Cd38酶抑制劑在治療氣道高反應(yīng)性疾病中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種治療氣道高反應(yīng)性疾病的藥物，5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1H-3-吲哚甲酰胺。該藥物是一種CD38酶抑制劑，可通過抑制Ca2+釋放舒張氣管平滑肌，對癥治療氣道高反應(yīng)性疾??；我們利用臭氧制作小鼠氣道高反應(yīng)模型，同時(shí)給予該藥物的乳化劑灌胃治療，發(fā)現(xiàn)經(jīng)該藥物治療的小鼠氣道阻力明顯降低、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性明顯增加、肺病變程度減輕；另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該藥物還具有抗炎、抗氧化作用，未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，具有良好地開發(fā)價(jià)值，屬于藥物領(lǐng)域。
【專利說明】CD38酶抑制劑在治療氣道高反應(yīng)性疾病中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種治療氣道高反應(yīng)性疾病的藥物，5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1H-3-吲哚甲酰胺。該藥物是一種CD38酶抑制劑，主要通過擴(kuò)張氣管平滑肌達(dá)到治療目的，同時(shí)具有抗炎、抗氧化作用，屬于藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002]氣道高反應(yīng)性是指氣管、支氣管本身對各種刺激，包括特異性抗原刺激和非特異性刺激，如物理、化學(xué)刺激，呈現(xiàn)過度反應(yīng)，是支氣管哮喘病人區(qū)別于正常人的重要特征[1]。雖然氣道高反應(yīng)的誘發(fā)因素多種多樣，而各種藥物的治療作用環(huán)節(jié)各不相同，新療法的研究亦呈多方向性，但基本上從抗炎、抗組胺藥、過敏反應(yīng)介質(zhì)阻釋劑、相應(yīng)對癥[2]和中醫(yī)藥治療M出發(fā)。目前，研究者使用較多的氣道高反應(yīng)模型為卵蛋白(OVA)致敏的大、小鼠模型，但該造模方法的不足之處是造模時(shí)間長、成功率不高且操作復(fù)雜。由于工業(yè)和汽車廢氣的影響，尤其在大城市周圍農(nóng)林地區(qū)，地表臭氧會(huì)形成和聚集。地表臭氧對人體，尤其是對眼睛，呼吸道等有侵蝕和損害作用。國內(nèi)外有很多研究者從臭氧對人與動(dòng)物的損害及環(huán)境保護(hù)角度對臭氧進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)臭氧不僅能加重呼吸系統(tǒng)疾病，還發(fā)現(xiàn)空氣污染物中的臭氧與哮喘發(fā)作直接相關(guān)早在2001年，國內(nèi)就有研究者利用臭氧攻擊原代培養(yǎng)的兔支氣管上皮細(xì)胞，觀察支氣管上皮細(xì)胞的抗氧化活性[8]。湖南師范大學(xué)的張堅(jiān)松等[9]利用臭氧制作大鼠氣道高反應(yīng)模型，并與卵蛋白(OVA)致敏的大鼠模型比較，發(fā)現(xiàn)臭氧吸入制備非變異性氣道高反應(yīng)性大鼠模型的方法簡易并可行。該課題組最新研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)地塞米松治療后，臭氧造模的大鼠氣道粘液分泌明顯減少、氣道上皮粘液儲(chǔ)備指數(shù)和杯狀細(xì)胞化生指數(shù)有顯著下降_。0038分子表達(dá)與分布相當(dāng)廣泛，主要表達(dá)在不成熟的造血細(xì)胞和活化的淋巴樣細(xì)胞，在骨骼肌、心肌、氣道平滑肌和子宮平滑肌⑶38分子也有表達(dá)。通過⑶38分子的酶催化作用生成的環(huán)腺 苷二磷酸核糖(cyclic adenosine diphosphate ribose,cADPR)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放而調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮[11_13]。氣道平滑肌的收縮能力主要依靠于平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，CD38分子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度進(jìn)而影響氣道平滑肌的收縮，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起到很重要的作用[14]。發(fā)明人合成了兩種CD38酶抑制劑，做成乳化劑，灌胃治療臭氧引起的氣道高反應(yīng)小鼠模型，進(jìn)行藥理學(xué)研究，完成了本發(fā)明。
