一種人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明為一種人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途。由包含離體的人干細胞和生理鹽水組成的所述干細胞組合物配置成的體積為10~80ml的干細胞懸液，每份所述干細胞懸液中含有的人干細胞的數(shù)量為1~8×108個。本發(fā)明可通過靜脈注射和血管介入進行卵巢早衰或子宮疾病的治療。靜脈輸入安全可靠，操作性強，副作用小，干細胞可以通過血液循環(huán)到達細胞受損部位；血管介入療法相對于手術治療損傷小，可避免血管搭橋手術中可能出現(xiàn)的各種副損傷及并發(fā)癥，該療法起效快，可直接作用于病變部位，建立側支循環(huán)，恢復血供。
【專利說明】一種人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物用途，進一步地說，是涉及一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]卵巢和子宮是女性生殖系統(tǒng)的重要組成部分。子宮是產(chǎn)生月經(jīng)和孕育胎兒的器官，位于骨盆腔中央，在膀胱與直腸之間。卵巢是位于子宮兩側的一對卵圓形的生殖器官，位于子宮底的后外側，與盆腔側壁相接。卵巢除借助卵巢系膜固定于子宮闊韌帶外，還借卵巢懸韌帶和卵巢固有韌帶與盆腔側壁及子宮相連。卵巢有兩種主要功能:一為產(chǎn)生卵子并排卵，體現(xiàn)其生殖功能；另一為合成并分泌性激素，如雌激素、孕激素、雄激素等20多種激素和生長因子，控制著人體骨骼、免疫、生殖、神經(jīng)等九大系統(tǒng)的400多個部位，維持這些器官的青春和活力。
[0003]卵巢早衰及多種子宮疾病如子宮內膜癌、子宮炎、宮頸糜爛、子宮肌瘤這些疾病給患者帶來了很大的痛苦，現(xiàn)有技術的治療方法主要包括:
[0004]1.激素替代療法(HRT ): 口服和直接置放。
[0005]其缺點是:用量精確，長期依賴，需醫(yī)生指導用藥。
[0006]2.免疫治療:查明有抗體因素存在者可行免疫治療。
[0007]其缺點是:對其他原因所致的卵巢早衰無效。
[0008]3.手術治療主要有兩種:
[0009]I)對于因卵巢血管因素導致卵巢營養(yǎng)缺失而發(fā)生的POF者應盡前盡早行血管搭橋手術，如將卵巢動脈與腸系膜下動脈或腎動脈等吻合，恢復卵巢血管供應。
[0010]2)對于已處于POF晚期或由于各種原因導致卵巢缺如者，可行卵巢移植術。
[0011]而手術治療的缺點是:術中易發(fā)生副損傷及術后并發(fā)癥，患者痛苦較大。

【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明的目的，就是為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途。
[0013]關于本文中有關干細胞的相關術語定義如下:
[0014]1.干細胞組合物 (201210017987.9專利產(chǎn)品):為專利(201210017987.9)中提到的2-4_厚的油狀干細胞層(詳見干細胞制備過程)；
[0015]2.干細胞懸液:為該油狀干細胞層經(jīng)生理鹽水清洗及稀釋后得到的懸液，定容為10-80ml ；
[0016]3.干細胞懸液的稀釋液:由于懸液中的干細胞數(shù)量多，易吸附成團，以免靜滴時不能通過濾網(wǎng)，因此靜滴前需再用100ml的生理鹽水進一步稀釋，即干細胞懸液的稀釋液，此時的總容量為110-180ml。
[0017]注:自始至終，干細胞的數(shù)量并未發(fā)生變化，即溶質為定量，只是增加了生理鹽水的量，即溶劑為變量，因此溶液的量也隨之變化，即有了三種不同的稱呼。若不同，也只是溶液的密度不同，由于起效成分為干細胞，因此生理鹽水的多少并不會影響治療的效果。
