專利名稱：一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，涉及一種膠原基質(zhì)，特別涉及一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膠原(collagen)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是人體中含量最豐富的一種結(jié)構(gòu)蛋白，約占機體總蛋白的25% 35%，主要存在于結(jié)締組織中。因為含有高含量的膠原蛋白，結(jié)締組織具有一定的結(jié)構(gòu)與機械力學(xué)性質(zhì)，如張力強度、拉力、彈力等以達到支撐、保護的功倉泛。膠原具有良好的生物相容性、營養(yǎng)性、修復(fù)性、保濕性、配伍性和親和性，所以被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料、化妝品、食品及保健品等功能性產(chǎn)品。膠原蛋白具有美容(防皺、保 濕、美白、減肥、豐胸)、預(yù)防骨質(zhì)疏松、改善關(guān)節(jié)健康、改善血液循環(huán)、健胃、提高人體免疫力等功效。皮膚是人體最大的器官，約占人體重量的16%，由表及里可依次分為表皮層、真皮層以及皮下組織三個部分。真皮層是一種致密的結(jié)締組織，厚約O. 6 3_，主要是由膠原、彈性蛋白、以及蛋白多糖等物質(zhì)構(gòu)成。真皮層對皮膚的彈性和機械完整性具有重要作用。由于各種各樣的損傷造成的皮膚真皮層的缺損，使得組織中的膠原也大量流失，因此以膠原為原料制備各種傷口敷料和組織工程皮膚引起了人們的極大關(guān)注。已經(jīng)商品化的人工皮膚Integra、Apligraft等都含有膠原成分?；A(chǔ)研究表明為創(chuàng)面提供合適的濕潤環(huán)境有利于傷口的愈合。研究還表明人工皮膚具有類似天然皮膚的機械性能，可以促進傷口的愈合。因此新型基質(zhì)應(yīng)該具有和人體皮膚類似的機械性能，同時又可以保持創(chuàng)面的濕潤。純膠原基質(zhì)具有生物相容性好、易加工、可塑形并能促進細(xì)胞吸附、增殖等優(yōu)點，但也存在力學(xué)性能差，含水時難以塑形，無法支撐組織重建等不足。基礎(chǔ)研究表明膠原基質(zhì)為創(chuàng)面提供合適的濕潤環(huán)境有利于傷口的愈合。研究還表明膠原基質(zhì)具有類似天然皮膚的機械性能，可以促進傷口的愈合。因此新型基質(zhì)應(yīng)該具有和人體皮膚類似的機械性能，同時又可以保持創(chuàng)面的濕潤。純膠原基質(zhì)制備的組織工程皮膚具有生物相容性好、易加工、可塑形并能促進細(xì)胞吸附、增殖等優(yōu)點，但也存在力學(xué)性能差，含水時難以塑形，無法支撐組織重建等不足。日常生活中膠原的老化是皮膚出現(xiàn)皺紋的主要原因，膠原的補充對改善老化皮膚機能方面有著不可替代的作用。目前，補充膠原的方式主要有口服、透皮和注射三種，其中口服主要通過食品途徑攝入以保健品為主，在美容上面膜是透皮使用，注射主要用于高端美容。面膜以涂覆和貼敷為主，其中涂覆的膠原持續(xù)時間短，貼敷使用的主要有純膠原膜和復(fù)合膠原膜。由于純膠原膜成本較高，因此尋找性能優(yōu)異成本低的復(fù)合膠原膜顯得尤為重要。近年來，用具有再生能力的材料增強復(fù)合物的機械強度引起了人們的極大關(guān)注，特別是納米微晶纖維素(cellulose nanocrystals, CNCs),因為具有可再生性、生物降解性和顯著的機械性能而成為研究的熱點。CNCs —般是由天然纖維素通過化學(xué)、生物、物理等方法制備的。CNCs既具有纖維素的基本結(jié)構(gòu)與性能又具有納米微粒的一些特性，同時又具有很多優(yōu)異的性能如生物可降解性、高結(jié)晶度、高強度、高親水性、高模量、超精細(xì)結(jié)構(gòu)、無毒性等，在生物醫(yī)用領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法。將膠原與納米微晶纖維素兩種天然有機高分子材料進行復(fù)合，不僅能增強材料的強度和生物活性，還可以充分發(fā)揮生物納米效應(yīng)，有效地彌補純膠原在應(yīng)用上的局限性。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法制備得到的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)。本發(fā)明的再一目的在于提供上述納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，包括如下步驟(I)以纖維素為原料通過硫酸水解法制備納米微晶纖維素。(2)配制質(zhì)量濃度為1% 10%的納米微晶纖維素溶液和質(zhì)量濃度為1% 10%的膠原溶液。(3)將上述納米微晶纖維素溶液和膠原溶液配制成納米微晶纖維素與膠原質(zhì)量比^ 1:10的納米微晶纖維素/膠原混合溶液，將納米微晶纖維素/膠原混合溶液倒入模具中，成型后即得到納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)。步驟(I)中所述的纖維素為植物纖維素或微生物纖維素。