[0003]# [l]Qin XQiXiang Y, Liu C，et al.The role of bronchial epithelial cellsin airway hyperresponsiveness.Acta Physiologica Sinica，2007，59 (4):454-464.[0004]# [2]Marone G.Asthma:recent advances.1mmunol Today，1998，19(I):5_9.[0005].[3]曾嶸，黃仁彬.中藥平喘機(jī)制的研究進(jìn)展.中國醫(yī)學(xué)文摘.內(nèi)科學(xué)，2005，26(6):736-739.[0006]# [4]Schelegle ES，Walby WF.Vagal afferents contribute to exacerbatedairway responses following ozone and allergen challenge.Respir PhysiolNeurobiol.2012，181 (3):277-85.[0007]# [5]Kesic MJ, Meyer M，Bauer R，Jaspers 1.Exposure to ozone modulateshuman airway protease/antiprotease balance contributing to increased influenzaA infection.PLoS One.2012,7 (4):e35108.[0008]# [6]Sheffield PE, Knowlton K，Carr JL, Kinney PL.Modeling of regionalclimate change effects on ground-level ozone and childhood asthma.Am J PrevMed.2011,41 (3):251-7.[0009]# [7]Glad JA, Brink LL, Talbott E0, Lee PC，Xu X，Saul M，Rager J.Therelationship of ambient ozone and PM(2.5)levels and asthma emergency departmentvisits !possible influence of gender and ethnicity.Arch Environ OccupHealth.2012,67(2):103-8.[0010].[8]秦曉群，向陽，管荼香，等.整合素配體結(jié)合反應(yīng)上調(diào)兔支氣管上皮細(xì)胞抗氧化能力[J].生理學(xué)報(bào)，2001，53 (I):41-44.[0011].[9]李翔，王笑梅，張堅(jiān)松。兩種氣道高反應(yīng)大鼠模型的建立與比較.湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，6 (I):17-22
[0012].[10]熊本強(qiáng)，李翔，李喜兵，陳秋霞，張堅(jiān)松，水通道蛋白I對氣道高反應(yīng)大鼠粘液高分泌的影響。湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，9(1):6-10
[0013]# [II]Dogan S，Deshpande DA，Kannan MS.Changes in CD38expression andADP-ribosyl cyclase activity in rat myometrium during Pregnancy !influence ofsex steroid hormones.Biol Reprod，2004，71(I)97-103.[0014]# [12]Deshpande DA，Dogan S, Walseth TF，et al.Modulation of calciumsignaling by interleakin IL_13in human airway smooth muscle:role of CD38/eyclicadenosine diphosphate ribose pathway.Am J Respir Cell Mol Bio，2004，31 (I):36-42.[0015]# [13] Takahashi J，KagayaY, Kato I，et al.Deficit of CD38/cyclicADP—ribose is differentially compensated in hearts by gender.Biochem BiophysRes Commun.2003，312(2):434-440.[0016]# [14]Deshpande DA, White TA， Dogan S， et al.CD38/cyclic ADP-ribosesignaling:role in the regulation of calcium homeostasis in airway smoothmuscle.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288 (5):L773_788.
