 ;**Ρ〈0· 001
5實驗結(jié)論
接骨片可以抑制NFS-60細胞增殖，減少NFS-60細胞的細胞生長數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
權(quán)利要求
1.一種接骨片的制備方法，由川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成取川芎、當歸、醋炙乳香、醋炙沒藥，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥·π η，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D102大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種接骨片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種接骨片的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率500W， 每次萃取6分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種接骨片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間160min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種接骨片在制備抑制小鼠白血病細胞NFS-60細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種接骨片的制備方法，由川芎39g、制川烏39g、當歸39g、醋炙乳香39g、醋炙沒藥39g、煅自然銅39g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得阿魏酸含量有很大提高，本發(fā)明還提供了接骨片在制備抑制小鼠白血病細胞NFS-60細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K9/20GK102988509SQ20121038890
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:李正梅