步驟(I)中所述的硫酸水解法的條件優(yōu)選為將5 15g纖維素加入到90 150mL濃硫酸中進行反應(yīng)，然后加入去離子水終止反應(yīng)，冷卻后超聲分散，再透析至pH穩(wěn)定(PH7. O左右)，干燥后即得到納米微晶纖維素。所述的硫酸優(yōu)選為質(zhì)量濃度為35% 64%的硫酸；所述的反應(yīng)優(yōu)選為45 50°C恒溫水浴下機械攪拌反應(yīng)4 6h ;所述的去離子水的量優(yōu)選為800 IOOOmL ;所述的超聲分散的條件優(yōu)選為25 35kHz超聲分散30min ;所述的透析優(yōu)選為使用去離子水透析；所述的干燥優(yōu)選為冷凍干燥，其條件優(yōu)選為在-10 _20°C下冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干12 24小時。步驟(2)中所述的納米微晶纖維素溶液和膠原溶液均優(yōu)選使用乙酸溶液為溶劑進行配制；所述的乙酸溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為O. 3% 1%。步驟(2)中所述的納米微晶纖維素溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為1% 3%。步驟(2)中所述的膠原溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為1% 3%。步驟(3)中所述的混勻優(yōu)選為通過機械攪拌I 3h混勻。步驟(3)中所述的模具的材質(zhì)優(yōu)選為玻璃、不銹鋼、耐溶劑塑料或聚四氟乙烯。步驟(3)中所述的成型的方法優(yōu)選為溶劑蒸發(fā)法或冷凍干燥法；所述的溶劑蒸發(fā)法優(yōu)選為使用30 40°C的烘箱進行蒸發(fā)，所述的冷凍干燥法的條件優(yōu)選為在-10 -20°C下冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干12 24小時。一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)通過上述制備方法制備得到。
上述納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)能夠更好地促進傷口的愈合，可應(yīng)用于傷口敷料、組織誘導(dǎo)再生膜、軟組織補片、組織工程皮膚及面膜等領(lǐng)域。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(I)本發(fā)明所制備的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)，其突出特點是采用納米微晶纖維素增強膠原基質(zhì)，制備復(fù)合基質(zhì)，通過改變納米微晶纖維素的質(zhì)量百分比和成型方法，可以得到具有特定機械強度、宏觀結(jié)構(gòu)(三維支架、膜)和微結(jié)構(gòu)(孔徑、孔隙率等)的復(fù)合基質(zhì)；(2)溶脹性能測試表明納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)具有優(yōu)異的液體吸收能力，吸水率高達500% ;機械性能測試表明該復(fù)合基質(zhì)的機械強度與純膠原支架相比有顯著 的提高(30%);細(xì)胞實驗結(jié)果表明該復(fù)合基質(zhì)能夠有效地促進成纖維細(xì)胞的粘附和增殖，具有良好的細(xì)胞相容性。(3)本發(fā)明制備工藝簡單，材料來源廣泛，生產(chǎn)效率高，適合于不同需求的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)。


圖I是5wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜的宏觀形貌圖。圖2是5wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜的掃描電鏡圖,a為表面的掃描電鏡圖，b為斷面形貌的掃描電鏡圖。圖3是10wt%CNCs增強膠原復(fù)合支架的宏觀形貌圖。圖4是10wt%CNCs增強膠原復(fù)合支架的掃描電鏡圖，a為表面的掃描電鏡圖，b為斷面形貌的掃描電鏡圖。圖5是不同百分比CNCs增強膠原復(fù)合膜溶脹性能曲線圖。圖6是不同百分比CNCs增強膠原復(fù)合膜的應(yīng)力-應(yīng)變圖。圖7是成纖維細(xì)胞(3T3)在5wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜上培養(yǎng)3天的后的SEM圖。圖8是不用材質(zhì)模具制備的復(fù)合膜掃描電鏡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例I將15g棉花纖維素加入到150mL 64%w/w的濃硫酸中，在45°C的恒溫水浴中，機械攪拌反應(yīng)6小時，加入800mL去離子水終止反應(yīng)，冷卻后超聲(35kHz)分散30min，去離子水透析3天后，在_20°C下冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干12小時即制得納米微晶纖維素(cellulose nanocrystals, CNCs)。使用質(zhì)量濃度為O. 3%的醋酸溶液為溶劑配制質(zhì)量濃度均為1%的CNCs溶液和膠原溶液；取O. 5g上述CNCs溶液滴入到9. 5g上述膠原溶液中，機械攪拌2小時得到CNCs溶液含量為5%w/w的CNCs/膠原混合溶液，然后將混合液倒入聚四氟乙烯模具中，放入35°C的烘箱，溶劑蒸發(fā)成型后即制得5wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜。該CNCs增強膠原復(fù)合膜的宏觀形貌圖如圖I所示，其表面及斷面形貌的掃描電鏡圖如圖2所