[0018]干細胞是一類具有自我更新，高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，即這些細胞可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，被醫(yī)學界稱為“萬用細胞”。本發(fā)明就是基于干細胞具有的細胞替代作用，將干細胞植入體內后，能自動識別并移行至細胞損傷部位，然后分裂增殖成新的細胞，替代受損或病變細胞行使其功能。
[0019]干細胞移植可治療原始生殖細胞缺乏或正常卵巢生殖細胞的耗損加速而導致的特發(fā)性卵巢早衰；治療針對于卵巢血供障礙所致的卵巢萎縮，干細胞可于病變部位周圍建立側支循環(huán)，恢復卵巢血運，營養(yǎng)早衰的卵巢，并逐漸恢復其功能。
[0020]另外，治療針對于多種子宮疾病如子宮內膜癌、子宮炎、宮頸糜爛、子宮肌瘤這些疾病，由于干細胞具有增殖和定向分化的能力，當干細胞被趨化至子宮損傷局部后(如內膜基底層)，其中部分細胞分泌大量小分子物質，趨化受體干細胞，可促進細胞增殖并定向分化，完成內膜結構和功能的修復。而且干細胞能釋放多種生物活性物質，如可以釋放膜微粒，趨化并調節(jié)周圍細胞的功能活性，喚醒處于休眠期的組織細胞，促進其發(fā)揮其生物學特性；另由于其具有的免疫調節(jié)作用，可增強人體的免疫機能和修復受損的免疫系統(tǒng)，降低機體炎癥反應，從而治療各種免疫因素及感染所致的子宮疾病。
[0021]本發(fā)明的人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途是這樣實現(xiàn)的:
[0022]本發(fā)明所述干細胞組合物為用生理鹽水清洗及稀釋人造血干細胞后得到干細胞懸液，每份所述干細胞 組合物含有的人干細胞的數(shù)量為(11) XIO8個；
[0023]所述的人干細胞選自人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞、其中優(yōu)選臍帶血干細胞，即按照本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9、名稱為“一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液及干細胞分離方法”中的干細胞分離方法步驟(3)得到的“存在于整個離心管中間位置的約(2-4) mm厚的油狀干細胞層”；
[0024]每份所述干細胞組合物經(jīng)(10-80) ml生理鹽水定容后，干細胞在干細胞懸液中的個數(shù)密度為(0.125~8) X IO7個/ml。
[0025]人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰的的用途中，可以采用下列方法之一實現(xiàn):
[0026]1.靜脈輸入法:通過體表淺靜脈進行靜脈點滴注射；
[0027]2.血管介入法:血管介入的位點為一側股動脈。
[0028]其中，
[0029]1.所述的靜脈輸入法的步驟為:
[0030](I)用100ml生理鹽水稀釋干細胞懸液得到總容量為110_180ml用于靜脈輸入的干細胞懸液的稀釋液；
[0031](2)通過靜脈點滴的方法進行細胞治療:
[0032]先用0.9%的氯化鈉溶液20_30ml沖管；[0033]接著開始靜脈點滴注射輸入干細胞懸液的稀釋液，保持20-30滴/分鐘，半小時后無不良反應可增加到30-50滴/分鐘，細胞輸入過程中每15分鐘輕輕晃動裝有所述干細胞懸液的稀釋液的細胞保存袋一次；
[0034]細胞輸入完畢后用0.9%的氯化鈉溶液20ml沖入細胞保存袋中輕輕晃動，再用0.9%的氯化鈉溶液20-30ml沖凈即可將輸液器中細胞沖凈，得到的沖洗液也同樣注入患者體內，以保證細胞輸入的數(shù)量；
[0035]靜滴時將細胞液搖勻，避免細胞貼壁。
[0036]2.所述的血管介入法的步驟為:
[0037]( I)血管介入的位點為一側股動脈；
[0038](2)血管介入直接用干細胞懸液；
