專利名稱：一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寡糖，涉及一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法，該寡糖利用菌株與龍須菜的共培養(yǎng)制備而成，具有抗氧化、防紫外線等生理活性。
背景技術(shù)：
寡糖是指由2 20個(gè)相同或不同單糖構(gòu)成的直鏈或支鏈低度聚合糖類物質(zhì)，又稱低聚糖，包括普通寡糖和功能性寡糖兩大類。普通寡糖中有人們熟悉的蔗糖、麥芽糖、乳糖等，這些糖可以被機(jī)體消化吸收，對(duì)腸道有益菌并無生長(zhǎng)促進(jìn)作用，另一類是功能性寡糖，例如果寡糖、低聚木糖、大豆低聚糖、殼寡糖、瓊膠寡糖、褐藻膠寡糖等，它們本身不能被機(jī)體消化吸收，但具有多種生理活性，在食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的市場(chǎng)空間。 海藻寡糖近年來被發(fā)現(xiàn)具有重要的生理活性，其中來自江籬、石花菜等紅藻的瓊膠寡糖研究得較為廣泛。例如中國(guó)專利CN200410024380. 9中所主張的瓊膠寡糖具有益生元的作用，中國(guó)專利CN03138973. 2專利中所主張的瓊膠低聚糖混合物可用作制備降血糖的藥物或者食品添加劑，中國(guó)專利CN1171592C專利中所主張的瓊膠低聚寡糖具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用以及紫外線氧化損傷保護(hù)作用等。但至今瓊膠寡糖的應(yīng)用仍然較少，影響其應(yīng)用開發(fā)的瓶頸因素主要在于制備方法。目前瓊膠寡糖的制備過程都是先從江籬、石花菜等紅藻中提取出瓊膠，然后再用化學(xué)法或酶法將瓊膠降解為分子量更小的寡糖。例如中國(guó)專利CN01115094. 7，CN021132573. 1，CN03138971.6等分別主張采用不同的化學(xué)方法降解瓊膠獲取低聚糖；中國(guó)專利CN03112515. 8，CN03112518. 2，CN200310114439. 9等主張利用天然菌或者基因工程菌所獲得的瓊膠酶制劑進(jìn)行瓊膠低聚糖的制備等。但是無論是化學(xué)法還是酶解法都存在較為嚴(yán)重的缺點(diǎn)，包括①這些方法都只能作用于瓊膠等海藻多糖，而從海藻中提取海藻多糖需經(jīng)過堿、酸反復(fù)處理和反復(fù)的水洗，造成了嚴(yán)重的污染和水資源的消耗；②酶解法需先經(jīng)過酶制劑的大規(guī)模制備，然后才能應(yīng)用于多糖的降解。但是酶制劑的制備對(duì)儀器設(shè)備的要求高，提高了生產(chǎn)成本，并使整體工藝復(fù)雜化；③目前仍然缺乏高效的瓊脂酶，導(dǎo)致瓊膠寡糖無法得到大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用；④化學(xué)法生產(chǎn)的瓊膠寡糖分子量不均一，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。目前僅有美國(guó)使用大西洋假單胞菌的瓊膠酶制備瓊膠低聚糖的產(chǎn)品，但價(jià)格昂貴，無法滿足開發(fā)和生產(chǎn)的要求。我國(guó)海藻養(yǎng)殖規(guī)模龐大，本發(fā)明所涉及的龍須菜是一種江蘺屬海藻，也是我國(guó)主要的海藻養(yǎng)殖品種之一，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要來自于提取瓊膠和作為鮑魚飼料，處于低值化利用階段。本發(fā)明采用菌株與龍須菜共培養(yǎng)的方法，利用微生物所產(chǎn)的酶系直接降解龍須菜得到瓊膠寡糖，可解決限制瓊膠寡糖應(yīng)用開發(fā)中的上述問題，實(shí)現(xiàn)龍須菜的高值化利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法。本發(fā)明的第2目的在于提供龍須菜瓊膠寡糖在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中的應(yīng)用。所述龍須菜瓊膠寡糖是利用太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2與龍須菜共培養(yǎng)，利用菌株所產(chǎn)的酶系直接降解龍須菜獲得聚合度為4 8的瓊膠寡糖，具有抗氧化、吸收紫外線等生理活性。所述太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacif ica) H2由本發(fā)明人自行分離得到，并于2012年6月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2012229,地址為中國(guó)武漢大學(xué)(郵編430072)。樣品的來源為太平洋深海5378m深處的泥樣(E157° 24' 31"，N19° 30' 30〃)。菌株的篩選分離和培養(yǎng)方法為將深海沉積物2g放入30mL含1%經(jīng)60 80目過篩的龍須菜粉末的2216E液體培養(yǎng)基中，于4°C中富集。然后將富集液稀釋1000倍，涂布于含1%經(jīng)60 80目過篩的龍須菜粉末的2216E平板上，于16°C培養(yǎng)。將得到的菌株進(jìn)一步純化保種，并進(jìn)行鑒定。本發(fā)明所述龍須菜瓊膠寡糖的制備方法如下