/Jn ο
實施例2將市售細(xì)菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)，再將膜浸泡于O. 5mol/L的NaOH溶液，90°C煮20min或以上，冷卻，放置在去離子水中反復(fù)浸泡至中性，冷凍干燥后得到細(xì)菌纖維素固體。取5g干燥的細(xì)菌纖維素，加入到IOOmL質(zhì)量百分比35%的硫酸中，50 V恒溫水浴反應(yīng)4小時，加入800mL去離子水終止反應(yīng)，冷卻后超聲(35kHz)分散30min，去離子水透析3天，干燥后即得到納米微晶纖維素(cellulosenanocrystals, CNCs)。使用質(zhì)量濃度為1%的醋酸溶液為溶劑配制質(zhì)量濃度均為3%的CNCs溶液和膠原溶液；取Ig上述CNCs溶液滴入到9g上述膠原溶液中，機械攪拌2小時得到CNCs溶液含量為10%w/w的CNCs/膠原混合溶液，然后把混合液加入到不銹鋼模具中，-10°C冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干36h，得到10wt%CNCs增強膠原復(fù)合支架。該CNCs增強膠原復(fù)合支架的宏觀形貌圖如圖3所不,其表面及斷面形貌的掃描電鏡圖如圖4所不。實施例3
采取實施例I中硫酸降解棉花纖維素的方法制得納米微晶纖維素(cellulosenanocrystals, CNCs)。用質(zhì)量濃度為O. 5%的醋酸溶液為溶劑配制質(zhì)量濃度均為2%的CNCs溶液和膠原溶液；分別取不同體積的上述CNCs溶液滴入到上述膠原溶液中，機械攪拌2小時得到CNCs溶液含量分別為1 丨％、3被％、5被％、7被％和10wt%的CNCs/膠原混合溶液，然后將混合液倒入聚四氟乙烯模具中，放入40°C的烘箱，溶劑蒸發(fā)成型后即制得lwt%、3wt%、5被％、7被％和10wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜。采用稱重法測定復(fù)合膜的溶脹率，結(jié)果如圖5所示。采用力學(xué)強度試驗機(Instr0n5543)，每組5個平行樣，測定復(fù)合膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，結(jié)果如圖6所示。將上述一系列CNCs增強膠原復(fù)合膜采用75%乙醇消毒，放在超凈臺上晾干，然后放入24孔板中加入ImL培養(yǎng)基過夜，第二天將培養(yǎng)基吸去，每孔加入5 X IO4成纖維細(xì)胞(3T3)，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)1、3、5、7天后考察3T3細(xì)胞在不同膜上的粘附和增殖行為，結(jié)果表明CNCs增強的膠原復(fù)合膜能夠有效地促進成纖維細(xì)胞的粘附和增殖，具有良好的細(xì)胞相容性。圖7是3T3成纖維細(xì)胞在5wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜表面培養(yǎng)3天的后的SEM圖。實施例4采取實施例I中硫酸降解棉花纖維素的方法制得納米微晶纖維素(cellulosenanocrystals, CNCs)。用質(zhì)量濃度為0. 3%的醋酸溶液為溶劑配制質(zhì)量濃度均為1%的CNCs溶液和膠原溶液；取0. 3mL上述CNCs溶液滴入到9. 7mL上述膠原溶液中，機械攪拌2小時，得到CNCs溶液含量為3%的CNCs/膠原混合溶液，然后將混合液倒入不同材質(zhì)的模具中，放入30°C的烘箱，溶劑蒸發(fā)成型后即制得3wt%CNCs增強膠原復(fù)合膜。通過電鏡觀察(圖8表示不同材質(zhì)模具制備的復(fù)合膜掃描電鏡圖，a聚四氟乙烯模具、b玻璃模具、c不銹鋼模具)，可以看到與玻璃模具和聚四氟乙烯模具相比，不銹鋼模具制備的膠原復(fù)合膜孔較大；用聚四氟乙烯模具制得的復(fù)合膜表面較為平整光滑。實施例5將市售細(xì)菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)，再將膜浸泡于0. 5mol/L的NaOH溶液，90°C煮20min或以上，冷卻，放置在去離子水中反復(fù)浸泡至中性，冷凍干燥后得到細(xì)菌纖維素固體。取5g干燥的細(xì)菌纖維素，加入到IOOmL質(zhì)量百分比35%的硫酸中，50 V恒溫水浴反應(yīng)4小時，加入800mL去離子水終止反應(yīng)，冷卻后超聲(35kHz)分散30min，去離子水透析3天，干燥后即得到納米微晶纖維素(cellulosenanocrystals, CNCs)。