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0017]本發(fā)明目的是研究兩種⑶38酶抑制劑[3-氨基甲?；?1- ((2- (3_苯氧基苯氧基)乙氧基)甲基)吡啶與5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺]，用于治療氣道高反應(yīng)性疾病。
[0018]發(fā)明人以已知的CD38晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，釆用逐級(jí)篩選的策略對商用小分子數(shù)據(jù)庫(Sigma和Maybridge)進(jìn)行了虛擬篩選。得到的化合物在充分考慮結(jié)合模式的合理性和結(jié)構(gòu)多樣性的基礎(chǔ)上，購買其中23個(gè)化合物，進(jìn)行了 CD38NADase抑制活性測試。根據(jù)活性測試的結(jié)果以及結(jié)構(gòu)新穎性、合成難度、可衍生性等因素，選定先導(dǎo)物。通過對先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)的多次改造和活性測試，最終得到兩種CD38酶抑制劑。
[0019]發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，5-(3-苯基丙酰氨基)-N_(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺除了能通過抑制CD38酶活性，擴(kuò)張氣管平滑肌對癥治療氣道高反應(yīng)性疾病之外，還具有抗炎、抗氧化活性。在本發(fā)明當(dāng)中，通過使用臭氧制作的小鼠氣道高反應(yīng)模型，發(fā)明人研究了這兩種CD38酶抑制劑的藥理作用，發(fā)現(xiàn)其中的一種化合物5-(3-苯基丙酰氨基)-N- (4-乙氧羰基苯基)-1H-3-吲哚甲酰胺能夠明顯降低小鼠氣道阻力、增加動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性、減輕肺病變程度；另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該藥物還具有抗炎、抗氧化作用，未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。
[0020]本發(fā)明藥物為淡黃白色粉末，熔點(diǎn)192-194?，溶于DMF、丙酮，微溶于甲醇、二氯甲烷，不溶于水，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿存在下分解。本發(fā)明藥物還可以含有臨床上適用的藥物賦型劑。其劑型可以是適用于臨床的各種常規(guī)劑型，例如丸劑、片劑、散劑、口服液體制劑、注射劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0021]圖1:化合物T的結(jié)構(gòu)式；
[0022]圖2:BALF中白細(xì)胞數(shù)；
[0023]*P < 0.05 vs 正常對照組 # P < 0.05 VS模型組
[0024]P = 0.090 VS 模型組P = 0.068 VS 模型組(η = 9 ~10)
[0025]圖3 =BALF 中 MDA 含量；
[0026]*Ρ < 0.01 vs 正常對照組 # P < 0.01 VS 模型組(η = 9 ~10) [0027]圖4:各組小鼠肺臟病理切片的HE染色圖(X 100倍)；
[0028]圖5:各組小鼠肺臟病理切片的HE染色圖(Χ400倍)。
【具體實(shí)施方式】:
[0029]實(shí)施例一:化合物T [5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)_1Η_3_吲哚甲酰胺]的理化性質(zhì)
[0030]化合物T的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，分子量為455.51，淡黃白色粉末，熔點(diǎn)192_194°C，溶于DMF、丙酮，微溶于甲醇、二氯甲烷，不溶于水，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿存在下分解。其溶解度與酸堿穩(wěn)定性可通過以下實(shí)驗(yàn)證明。
[0031]1、溶解度測試
[0032]目的:測試化合物T在不同溶劑中的溶解性
[0033]原理:當(dāng)20°C時(shí)，100g溶劑中的溶解的溶劑的量為I~IOg為可溶，0.01g-1g為微溶，0.01g以下為難溶。向定量樣品中加入一定量溶劑，觀察溶解情況。
[0034]方法:取2mg樣品，加入溶劑震蕩，澄清透明無固體視為完全溶解。
[0035]微溶與可溶的分界線為2mg樣品能否溶于200mg溶劑中，不溶與微溶的區(qū)分為2mg樣品能否溶于少于20g溶劑中。因此，向2mg樣品中從小到大加入200mg、2g、20g溶劑直至溶解，觀察溶解情況，記錄下樣品的溶解區(qū)間。