[0039](3)血管介入路徑為:從股動脈入路，導絲沿髂內動脈前支走行，進入子宮動脈，子宮動脈在此處分為輸卵管支和卵巢支，將導絲送入卵巢支，卵巢支又與卵巢動脈支吻合于子宮闊韌帶內，此處即為所述干細胞懸液的注入位置。
[0040]另外，人干細胞組合物在制備用于治療子宮疾病的藥物中的用途中，所述的用途采用下列方法之一實現(xiàn):
[0041]1.靜脈輸入法:通過體表淺靜脈進行靜脈點滴注射；
[0042]2.血管介入法:血管介入位點為子宮動脈與子宮動脈陰道支；
[0043]3.經(jīng)陰道后穹窿穿刺注射。
[0044]其中，
`[0045]1.所述的靜脈輸入法的步驟為:
[0046](I)用100ml生理鹽水稀釋干細胞懸液得到總容量為110_180ml用于靜脈輸入的干細胞懸液的稀釋液；
[0047](2)通過靜脈點滴的方法進行子宮疾病的治療；
[0048]先用0.9%的氯化鈉溶液20_30ml沖管，開始輸入細胞時保持20_30滴/分鐘，半小時后無不良反應可增加到30-50滴/分鐘；
[0049]細胞輸入過程中每15分鐘輕輕晃動裝有所述干細胞懸液的稀釋液的細胞保存袋一次;
[0050]細胞輸入完畢后用0.9%的氯化鈉溶液20ml沖入細胞保存袋中輕輕晃動,輸入完畢后再用0.9%的氯化鈉溶液將輸液器中細胞沖凈，得到的沖洗液也同樣注入患者體內，以保證細胞輸入數(shù)量；
[0051 ] 靜滴時將細胞液搖勻，避免細胞貼壁。
[0052]當用所述干細胞組合物用于治療子宮疾病選擇靜脈輸入治療時，由于干細胞具有增殖和定向分化的能力，當干細胞被趨化至子宮損傷局部后(如內膜基底層)，其中部分細胞分泌大量小分子物質，趨化受體干細胞，可促進細胞增殖并定向分化，完成內膜結構和功能的修復。而且干細胞能釋放多種生物活性物質，如可以釋放膜微粒，趨化并調節(jié)周圍細胞的功能活性，喚醒處于休眠期的組織細胞，促進其發(fā)揮其生物學特性；另由于其具有的免疫調節(jié)作用，可增強人體的免疫機能和修復受損的免疫系統(tǒng)，降低機體炎癥反應，從而治療各種免疫因素及感染所致的子宮疾病。同時靜脈輸入安全可靠，操作性強，副作用小，干細胞可以通過血液循環(huán)到達細胞受損部位。[0053]2.所述的血管介入法的步驟為:
[0054]( I)血管介入直接用干細胞懸液；
[0055](2)血管介入路徑為:從股動脈入路，導絲沿髂內動脈前支走行，進入子宮動脈，到達陰道上部的子宮動脈陰道支，子宮動脈與子宮動脈陰道支皆為所述干細胞懸液的注入位置。 [0056]3.所述的經(jīng)陰道后穹窿穿刺注射法的步驟為:
[0057](I)患者排空膀胱，取膀胱截石位，外陰常規(guī)消毒，鋪巾；
[0058](2)陰道檢查了解子宮、附件情況，注意陰道后穹窿是否膨隆；
[0059](3)陰道窺器充分暴露宮頸及陰道后穹窿并消毒；
[0060](4)宮頸鉗鉗夾宮頸后唇，向前提拉，充分暴露陰道后穹窿，再次消毒；
[0061](5)用22號長針頭接5~10ml注射器，在后穹窿中央距離陰道后壁與宮頸后唇交界處稍下方平行宮頸管刺入，當針穿過陰道壁，有落空感(進針深約2cm)后即可緩慢推注，注射完畢后拔出針頭，此時穿刺點如有活動性出血，可用棉球壓迫片刻；血止后取出陰道窺器。
[0062]以上所述的治療卵巢早衰或治療子宮疾病血管介入法的具體步驟還包括:
[0063]1，術前準備:局部備皮、靜脈碘過敏試驗等同一般血管造影；術前快速補液、輸血、抗休克治療；向病人家屬交代病情變化，以及介入治療的必要性，方法，療效及可能出現(xiàn)的不良反應，并在手術同意書上簽字；
[0064]2，介入操作:采用1%_2%利多卡因溶液進行局麻，手術刀片破皮l_2mm，蚊式鉗鈍式分離皮下組織；常規(guī)穿刺一側股動脈行Seldinger穿刺，具體穿刺點為腹股溝韌帶下
1.5-2.0cm處；緩慢回撤穿刺針，直至血液無阻力自針尾噴出動脈；選擇5F或6F血管鞘，將導絲沿股動脈送入，若導絲遠端走行正確，可退出穿刺針，沿導絲送入血管鞘，撤出導絲及擴張鞘管；以三通裝置抽吸血管鞘并棄去抽吸物，用肝素鹽水沖洗鞘管后備用；經(jīng)鞘管送入相應的導管，導入干細胞懸液；然后退出導管，逐層縫合股動脈及切口，縫合時注意嚴密止血；