使用質(zhì)量濃度為1%的醋酸溶液為溶劑配制質(zhì)量濃度均為3%的CNCs溶液和膠原溶液；取0. 5g上述CNCs溶液滴入到9. 5g上述膠原溶液中，機械攪拌2小時得到CNCs溶液含量為5wt%的CNCs/膠原混合溶液，然后把混合液加入到不銹鋼模具中，_20°C冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干36h，得到5wt%CNCs增強膠原復(fù)合支架。將上述復(fù)合支架采用75%乙醇消毒，放在超凈臺上晾干，備用。將該復(fù)合支架植入大鼠背部創(chuàng)面模型，體內(nèi)實驗結(jié)果顯示復(fù)合支架可以促進創(chuàng)面愈合。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)以纖維素為原料通過硫酸水解法制備納米微晶纖維素； (2)配制質(zhì)量濃度為1% 10%的納米微晶纖維素溶液和質(zhì)量濃度為1% 10%的膠原溶液； (3)將上述納米微晶纖維素溶液和膠原溶液配制成納米微晶纖維素與膠原 質(zhì)量比^ 1:10的納米微晶纖維素/膠原混合溶液，將納米微晶纖維素/膠原混合溶液倒入模具中，成型后即得到納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于 步驟(I)中所述的纖維素為植物纖維素或微生物纖維素； 步驟(I)中所述的硫酸水解法的條件為將10 15g纖維素加入到100 150mL濃硫酸中進行反應(yīng)，然后加入去離子水終止反應(yīng)，冷卻后超聲分散，再透析至PH穩(wěn)定，干燥后即得到納米微晶纖維素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于 所述的硫酸為質(zhì)量濃度為35% 64%的硫酸；所述的反應(yīng)為45 50°C恒溫水浴下機械攪拌反應(yīng)4 6h ;所述的去離子水的量為800 IOOOmL ;所述的超聲分散的條件為25 35kHz超聲分散30min ;所述的透析為使用去離子水透析；所述的干燥為冷凍干燥，其條件為在-10 _20°C下冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干12 24小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于 步驟(2)中所述的納米微晶纖維素溶液和膠原溶液均使用乙酸溶液為溶劑進行配制； 步驟(2)中所述的納米微晶纖維素溶液的質(zhì)量濃度為1% 3% ； 步驟(2)中所述的膠原溶液的質(zhì)量濃度為1% 3%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于 所述的乙酸溶液的質(zhì)量濃度為O. 3% 1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于 步驟(3)中所述的混勻為通過機械攪拌I 3h混勻； 步驟(3)中所述的模具的材質(zhì)為玻璃、不銹鋼、耐溶劑塑料或聚四氟乙烯； 步驟(3)中所述的成型的方法為溶劑蒸發(fā)法或冷凍干燥法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)的制備方法，其特征在于 所述的溶劑蒸發(fā)法為使用30 40°C的烘箱進行蒸發(fā)； 所述的冷凍干燥法的條件為在-10 -20°C下冷凍過夜，然后放入凍干機中凍干12 24小時。
8.—種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)，其特征在于由權(quán)利要求I 7任一項所述的制備方法制備得到。
9.權(quán)利要求8所述的納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)在傷口敷料、組織誘導(dǎo)再生膜、軟組織補片、組織工程皮膚和/或面膜領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米微晶纖維素增強膠原復(fù)合基質(zhì)及其制備方法與應(yīng)用，屬于組織工程領(lǐng)域。制備方法包括以下步驟采取硫酸降解纖維素的方法制得納米微晶纖維素取纖維素(CNCs)；配制CNCs溶液和膠原溶液，將兩種進行物理混合；然后將混合液倒入模具中，成型后即得到CNCs增強膠原復(fù)合基質(zhì)。本發(fā)明所獲得的CNCs增強的膠原復(fù)合基質(zhì)，克服了現(xiàn)有膠原材料機械強度差，親水性差的問題，可應(yīng)用于傷口敷料、組織誘導(dǎo)再生膜、軟組織補片、組織工程皮膚和面膜等領(lǐng)域。本發(fā)明的制備過程工藝簡單可行，重復(fù)性好，適合于不同需求的CNCs增強膠原復(fù)合基質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號A61L27/60GK102886063SQ201210356539
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者張淵明, 郭瑞, 李衛(wèi)昌 申請人:暨南大學(xué)