[0036]結(jié)果:2mg樣品在200mg甲醇中的溶解情況為:不能完全溶解；2mg樣品在200mg甲醇中的溶解情況為:完全溶解；2mg樣品在200mg 二氯甲烷中的溶解情況為:不能完全溶解；2mg樣品在2g 二氣甲燒中的溶解情況為:完全溶解；2mg樣品在200mg丙麗中的溶解情況為:完全溶解；2mg樣品在200mg乙酸乙酷中的溶解情況為:不能完全溶解；2mg樣品在2g乙酸乙酯中的溶解情況為:完全溶解；2mg樣品在200mg N, N-二甲基甲酰胺中的溶解情況為:完全溶解；2mg樣品在20g水中的溶解情況為:不完全溶解。
[0037]結(jié)論:化合物T溶于N，N- 二甲基甲酰胺、丙酮，微溶于甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯，不溶于水。
[0038]2、酸堿穩(wěn)定性測試
[0039]目的:測試化合物T對酸堿條件的穩(wěn)定性。
[0040]原理:化合物T若在酸堿性條件下分解，薄板展開時(shí)可以觀察到多個(gè)斑點(diǎn)。
[0041]方法:將6mg樣品溶于1200 μ I丙酮中，加入400 μ I水混合均勻配成樣液。根據(jù)溫度和酸堿性，分成6組，即室溫酸、堿、對照組和60°C酸、堿、對照組，每組加入200
[0042]μ I樣液和400 μ I丙酮。酸組分別加入200 μ I IN鹽酸，堿組分別加入200 μ 120%NaOH溶液，對照組則分別加入200 μ I水。室溫酸、堿、對照組置于室溫(25°C )下I小時(shí)，60°C酸、堿、對照組置于60°C水浴中下I小時(shí)，點(diǎn)板，以40: I 二氯甲烷-甲醇體系展開。
[0043]結(jié)果:從點(diǎn)板展開情況來看，與室溫對照組相比，室溫酸組和室溫堿組在原點(diǎn)處有明顯分解斑點(diǎn)；與60°C對照組相比，60°C酸組和60°C堿組在原點(diǎn)處有明顯分解斑點(diǎn)。
[0044]結(jié)論:化合物T在室溫與60°C條件下均對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿不穩(wěn)定。
[0045]實(shí)施 例二:兩種CD38酶抑制劑在小鼠氣道高反應(yīng)性疾病模型中的藥效學(xué)評(píng)價(jià)
[0046]實(shí)驗(yàn)材料:30g左右成年雄性昆明小鼠(清潔級(jí))，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)；乙酰甲膽堿(MCH，美國Sigma公司)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；化合物H[3_氨基甲酸基_1_ ((2-(3-苯氧基苯氧基)乙氧基)甲基)吡唳];化合物T [5-(3-苯基丙酸氨基)N-(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺]。
[0047]實(shí)驗(yàn)方法:
[0048]1、購買30g左右成年雄性KM小鼠約68只，造模前一天稱重，除去體重過輕或過重小鼠，只保留60只，隨機(jī)分成6組:正常對照組、模型組、激素組、美普清組、化合物H治療組與化合物T治療組；除正常對照組外，各組需臭氧造模，方法為每天下午臭氧攻擊lOmin，連續(xù)5天，第六天測數(shù)據(jù)、取樣本(實(shí)驗(yàn)前后稱取小鼠體重，計(jì)算體重變化)；給藥方案:正常對照組與模型組給予含羧甲基纖維素鈉(0.5% )與植物油)的乳化劑；激素組為含
0.lmg/ml激素的乳化劑，丙卡特羅組為含7.5ug/ml丙卡特羅的乳化劑；化合物H治療組與化合物T治療組分別為5mg/ml，6mg/ml的乳化劑；每天上午、晚上給藥，每只小鼠每次給予
0.2ml，連續(xù)5天；第六天早上追加灌胃一次。
[0049]2、第六天用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，使用AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測量小鼠氣道功能，所用工具藥為預(yù)冷的濃度梯度為120ug/ml，240ug/ml，480ug/ml，960ug/ml，
1.92mg/ml的乙酰甲膽堿；測量完畢，將小鼠左側(cè)肺主支氣管結(jié)扎，右側(cè)肺用PBS灌洗回收支氣管肺灌洗液(BALF)，然后剪取左側(cè)肺，每組前5只用4%多聚甲醛保存(用于肺病理功片)，后5只于-80度冰箱冷凍保存；于小鼠眼眶取血，抗凝保存(用于血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞計(jì)數(shù))。
[0050]3、將BALF在1500r/min*5min條件下離心,沉淀用于白細(xì)胞計(jì)數(shù),上清液用于測量丙二醛(MDA)。[0051]結(jié)果與討論:
[0052]1、就實(shí)驗(yàn)前后5天內(nèi)小鼠體重變化而言，與正常對照組相比，模型組小鼠體重明顯減輕；其它各組與模型組相比，激素組小鼠體重減輕更加明顯，而包括T化合物組在內(nèi)的各組小鼠體重變化與模型組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明臭氧造模引起小鼠體重降低，該濃度的激素治療在臭氧造模的情況下會(huì)進(jìn)一步降低小鼠體重，具有明顯毒性，而包括T化合物治療在內(nèi)的其它藥物未發(fā)現(xiàn)此全身毒性。