[0065]3，術后處理:檢查各項生命體征，檢查足背動脈搏動，穿刺點需用彈性膠布或繃帶進行加壓包扎，并加沙袋壓迫，患者臥床6-24小時。補液等其他治療同一般術后處理；盡量避免應用抗生素，以免影響干細胞起效。
[0066]介入療法相對于手術治療損傷小，可避免血管搭橋手術中可能出現(xiàn)的各種副損傷及并發(fā)癥，該療法起效快，可直接作用于病變部位，建立側支循環(huán)，恢復卵巢血供。
[0067]本發(fā)明所述的人干細胞為按照本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9，名稱為“一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液及干細胞分離方法”的方法制得，即:
[0068]首先制備人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液:
[0069]所述的干細胞樣本密度分離液分別由I號液、2號液和3號液組成，按照重量百分比計，其各自組份的含量為:
[0070]I號液為稀釋劑，選自下列水溶液之一:0.1-30%氯化鈉注射液和0.1-20%的腦蛋白水解物組成的水溶液、或者0.1-30%的pH為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1%_20%的腦蛋白水解物組成的水溶液；
[0071]2號液為沉淀劑，選自0.1-30%羥乙基淀粉水溶液或0.1-30%甲基纖維素水溶液；[0072]3號液為分層液，其為密度為1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。
[0073]在實施中，
[0074]所述的腦蛋白水解物為選自下列產(chǎn)品之一:國藥準字H20052182國藥準字H20003386、國藥準字 H20003384 或國藥準字 H20003385 ；
[0075]所述的腦蛋白水解物的組分含量優(yōu)選為0.3-20% ；
[0076]所述的水溶液的水為滅菌注射用水。
[0077]更具體地說，
[0078]所述I號液的氯化鈉注射液組分含量可以為0.3-12%、優(yōu)選0.5_2%、更優(yōu)選為0.9% ；
[0079]所述I號液的磷酸鹽緩沖液的pH可以為7.1-7.4優(yōu)選7.2-7.4、更優(yōu)選為7.4 ；
[0080]所述的腦蛋白水解物組分含量可以為0.8-15%、優(yōu)選1.5-4.5%、更優(yōu)選為3% ；
[0081]所述2號液的羥乙基淀粉組分含量為0.5-18%、優(yōu)選1.5_12%、更優(yōu)選為6% ；
[0082]所述2號液的甲基纖維素組分含量為0.2-8%、優(yōu)選0.3_5%、更優(yōu)選為0.5% ；
[0083]所述3號液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為1.01-1.088g/ml、優(yōu)選L 035-1.08g/ml、更優(yōu)選為1.075g/ml。
[0084]在具體操作中，
[0085]所述的I號液在超濾條件下除菌，2~3號液可以在100_130°C、優(yōu)選105_120°C的溫度下，滅菌10-50、優(yōu)選15-20分鐘。
[0086]然后是使用上述的干細胞樣本密度分離液提取人類骨髓、臍帶血或外周血分離干細胞的分離方法，所述的方法包括:
[0087](I)將采集、抗凝后的骨髓、臍帶血或外周血樣品加入到含有I號液稀釋劑的大容量培養(yǎng)液瓶中，得到稀釋樣品；
[0088](2)在步驟(1)的稀釋樣品中加入2號液沉淀劑混勻，靜置，待分層后吸取上層細胞液離心濃縮后得到濃縮樣品；
[0089](3)將步驟(2)的濃縮樣品鋪到3號液上層，然后離心分離，得到干細胞層。
[0090]在具體操作中:
[0091]所述步驟(1)的骨髓、臍帶血或外周血樣品的采集、抗凝、稀釋均需在無菌條件下完成，其采集、抗凝方法分別為:
[0092]骨髓血采集:采用髂后上棘，局麻骨穿方法，使用采髓針采集骨髓，采集骨髓用的針管中先抽取1-1.5ml枸櫞酸鈉抗凝液,再抽取骨髓與枸櫞酸鈉抗凝液合計為5ml,依次方法采集，收集采集的骨髓注入無菌瓶中，得到骨髓血預處理樣品；
[0093]臍帶血的采集:在產(chǎn)婦胎盤脫落后，使用單包含枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋，將其采血袋上的針頭插入臍靜脈中，一邊采集一邊輕輕晃動采血袋，使抗凝液與臍帶血充分結合，得到臍帶血預處理樣品；
[0094]外周血采集:對被采血者手臂進行消毒，使用含有枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋，將采血袋上的針頭插入手臂靜脈采集過程中慢慢搖動采血袋，使抗凝液與外周血充分結合，得到外周血預處理樣品；
[0095]在所述步驟(1)中，經(jīng)采集、抗凝后的骨髓血、臍帶血或外周血預處理樣品與I號液的體積比為1:1，得到稀釋樣品；[0096]在所述的步驟(2)中，稀釋樣品與2號液的體積比為2:1，再經(jīng)過搖勻1-8分鐘，放置3分鐘-3小時，待分層后吸取上層細胞液，分裝至50ml離心管中，以500-4000轉/分鐘離心1-20分鐘，搜集下層細胞液，得到濃縮樣品；
[0097]將步驟(3)得到濃縮樣品用生理鹽水稀釋后鋪在號液3液上，以500-4000轉/分鐘離心1-60分鐘，收集存在于整個離心管中間位置的約2-4_厚的油狀干細胞層；
[0098]將收集的干細胞層用生理鹽水清洗1-5次，再用生理鹽水稀釋至臨床使用體積10-80ml 即可。
[0099]綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0100]1.臨床使用安全，內毒素< 1EU,符合國家藥典規(guī)定的注射用標準。
[0101]2.獲取的細胞懸液體積小，可按醫(yī)生的需求配成臨床治療所需劑量。
[0102]3.靜脈輸入安全可靠，操作性強，治療損傷小，副作用小，干細胞可以通過血液循環(huán)到達細胞受損部位。
[0103]4.介入療法相對于手術治療損傷小，可避免血管搭橋手術中可能出現(xiàn)的各種副損傷及并發(fā)癥，該療法起效快，可直接作用于病變部位，建立側支循環(huán)，恢復卵巢血供。
[0104]5.另外使用本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9、名稱為“一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液及干細胞分離方法”的方法制得的人造血干細胞，還具備以下優(yōu)勢
[0105](I)含有多 種細胞因子，能夠使干細胞快速準確的到達受損部位，并輔助其發(fā)揮生物學活性；
[0106](2)細胞數(shù)量大，特別是由人臍帶血分離提取的純化干細胞，每份臍帶血(80ml左右)分離出的干細胞數(shù)量皆可達到IO8以上；
[0107](3)細胞種類全，分離全部的紅細胞,血小板,血漿物質,去除部分成熟白細胞,淋巴細胞，純化有核細胞，保留所有干細胞；
[0108](4)細胞活性強，采自人體新鮮活細胞，經(jīng)分離純化后獲取干細胞。細胞活性達96%以上。
【具體實施方式】
[0109]下面結合實施例，進一步說明本發(fā)明。
[0110]實施例1
[0111]用于治療卵巢早衰或子宮疾病的干細胞懸液的制備。
[0112]無菌紗布蘸75%的酒精，擦拭所有操作過程中所需物品及操作臺。(本操作中所涉及消毒步驟皆用75%酒精的無菌紗布擦拭，以下簡稱消毒)
[0113]1，將50mL含有枸櫞酸鈉的臍帶血血袋消毒，導入50mLl號液瓶中。將5OmL 2號液全部倒入I號液瓶中，蓋緊瓶蓋，充分搖勻。將I號液瓶置于超凈臺，松動瓶蓋后靜置20-30min，待分層。12支離心管拆封，備用。