I)將菌株太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica) H2用活化培養(yǎng)基平板進(jìn)行活化后，接種于種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液；2)將步驟I)中得到的發(fā)酵液接種入產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩發(fā)酵培養(yǎng)后離心，收集上清液；3)采用膜過濾設(shè)備，將上清液依次用O. 45 μ m，0. 22 μ m濾膜，10000 50000D超濾膜和300 600D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖。在步驟I)中，所述活化培養(yǎng)基平板可為含經(jīng)60 80目過篩后的龍須菜粉末1%，酵母膏O. 2%，NaC13%，瓊膠粉I. 5%，蒸餾水配制，經(jīng)121°C，20min滅菌后使用；所述種子培養(yǎng)基可為含CMC-Na2O. 5% I. 5%，酵母膏O. 2%，NaC13%，蒸餾水配制，經(jīng)121°C，20min滅菌后使用；所述振蕩培養(yǎng)的條件可為在25 37°C條件下，250r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = I. O
I.5。在步驟2)中，所述產(chǎn)糖培養(yǎng)基可為含經(jīng)60 80目過篩的龍須菜粉末1% 5%，MgCl2O. 1% O. 5%，蒸餾水配制，經(jīng)121°C，20min滅菌后使用；發(fā)酵液的接種比例可為5% ;所述振蕩發(fā)酵培養(yǎng)的條件可為在25 37°C條件下，300r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 72h。在步驟3)中，所述發(fā)酵液離心的條件可為10000Xg離心15min ;所述濾膜可為卷式有機(jī)膜。本發(fā)明所述龍須菜瓊膠寡糖可在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中應(yīng)用。本發(fā)明中所述龍須菜瓊膠寡糖制備工藝的優(yōu)點(diǎn)是I.采用菌株與龍須菜共培養(yǎng)，利用菌株所產(chǎn)的酶系，一步法直接獲得瓊膠寡糖。而現(xiàn)有研究報(bào)道或?qū)＠兴雒附夥ㄖ苽涔烟蔷枰鄠€(gè)步驟，主要包括由產(chǎn)瓊膠酶菌株發(fā)酵制備瓊膠酶、由龍須菜等海藻提取瓊膠、將瓊膠酶與瓊膠進(jìn)行反應(yīng)以獲得寡糖等。本發(fā)明中的工藝具有明顯的創(chuàng)新性，且工藝簡(jiǎn)單、無污染、成本低、效率高，具有很好的實(shí)用性。2.在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中利用低濃度的MgCl2代替發(fā)酵中常用的NaCl (濃度一般在1%以上)，不僅減少對(duì)發(fā)酵設(shè)備的腐蝕，而且降低了海藻寡糖后續(xù)純化的成本。本發(fā)明中所述龍須菜瓊膠寡糖的生理活性特征為具有顯著的抗氧化性，包括對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷，和百草枯造成的果蠅死亡具有明顯的保護(hù)作用；具有很強(qiáng)的吸收短、中波紫外線的活性。在目前所公開的海藻寡糖相關(guān)專利中，CN1843325A所主張的海藻寡糖為褐藻膠寡糖，主要用于化妝品防曬、保濕的活性；CN1843153A所主張的海藻寡糖主要用于飼料添加劑；CN1593433A所主張的瓊膠寡糖作為益生元用于動(dòng)物和人體。因此，本發(fā)明中所獲得的瓊膠寡糖的活性均未見其它研究報(bào)道或?qū)＠N1843325A所主張的海藻寡糖雖然提到具有防曬活性，與紫外吸收活性相關(guān)，但該專利所述海藻寡糖為褐藻膠寡糖，并非本發(fā)明中所述瓊膠寡糖。綜上所述，本發(fā)明中所制備的瓊膠寡糖具有明顯的創(chuàng)造性和實(shí)用性。