[0053]2、從血液中白細(xì)胞與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)來看，各組之間比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與正常對照組相比，激素組有降低血液中白細(xì)胞與紅細(xì)胞數(shù)量的趨勢(P值分別為0.087與
0.067)，說明該濃度的激素治療有一定的血液毒性，而包括T化合物治療在內(nèi)的其它藥物未發(fā)現(xiàn)血液毒性。
[0054]3、分析支氣管肺灌洗液(BALF)的白細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖2所示，臭氧造模能明顯增加BALF中白細(xì)胞數(shù)，說明臭氧造模引起了小鼠氣管與肺局部炎癥反應(yīng)；其它各組與模型組相比，激素組與H化合物組BALF中白細(xì)胞數(shù)量明顯降低，美普清組與T化合物組的白細(xì)胞數(shù)量有降低的趨勢(P值分別為0.090與0.068)，說明激素與H化合物治療能明顯減輕臭氧造模引起的小鼠氣管與肺局部炎癥反應(yīng)，美普清與T化合物治療能一定程度減輕臭氧造模引起了小鼠氣管與肺局部炎癥反應(yīng)。
[0055]4、分析支氣管肺灌洗液(BALF)的丙二醛(MDA)含量，結(jié)果如圖3所示，臭氧造模能明顯增加BALF中的MDA含量；其它各組與模型組相比，激素組、美普清組與T化合物組BALF中的MDA含量明顯降低 ，H化合物組與模型組的MDA含量無明顯差別。MDA為多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物，機(jī)體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并由此形成脂質(zhì)過氧化物，使組織細(xì)胞受損傷，MDA是一個(gè)重要的氧化損傷指標(biāo)。因此，臭氧造模引起了小鼠氣管與肺局部氧化損傷，激素、美普清與T化合物治療能明顯減輕臭氧造模引起的小鼠氣管與肺局部氧化損傷，而H化合物治療無此藥理作用。
[0056]5、測得每只小鼠在六種不同狀態(tài)下(基礎(chǔ)狀態(tài)，120ug/ml、240ug/ml、480ug/ml、960ug/ml與1.92mg/ml的乙酰甲膽堿激發(fā)狀態(tài))的氣道阻力(RL)值(分別設(shè)為
X3，X4與X5)，然后設(shè)每只小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下的氣道阻力為1，把四種不同濃度Mch激發(fā)狀態(tài)下的氣道阻力值分別除以該只小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下的氣道阻力值，得五個(gè)相對值(即為Xi/X。、X2/XQ、X3/X0> X4/X0和X5/%)，即為RL比值；然后求各組小鼠對應(yīng)六種狀態(tài)下RL比值的平均值；然后以這六種狀態(tài)為橫坐標(biāo)，氣道阻力的RL比值的平均值為縱坐標(biāo)，每組小鼠劃一條連續(xù)的曲線，然后比較這些曲線的升高趨勢，升高幅度越大，表示小鼠對Mch的反應(yīng)越明顯，氣道反應(yīng)性越高。結(jié)果如表1所示，與正常對照組相比，模型組呈現(xiàn)明顯地氣道高反應(yīng)性，其它各組與模型組比較，美普清組與T化合物組氣道阻力明顯降低，而激素組與H化合物組氣道阻力總體接近于模型組。說明T化合物具有與美普清類似地降低臭氧攻擊所導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)性的作用，而激素與H化合物治療無明顯作用。
[0057]表1:各組小鼠在不同激發(fā)狀態(tài)下的RL比值CY± s)
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療氣道高反應(yīng)性疾病的藥物，中文名:5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺；類別:5_取代丙酰氨基-N-取代苯基-1H-3-吲哚甲酰胺類。
2.按照權(quán)利I所述的治療氣道高反應(yīng)性疾病的藥物，其特征是一種CD38酶抑制劑。
3.按權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于該化合物是CD38的非共價(jià)類抑制劑、吲哚雜環(huán)類小分子抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK103655557SQ201210332689
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月11日
【發(fā)明者】蒲小平, 張亮仁, 鄧政, 朱志鵬 申請人:北京大學(xué)