[0114]2，取3號液，消毒外壁，開蓋，用新移液管取25ml3號液置于50ml新離心管中，一共移取3次，得到3支有試劑3號液的離心管，備用。
[0115]3,取步驟I靜置20_30min后的試劑I號液瓶中的上層液,用移液管移取分別置于離心管中每只45ml,蓋緊蓋置于離心機中設置速度為2500轉時間為5分鐘溫度為5°C。從離心機中取出離心管，消毒，開蓋，棄上清液。
[0116]4，取新移液管，移取0.9%NaCl分別加入到離心管中至IOml處，搖勻，得細胞混合液備用。取步驟2下裝有3號液的離心管，緩慢加入剛剛制備的細胞混合液，保持細胞混合液懸浮于3號液表面，加至45ml，輕放至試管架，即得到3支具有分層液的離心管，置于離心機中，設置速度為1800轉，時間為30分鐘，溫度為5°C。
[0117]5，從離心機中輕取出離心管，保持液面平穩(wěn)，消毒，開蓋，用一次性膠頭滴管吸取離心管中間的絮狀液體，收集置三支新離心管中，用移液管加入0.9%NaCl至45ml處，搖勻，配平，離心，設置速度為2000轉時間為5分鐘溫度為5°C (注:第一次清洗)。
[0118]6，取出具有細胞液的離心管，消毒，開蓋，棄上清液后，用注射器先加入少量0.9%NaCl，搖勻后吸取至一支試管內，加入0.9%NaCl至45ml處，再搖勻，配平，離心，速度為1800轉，時間為5分鐘溫度為5°C (注:第二次清洗)。
[0119]7，取出具有細胞液的離心管，消毒，開蓋，棄上清液，用注射器先加入少量0.9%NaCl，搖勻后加入0.9%NaCl至45ml處，再搖勻，配平，離心，設置速度為1600轉時間為5分鐘溫度為5°C (第三次清洗)。
[0120]8，取出具有細胞液的離心管，消毒，開蓋，棄上清液后加入0.9%NaCl至所需要稀釋刻度處搖勻，用微量定量移液器取IOul用于細胞計數(shù)，其余細胞液密封，置于冰桶內待用。
[0121]實施例2
[0122]藥理實驗，臍帶血干細胞懸液的一般藥理學實驗
[0123]I 材料`
[0124]1.1動物:KM小鼠體質量18~22g，雌雄各半。健康雜種家犬，體重12~18kg，雌雄皆用。動物飼養(yǎng)于SPF級實驗動物實驗室條件下，室內溫度19~22°C，相對濕度40%~50%，給予全價顆粒飼料，自由攝食、飲水。
[0125]1.2藥物:人類臍帶血干細胞懸液，其中干細胞含量為8X IO7個/ml。
[0126]1.3上海欣曼公司SYS-G型小鼠自主活動測頻儀，美國BIOPAC公司RM-6000型多導生理記錄儀。
[0127]2試驗方法
[0128]2.1對精神神經(jīng)系統(tǒng)的影響
[0129]2.1.1對小鼠一般外觀行為的影響:取小鼠80只，隨機分為四組，每組20只，雌雄各半，給藥組分設0.5、1.0,2.0ul/kg三個劑量組，對照組給予5%葡萄糖注射液，均按
0.lml/10g體重尾靜脈注射給藥，給藥后lOmin，觀察小鼠的一般行為表現(xiàn)，步態(tài)、姿勢、肌肉緊張度、瞳孔變化、流涎、二便、皮毛等，同對照組比較，了解受試藥對動物的影響。
[0130]2.1.2對小鼠協(xié)調運動的影響:分組及給藥同前，采用傾斜板法，于給藥前及給藥后10min、30min及60min各進行一次測定，計算各組小鼠從木板上跌落的百分率，按簡化直接法統(tǒng)計。
[0131]2.1.3對小鼠自主活動的影響:小鼠80只，分組及給藥同前，于尾靜脈注射給藥后IOmin,置小鼠于自發(fā)活動測定儀中，穩(wěn)定5min后,測定IOmin內自主活動次數(shù),用組間t檢驗進行統(tǒng)計處理。
[0132]2.2對呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的影響[0133]家犬6只，雌雄各半，用戊巴比妥鈉30mg/kg，靜脈注射麻醉后，背位固定，分離右頸總動脈，插管連接TP-101型壓力轉換能以多導生理記錄儀記錄收縮壓，舒張壓及平均動脈壓；以針形電極刺入四肢皮下記錄II導聯(lián)心電圖，以立位轉換能器連接胸骨記錄呼吸頻率及幅度。實驗設0.5、1.0,2.0ul/kg三個劑量組，對照組用5%葡萄糖注射液，給藥容積為lml/kg，由股靜脈插管給藥，注射速度為30s，分別在靜脈注射給藥后1、2、5、10、15、20及30min時記錄上述各項指標,觀察臍帶血干細胞懸液對呼吸,心電及血壓的作用，用t檢驗法進行用藥前后顯著性檢驗分析。