圖I為龍須菜活性寡糖的薄層層析分析。在圖I中，M :從上到下依次為分別為Neoagarotetraose, neoagarohexaose 和 neoagarooctaose 標(biāo)準(zhǔn)品；1，2:龍須菜瓊膠寡糖。圖2為肝臟切片HE染色結(jié)果。圖3為龍須菜瓊膠寡糖全波長(zhǎng)掃描圖。在圖3中，橫坐標(biāo)是波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為絕 對(duì)強(qiáng)度Abs。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例I龍須菜瓊膠寡糖的微生物發(fā)酵法制備I)將菌株太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2用活化培養(yǎng)基(含經(jīng)60 80目過篩的龍須菜粉末1%，酵母膏O. 2%，NaCl3%,瓊膠粉I. 5%，蒸餾水配制，pH7 8，經(jīng)121°C滅菌20min后使用)進(jìn)行活化后，挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基(含CMC_Na2l%，酵母膏O. 2%，NaC13%，蒸餾水配制，pH7 8，經(jīng)121°C滅菌20min后使用)中，在30°C的條件下振蕩培養(yǎng)至 OD6tltl = 1.0;2)將發(fā)酵液按照3%的接種比例加入產(chǎn)糖培養(yǎng)基(含經(jīng)60 80目過篩的龍須菜粉末3%，MgCl2 O. 25%，蒸餾水配制，pH7 8，經(jīng)121°C滅菌20min后使用)中，繼續(xù)在30°C條件下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)48h ；3)將發(fā)酵液經(jīng)IOOOOXg離心15min，收集上清液；4)采用膜過濾設(shè)備，將上清液依次用0.4511111，0.2211111濾膜，300000超濾膜和300D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖；5)用DNS法測(cè)定寡糖濃度，于10°C以下溫度中保存。所得龍須菜瓊膠寡糖成分的薄層層析圖參見圖1，所制備的寡糖為4 8糖的混合物。以下給出所得龍須菜瓊膠寡糖抗氧化生理活性的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。I.龍須菜瓊膠寡糖對(duì)小鼠四氯化碳急性肝損傷的保護(hù)作用小鼠腹腔注射CCl4后，CCl4在肝臟中酶的催化下產(chǎn)生自由基使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化,從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性,使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶類滲入血液中，導(dǎo)致血清酶活性發(fā)生改變，同時(shí)使細(xì)胞發(fā)生氣球樣變和壞死，這一過程可選擇性的破壞小葉中央?yún)^(qū)的肝細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用健康的雄性、BALB/c小鼠，6 7周大小，體重18 20g。按隨機(jī)分組的方法將小鼠分為4組，每組3只。第I組為高劑量龍須菜瓊膠寡糖給藥組，第2組為低劑量龍須菜瓊膠寡糖給藥組，第3組為空白對(duì)照組，第4組為CCl4損傷對(duì)照組。給藥量及方法A組灌藥量為200mg/ (kg. BW)，B組灌藥量為150mg/ (kg. BW)，C、D組每日灌等量滅菌蒸餾水。各組連續(xù)灌7天，7天后對(duì)A、B、D組小鼠按lmL/kg體重的用量腹腔注射CCl4(按照2 5的比例將CCl4稀釋于液體石蠟中)，注射48h后眼球取血分離血清，解剖取肝臟進(jìn)行分析。小鼠觀察指標(biāo)的測(cè)定主要觀察指標(biāo)為小鼠體重、肝重、血清ALT含量和肝臟病理組織檢查。小鼠體重在取血前稱量，肝重在解剖后進(jìn)行稱量。血清中的ALT含量采用賴氏法進(jìn)行測(cè)定，將血清稀釋50倍左右后用ALT試劑盒測(cè)得其吸光度值；將得到的賴氏法單位換算回酶單位IU/L，在25°C條件下I卡門氏單位=0. 4821 U/L。而肝臟病理組織檢查采用 蘇木精-伊紅(HE)染色法進(jìn)行觀察，選取小鼠肝臟組織制成石蠟切片后進(jìn)行HE染色后在電鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過測(cè)量各組小鼠的體重、肝重和血清中ALT結(jié)果，得到如表I的數(shù)據(jù)表I
權(quán)利要求
1.一種龍須菜瓊膠寡糖，其特征在于所述龍須菜瓊膠寡糖是利用太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica) H2與龍須菜共培養(yǎng),利用菌株所產(chǎn)的酶系直接降解龍須菜獲得聚合度為4 8的瓊膠寡糖； 所述太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2已于2012年6月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2012229o