[0134]3 結論
[0135]3.1對小鼠一般行為表現(xiàn)的影響:實驗各組動物在用藥后60min內的一般行為，步態(tài)、肌緊張度、活動、飲食、皮毛及二便，均無顯著變化，未見有瞳孔大小改變，豎毛、倦伏、流涎等異常癥狀，同對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
[0136]3.2對協(xié)調運動的影響:各組動物于給藥前及給藥后各觀測點的跌落率均為0，表明在實驗所用0.5,1.0,2.0ul/kg劑量下對小鼠協(xié)調運動無明顯影響。
[0137]3.3對小鼠自主活動的影響:臍帶血干細胞懸液各劑量組對小鼠自主活動的影響見表1。
[0138]表1對小鼠自主活動的影響
【權利要求】
1.一種人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于: 所述干細胞組合物為用生理鹽水清洗及稀釋人干細胞后得到干細胞懸液，每份所述干細胞組合物含有的人干細胞的數(shù)量為(f 8) X IO8個； 所述的人干細胞選自人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞，即按照本 申請人:的申請?zhí)枮?01210017987.9、名稱為“一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細胞樣本密度分離液及干細胞分離方法”中的干細胞分離方法步驟(3 )得到的“存在于整個離心管中間位置的約(2-4) _厚的油狀干細胞層”； 每份所述干細胞組合物經(jīng)(10-80) ml生理鹽水定容后，干細胞在干細胞懸液中的個數(shù)密度為(0.125~8) X IO7 個/ml。
2.根據(jù)權利要求1所述的在制備用于治療卵巢早衰的藥物中的用途，其特征在于，所述的用途采用下列方法之一實現(xiàn): 1.靜脈輸入法:通過體表淺靜脈進行靜脈點滴注射； 2.血管介入法:血管介入的位點為一側股動脈。
3.根據(jù)權利要求2所述的在制備用于治療卵巢早衰的藥物中的用途，其特征在于，所述的靜脈輸入法的步驟為: (1)用100ml生理鹽水稀釋干細胞懸液得到總容量為IlO-1SOml用于靜脈輸入的干細胞懸液的稀釋液； (2)通過靜脈點滴的方法進 行 細胞治療: 先用0.9%的氯化鈉溶液20-30ml沖管； 接著開始靜脈點滴注射輸入干細胞懸液的稀釋液，保持20-30滴/分鐘，半小時后無不良反應可增加到30-50滴/分鐘，細胞輸入過程中每15分鐘輕輕晃動裝有所述干細胞懸液的稀釋液的細胞保存袋一次； 細胞輸入完畢后用0.9%的氯化鈉溶液20ml沖入細胞保存袋中輕輕晃動，再用0.9%的氯化鈉溶液20-30ml沖凈即可將輸液器中細胞沖凈，得到的沖洗液也同樣注入患者體內，以保證細胞輸入的數(shù)量； 靜滴時將細胞液搖勻，避免細胞貼壁。
4.根據(jù)權利要求2所述的在制備用于治療卵巢早衰的藥物中的用途，其特征在于，所述的血管介入法的步驟為: (1)血管介入的位點為一側股動脈； (2)血管介入直接用干細胞懸液； (3)血管介入路徑為:從股動脈入路，導絲沿髂內動脈前支走行，進入子宮動脈，子宮動脈在此處分為輸卵管支和卵巢支，將導絲送入卵巢支，卵巢支又與卵巢動脈支吻合于子宮闊韌帶內，此處即為所述干細胞懸液的注入位置。
5.根據(jù)權利要求1所述的在制備用于治療子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于，所述的用途采用下列方法之一實現(xiàn): ，1.靜脈輸入法:通過體表淺靜脈進行靜脈點滴注射； ，2.血管介入法:血管介入位點為子宮動脈與子宮動脈陰道支； ， 3.經(jīng)陰道后穹窿穿刺注射。