2.如權(quán)利要求I所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)將菌株太平洋火色桿菌(FlammeovirgaPacifica) H2用活化培養(yǎng)基平板進(jìn)行活化后，接種于種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液； 2)將步驟I)中得到的發(fā)酵液接種入產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩發(fā)酵培養(yǎng)后離心，收集上清液； 3)采用膜過濾設(shè)備，將上清液依次用O.45 μ m，0. 22 μ m濾膜，10000 50000D超濾膜和300 600D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖。
3.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述活化培養(yǎng)基平板為含經(jīng)60 80目過篩后的龍須菜粉末1%，酵母膏0.2%，NaCl 3%，瓊膠粉I. 5%，蒸餾水配制，經(jīng)121°C，20min滅菌后使用。
4.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述種子培養(yǎng)基為含CMC-Na2O. 5% I. 5%，酵母膏O. 2%, NaCl 3%，蒸餾水配制，經(jīng)121°C，20min滅菌后使用。
5.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述振蕩培養(yǎng)的條件為在25 37°C條件下，250r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = I. O I. 5。
6.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述產(chǎn)糖培養(yǎng)基為含經(jīng)60 80目過篩的龍須菜粉末1% 5%，MgCl2O. 1% O. 5%，蒸餾水配制，經(jīng)121°C，20min滅菌后使用。
7.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述發(fā)酵液的接種比例為5%。
8.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述振蕩發(fā)酵培養(yǎng)的條件為在25 37°C條件下，300r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 72h。
9.如權(quán)利要求2所述一種龍須菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述發(fā)酵液離心的條件為10000Xg離心15min ;所述濾膜可為卷式有機(jī)膜。
10.如權(quán)利要求I所述一種龍須菜瓊膠寡糖在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中的應(yīng)用。
全文摘要
一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法與應(yīng)用，涉及一種寡糖。提供一種龍須菜瓊膠寡糖及其制備方法與龍須菜瓊膠寡糖在制備抗氧化、抗紫外線保健品和化妝品中的應(yīng)用。所述龍須菜瓊膠寡糖是利用太平洋火色桿菌H2與龍須菜共培養(yǎng)，利用菌株所產(chǎn)的酶系直接降解龍須菜獲得聚合度為4～8的瓊膠寡糖，具有抗氧化、吸收紫外線等生理活性。制備時(shí)將菌株用活化培養(yǎng)基平板進(jìn)行活化后，接種于種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液，再接種入產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩發(fā)酵培養(yǎng)后離心，收集上清液，采用膜過濾設(shè)備，將上清液依次用0.45μm，0.22μm濾膜，10000～50000D超濾膜和300～600D納濾膜，所得濾出液即為龍須菜瓊膠寡糖。
文檔編號(hào)A61K8/60GK102827899SQ20121034710
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者曾潤(rùn)穎, 產(chǎn)竹華, 萬瑋, 高超 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所