6.根據(jù)權利要求5所述的在制備用于治療子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于，所述的靜脈輸入法的步驟為: (1)用100ml生理鹽水稀釋干細胞懸液得到總容量為IlO-1SOml用于靜脈輸入的干細胞懸液的稀釋液； (2)通過靜脈點滴的方法進行子宮疾病的治療； 先用0.9%的氯化鈉溶液20-30ml沖管，開始輸入細胞時保持20-30滴/分鐘，半小時后無不良反應可增加到30-50滴/分鐘； 細胞輸入過程中每15分鐘輕輕晃動裝有所述干細胞懸液的稀釋液的細胞保存袋一次； 細胞輸入完畢后用0.9%的氯化鈉溶液20ml沖入細胞保存袋中輕輕晃動，輸入完畢后再用0.9%的氯化鈉溶液將輸液器中細胞沖凈，得到的沖洗液也同樣注入患者體內，以保證細胞輸入數(shù)量； 靜滴時將細胞液搖勻，避免細胞貼壁。
7.根據(jù)權利要求5所述的在制備用于治療子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于，所述的血管介入法的步驟包括: (1)血管介入直接用干細胞懸液； (2)血管介入路徑為:從股動脈入路，導絲沿髂內動脈前支走行，進入子宮動脈，到達陰道上部的子宮動脈陰道支，子宮動脈與子宮動脈陰道支皆為所述干細胞懸液的注入位置。
8.根據(jù)權利要求2或5所述的在制備用于治療卵巢早衰或治療子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于，所述的血管介入法的步驟還包括: 1，術前準備:局部備皮、靜脈碘過敏試驗等同一般血管造影；術前快速補液、輸血、抗休克治療；向病人家屬交代病情變化，以及介入治療的必要性，方法，療效及可能出現(xiàn)的不良反應，并在手術同意書上簽字； 2，介入操作:采用1%_2%利多卡因溶液進行局麻，手術刀片破皮l_2mm，蚊式鉗鈍式分離皮下組織；常規(guī)穿刺一側股動脈行Seldinger穿刺，具體穿刺點為腹股溝韌帶下1.5-2.0cm處；緩慢回撤穿刺針，直至血液無阻力自針尾噴出動脈；選擇5F或6F血管鞘，將導絲沿股動脈送入，若導絲遠端走行正確，可退出穿刺針，沿導絲送入血管鞘，撤出導絲及擴張鞘管；以三通裝置抽吸血管鞘并棄去抽吸物，用肝素鹽水沖洗鞘管后備用；經(jīng)鞘管送入相應的導管，導入干細胞懸液；然后退出導管，逐層縫合股動脈及切口，縫合時注意嚴密止血； 3，術后處理:檢查各項生命體征，檢查足背動脈搏動，穿刺點需用彈性膠布或繃帶進行加壓包扎，并加沙袋壓迫，患者臥床6-24小時；補液等其他治療同一般術后處理；盡量避免應用抗生素，以免影響干細胞起效。
9.根據(jù)權利要求5所述的在制備用于治療子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于，所述的經(jīng)陰道后穹窿穿刺注射法的步驟為: (1)患者排空膀胱，取膀胱截石位，外陰常規(guī)消毒，鋪巾； (2)陰道檢查了解子宮、附件情況，注意陰道后穹窿是否膨隆； (3)陰道窺器充分暴露宮頸及陰道后穹窿并消毒； (4)宮頸鉗鉗夾宮頸后唇，向前提拉，充分暴露陰道后穹窿，再次消毒；(5)用22號長針頭接5~10ml注射器，在后穹窿中央距離陰道后壁與宮頸后唇交界處稍下方平行宮頸管刺入，當針穿過陰道壁，有落空感后即可緩慢推注，注射完畢后拔出針頭，此時穿刺點如有活動性出血，可用棉球壓迫片刻；血止后取出陰道窺器。
10.根據(jù)權利要求1~7之一或9的人干細胞組合物在制備用于治療卵巢早衰或子宮疾病的藥物中的用途，其特征在于: 所述的人干細胞為人類臍帶血干細胞； 所述的用途采用靜 脈輸入法方法實現(xiàn)。
【文檔編號】A61P15/08GK103655615SQ201210332713
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權日:2012年9月10日
【發(fā)明者】唐明淇 申請人:唐明淇